馬蘭花，顧亞榮，張永峰，潘和平，閻 萍 (1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所 甘肅省牦牛繁育工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030)

牦牛生活在海拔3 000 m以上的高寒地區(qū)，作為高原上寶貴的生物遺傳資源和財(cái)富，這是高原藏區(qū)的文化符號(hào)之一，具有極高的研究和開發(fā)價(jià)值[1]。牦牛在食物來源及種類匱乏、自然氣候條件惡劣的高海拔高原生態(tài)環(huán)境中表現(xiàn)出極強(qiáng)的適應(yīng)性,利用牦牛這種生物特性開展牦牛遺傳資源保護(hù)與開發(fā)利用，對(duì)促進(jìn)藏區(qū)經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值具有十分重要的發(fā)展意義[2]。青海省大通牦牛是通過傳統(tǒng)的雜交手段培育的首個(gè)肉用型牦牛新品種[3],擁有肉質(zhì)鮮美、高蛋白、低脂肪等特點(diǎn)[4-5],在長(zhǎng)期自然選擇過程中,其脂肪發(fā)育脂質(zhì)沉積的調(diào)控在品種和組織中具有明顯的特異性[6],但牦牛生長(zhǎng)緩慢,脂肪沉積效率低、嫩度差、口感粗糙，影響牦牛的肉用價(jià)值[7]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,從分子水平研究生物效應(yīng)中的基礎(chǔ)作用關(guān)系,有利于運(yùn)用遺傳學(xué)手段來改善生物表觀遺傳水平,使生物表型朝著生態(tài)/經(jīng)濟(jì)雙重價(jià)值的方向發(fā)展[8]。

N6-腺苷酸甲基(N6-methyladenosine,m6A)是RNA分子上特定腺嘌呤N6位置上的CH3基團(tuán)，是真核生物中最常見的一種動(dòng)態(tài)可逆的轉(zhuǎn)錄后修飾。甲基化酶樣蛋白14(methyltransferase-like protein 14,METTL14)作為m6A甲基化過程中底物結(jié)合平臺(tái),與甲基化酶樣蛋白3(methyltransferase-like protein 3,METTL3)形成穩(wěn)定的復(fù)合物[9],激活并增強(qiáng)METTL3的催化活性。復(fù)合物被腎母細(xì)胞瘤1相關(guān)蛋白(Wilms tumor 1 associated protein,WTAP)間接定位在核斑點(diǎn)上,S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)作為甲基供體,在METTL3和METTL14甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，將甲基轉(zhuǎn)移到腺苷(A)堿基第6位的氮上，形成N6-甲基腺苷(m6A)。另外，METTL16、KIA也是甲基轉(zhuǎn)移酶的組分之一,協(xié)同作用于甲基化過程[10-11]。m6A結(jié)合蛋白可以識(shí)別甲基化修飾，影響mRNA的命運(yùn)。m6A結(jié)合蛋白主要包括YTH結(jié)構(gòu)域蛋白家族YTHDF1-3、YTHDC1-2等，還有部分hnRNA蛋白家族，比如hnRNA2B1等[12]。與甲基化酶具有逆向作用的去甲基化酶，肥胖相關(guān)蛋白(fat mass and obesity associated protein，F(xiàn)TO)和ALKBH同源蛋白5(Alk B homologue 5，ALKBH5)，能對(duì)已發(fā)生m6A修飾的堿基進(jìn)行去甲基化修飾[13]。甲基化和去甲基化是由各自酶作用的可逆化學(xué)過程，用于動(dòng)態(tài)平衡m6A的活性。

METTL14是m6A 的核心酶之一，與METTL3形成異質(zhì)二聚體[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，METTL14可能在多種細(xì)胞分化發(fā)育過程中起到?jīng)Q定細(xì)胞命運(yùn)的作用。沉默處理METTL3和 METTL14可抑制小鼠胚胎干細(xì)胞的自我更新[15]。在晚期精原細(xì)胞分裂過程中，METTL3和METTL14 2個(gè)基因聯(lián)合缺失會(huì)破壞精子發(fā)生[16]。然而，點(diǎn)突變METTL14 和METTL3活性中心的關(guān)鍵氨基酸，發(fā)現(xiàn)METTL3突變后會(huì)導(dǎo)致異質(zhì)二聚體的活性降低，而METTL14活性并沒有明顯的改變，說明METTL14是異質(zhì)二聚體的非催化亞基，其在甲基化過程中具有特異性功能。在小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞分化過程中，METTL14表達(dá)量逐漸降低，表明m6A修飾與睪丸激素合成過程中睪丸間質(zhì)細(xì)胞的自噬之間存在負(fù)相關(guān)，在睪丸間質(zhì)細(xì)胞啟始階段METTL14表達(dá)量最高[17]。缺少M(fèi)ETTL14的小鼠Treg細(xì)胞(功能調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)的轉(zhuǎn)錄因子RORγt表達(dá)降低，表明METTL14缺乏會(huì)導(dǎo)致Treg細(xì)胞的誘導(dǎo)分化受損[18]。敲除小鼠胚胎大腦皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞中的METTL14，皮質(zhì)神經(jīng)發(fā)生會(huì)遲緩到出生后階段，膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞周期也會(huì)延長(zhǎng)[19]。m6A修飾在哺乳動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞分化中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，WTAP/METTL3/METTL14復(fù)合物通過促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂周期轉(zhuǎn)變積極調(diào)控脂肪發(fā)生，敲除這3個(gè)基因會(huì)使細(xì)胞周期蛋白A2上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞周期停止，影響脂肪細(xì)胞分化[20]。對(duì)豬脂肪細(xì)胞早期增殖分化與脂質(zhì)代謝能力的研究發(fā)現(xiàn)，過量的支鏈氨基酸(branched-chain amino acids，BCAA)能使豬前體脂肪細(xì)胞中METTL14下調(diào)，從而通過m6A RNA甲基化修飾的方式抑制脂質(zhì)代謝的過程[21]。熱應(yīng)激時(shí)脂肪細(xì)胞大量從血液中攝取甘油三酯并沉積在脂肪組織中，此時(shí)m6A甲基化水平提高，甲基化的作用大于去甲基化的作用，METTL14在脂肪組織中的表達(dá)量顯著提高[22-23]。所有這些結(jié)果均表明，METTL14在細(xì)胞分化、脂肪沉積等過程中有著重要作用。目前，m6A修飾在脂肪沉積中的相關(guān)研究主要集中在去甲基化酶FTO的研究上[24]，而METTL14與反芻動(dòng)物脂肪沉積之間的研究尚不清楚。本試驗(yàn)通過對(duì)大通牦牛METTL14進(jìn)行克隆及序列分析，依據(jù)分子生物信息學(xué)技術(shù)，在分子和細(xì)胞2個(gè)層面，分析牦牛脂肪組織中METTL14的生物信息學(xué)特性及表達(dá)規(guī)律，以期為闡釋METTL14調(diào)控高原家畜脂肪沉積的特異性分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 組織樣品選取體質(zhì)量相近的18月齡和30月齡的大通牦牛各3頭，屠宰后采集其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背最長(zhǎng)肌、皮下脂肪組織，用PBS洗滌，液氮過夜，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)胞體外培養(yǎng)牦牛前體脂肪細(xì)胞由實(shí)驗(yàn)室前期培養(yǎng)并提供[25]，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至培養(yǎng)孔底面積的70%左右時(shí)，用胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和地塞米松處理脂肪細(xì)胞2 d，誘導(dǎo)其分化，此后，每隔1 d用含10%胎牛血清和10 mg/L胰島素的培養(yǎng)液替換正常培養(yǎng)液，持續(xù)培養(yǎng)12 d[26]。

1.3 主要試劑PrimeSTAR HS DNA Polymerase、PrimeScriptTMRT reagent Kit、pMD19-T Vector Cloning Kit、TRIzol、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、E.ColiDH5α感受態(tài)細(xì)胞、TIANgel Midi Purification Kit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司；氨芐西林、三氯甲烷購(gòu)自Sigma公司。

1.4 主要儀器低溫離心機(jī)購(gòu)自蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；梯度PCR儀購(gòu)自美國(guó)伯樂公司；壓力蒸汽滅菌器購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械廠；Bio-Rad CFX 96 qRT-PCR購(gòu)自時(shí)代聯(lián)想生物科技有限公司；生物安全柜購(gòu)自上海力申科學(xué)儀器有限公司。

1.5 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄取-80℃保存的組織，為提高提取的RNA質(zhì)量，脂肪組織提取前去除油脂[27]，加入液氮研磨后用TRIzol試劑、三氯甲烷提取RNA；牦牛前體脂肪細(xì)胞用六孔板培養(yǎng)至12 d，分別收集培養(yǎng)時(shí)間為0,4,8,12 d的細(xì)胞并用TRIzol試劑、三氯甲烷提取細(xì)胞總RNA。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA含量及純度(D260 nm/D280 nm>1.8)，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。用PrimeScrip RT reagent Kit將總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成長(zhǎng)片度cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 牦牛METTL14引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的野牦牛METTL14(XM_005898072.2)序列,確定METTL14的CDS區(qū)，采用Primer-BLAST設(shè)計(jì)METTL14的PCR擴(kuò)增引物、qRT-PCR引物以及qRT-PCR內(nèi)參基因β-actin引物，引物相關(guān)信息見表1。

表1 METTL14擴(kuò)增及qRT-PCR所用引物信息

1.7 牦牛METTL14的克隆與測(cè)序根據(jù)TaKaRa公司PrimeScriptTMRT reagent Kit的說明書操作，將牦牛脂肪組織RNA反轉(zhuǎn)錄成長(zhǎng)片段cDNA，以此為模板，用METTL14上游引物F、下游引物R擴(kuò)增牦牛METTL14的CDS區(qū)全長(zhǎng)序列。反應(yīng)體系25 μL：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，METTL14-F/R各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55.1℃退火30 s，72℃延伸2 min，37個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，切膠回收目的片段并連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至Trans5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布到含氨芐西林的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)12 h，挑取單菌落繼續(xù)振蕩培養(yǎng)12 h后，進(jìn)行菌液PCR鑒定，將陽性菌液送西安擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.8 牦牛METTL14的生物信息學(xué)分析將METTL14測(cè)序結(jié)果用SeqMan拼接后，用表2中生物學(xué)軟件進(jìn)行基因序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析。

表2 核苷酸和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)分析工具

1.9 牦牛METTL14 qRT-PCR檢測(cè)選用β-actin(NM_001009784)作為內(nèi)參基因，Primer-BLAST設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(表1)。使用Bio-Rad CFX 96 qRT-PCR儀檢測(cè)目的基因及內(nèi)參基因的表達(dá)量，每組設(shè)生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)(3×3)。反應(yīng)體系10 μL：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ5 μL，METTL14-F/R(10 μmol/L)各0.4 μL，cDNA模板0.8 μL，ddH2O 3.4 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性30 s，61.4℃退火30 s，95℃延伸30 s，45個(gè)循環(huán)；55℃延伸2 s。觀察熒光信號(hào)的變化，信號(hào)強(qiáng)度隨著溫度的升高先上升后降低，且形成單一峰，說明產(chǎn)物特異性良好。

2.0 統(tǒng)計(jì)分析qRT-PCR結(jié)果采用2-△△Ct方法進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用SPSS 23.0軟件進(jìn)行比較平均值中的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 牦牛METTL14編碼基因擴(kuò)增及克隆根據(jù)野牦牛METTL14 mRNA設(shè)計(jì)特異性引物，以大通牦牛脂肪組織cDNA 為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，通過紫外凝膠成像儀觀察到在1 666 bp 附近出現(xiàn)清晰條帶(圖1)，特異性良好，與預(yù)期結(jié)果相符。

M.DL2000 DNA Marker；1～4.METTL14擴(kuò)增產(chǎn)物圖1 牦牛METTL14的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2 牦牛METTL14 mRNA CDS區(qū)序列分析目的基因測(cè)序結(jié)果經(jīng)SeqMan軟件拼接，獲得METTL14 cDNA序列的長(zhǎng)度為1 666 bp，與預(yù)期一致。使用NCBI的ORF Finder進(jìn)行分析，獲得1個(gè)1 371 bp 的最長(zhǎng)ORF，與GenBank中公布的野牦牛(XM_005898072.2)METTL14 mRNA CDS的同源性為99.81%，因此，確定大通牦牛METTL14 CDS區(qū)長(zhǎng)度為1 371 bp，編碼456個(gè)氨基酸。

2.3 牦牛METTL14基因及其編碼蛋白同源性比對(duì)分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

2.3.1METTL14基因及其編碼蛋白序列同源性比對(duì) 將牦牛METTL14的核苷酸序列與GenBank中與野牦牛(Bosmutus，XM_005898072.2)、黃牛(Bostaurus，NM_001083714.1)、綿羊(Ovisaries，XM_004009592.4)、豬(Susscrofa，XM_003129231.6)、雙峰駱駝(Camelusbactrianus，XM_010952608.1)、人(Homosapiens，NM_020961.4)、野馬(Equusprzewalskii，XM_008534527.1)、獼猴(Macacanemestrina，XM_011748914.2)、兔(Musmusculus，NM_201638.2)、小鼠(Musmusculus，NM_201638.2)、雞(Gallusgallus，NM_001031148.1)等11個(gè)物種該基因CDS區(qū)序列進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大通牦牛METTL14核苷酸序列與野牦牛、黃牛、綿羊、豬、雙峰駱駝、人、野馬、獼猴、兔、小鼠和雞苷酸序列的同源性分別為99.8%，99.6%，99.0%，95.5%，95.1%，95.1%，94.8%，94.5%，92.0%，89.9%和81.5%(圖2)；大通牦牛METTL14氨基酸序列與GenBank中的野牦牛(Bosmutus,XP_005898134.1)、綿羊(Ovisaries，XP_004009641.1)、野馬(Equusprzewalskii，XP_008532749.1)、黃牛(Bostaurus，NP_001077183.1)、豬(Susscrofa，XP_003129279.3)、獼猴(Macacanemestrina，XP_011747216.1)、人(Homosapiens，NP_066012.1)、雙峰駱駝(Camelusbactrianu，XP_010950910.1)、兔(Oryctolaguscuniculus，P_002717295.2)、小鼠(Musmusculus，XP_004009641.1)、雞(Gallusgallus，NP_001026319.1)等11個(gè)物種的氨基酸序列同源性分別為99.6%，99.6%，99.6%，99.3%，99.1%，99.1%，99.1%，98.9%，98.9%，98.3%，93.5%(圖3)。

圖2 大通牦牛與其他物種METTL14核苷酸序列同源性對(duì)比結(jié)果

圖3 大通牦牛與其他物種 METTL14蛋白氨基酸序列同源性比對(duì)結(jié)果

2.3.2METTL14核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 通過MEGA 7.0軟件構(gòu)建核苷酸同源性系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析了包括大通牦牛METTL14 CDS區(qū)在內(nèi)的11個(gè)物種該基因的CDS區(qū)核苷酸序列。建樹結(jié)果(圖4)表明，在11個(gè)物種中，大通牦牛METTL14和野牦牛的親緣關(guān)系最近，與雞和小鼠的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖4 牦牛METTL14系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 牦牛METTL14蛋白質(zhì)分析

2.4.1蛋白及核酸理化性質(zhì)分析 經(jīng)BioEdit軟件分析發(fā)現(xiàn)，METTL14堿基分布情況為：A、G、C和T平均含量分別為32.60%，18.31%，24.95%和24.14%，其中G+C的平均含量(43.25%)低于A+T平均含量(56.75%)，表明該基因堿基使用存在偏向性，偏好使用AT堿基。經(jīng)ProtParam軟件分析發(fā)現(xiàn)，大通牦牛METTL14分子式為C2277H3575N669O709S16，其相對(duì)分子質(zhì)量為52 193.33 kDa，等電點(diǎn)為5.89，氨基酸組分中谷氨酸含量(10.50%)最高，色氨酸含量(1.30%)和蛋氨酸含量(1.30%)最少(表3)。METTL14分子中正電荷氨基酸殘基 (Arg+Lys) 70個(gè)，負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp+Glu) 77個(gè)。METTL14的脂肪系數(shù)(AI)為66.14，不穩(wěn)定系數(shù)(Ⅱ)為52.76，總平均親水指數(shù)(GRAVY)為-0.878。

表3 牦牛METTL14蛋白的氨基酸組分

2.4.2METTL14親水性/疏水性預(yù)測(cè) 經(jīng)ExPASyProtScale軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，METTL14親水性氨基酸的總分值高于疏水性氨基酸(圖5)，牦牛METTL14總體表現(xiàn)出強(qiáng)的親水性，與GRAVY值預(yù)測(cè)相符。多肽鏈第429位精氨酸(R)親水性最強(qiáng)(-3.300)；第234位色氨酸(W)疏水性最強(qiáng)(1.544)。

圖5 牦牛METTL14蛋白的親疏水性分析

2.4.3METTL14結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) 通過CDD軟件對(duì)METTL14的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示，在METTL14氨基酸序列的186～363位有1個(gè)MT-A70結(jié)構(gòu)域(圖6)，E-value=8.22e-80。MT-A70是mRNA上SAM的結(jié)合亞基，可特異地甲基化前體pre-mRNA中的腺嘌呤。

圖6 牦牛METTL14蛋白保守結(jié)構(gòu)域

2.4.4METTL14信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)運(yùn)用 SignalP 4.1分析METTL14氨基酸序列，預(yù)測(cè)有信號(hào)肽的概率是0.092%，C值為0.111，Y值為0.119，S值為0.161，S-mean及D-mean值分別為0.127、0.132，均小于閾值0.450，說明METTL14 無信號(hào)肽(圖7)。通過TMHMM METTL14跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖8)，顯示METTL14均處于膜內(nèi)，即METTL14無跨膜結(jié)構(gòu)域，不是膜蛋白。

圖7 牦牛METTL14蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)

圖8 牦牛METTL14蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

2.4.5METTL14亞細(xì)胞定位與核定位預(yù)測(cè) 用PSORT預(yù)測(cè)METTL14亞細(xì)胞定位，k-NN預(yù)測(cè)結(jié)果(表4)顯示METTL14定位在細(xì)胞核上(69.60%)。用cNLS-mapper對(duì)METTL14進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其存在一段核定位序列，序列為PNAKRKYQDE (score=8)，位置在59～70位之間。

表4 牦牛METTL14亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

2.4.6METTL14潛在磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè) 使用NetPhos 3.1 Server分析METTL14的氨基酸序列潛在磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果顯示，該序列具有40個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，絲氨酸(serine)、蘇氨酸(threonine)及酪氨酸(tyrosine)占比分別為35%,42.5%和22.5%(圖9)。

圖9 牦牛METTL14基因氨基酸序列潛在磷酸化位點(diǎn)分析

2.4.7METTL14二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用Sopma軟件預(yù)測(cè)牦牛METTL14二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖10)，發(fā)現(xiàn)牦牛METTL14中的無規(guī)則卷曲占51.10%、α-螺旋占33.11%，氨基酸殘基連接成的延伸鏈占11.84%，β-轉(zhuǎn)角占3.95%。其中，柔性無規(guī)則卷曲占比較高。

A.蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)位點(diǎn)圖(h.α-螺旋；c.無規(guī)則卷曲；t.β-轉(zhuǎn)角；e.延伸)；B.蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)峰圖；C.蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)豎條紋圖。紫色.示無規(guī)則卷曲；藍(lán)色.示α-螺旋；紅色.示延伸鏈；綠色.示β-轉(zhuǎn)角圖10 牦牛METTL14蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4.8METTL14三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用SWISS-MODEL軟件對(duì)牦牛METTL14氨基酸序列進(jìn)行同源建模(圖11)，全局模型質(zhì)量估計(jì)(global model quality estimation，GMQE)值為0.68，發(fā)現(xiàn)牦牛METTL14三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、無規(guī)則卷曲、β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈構(gòu)成。

圖11 牦牛METTL14蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4.8METTL14蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè) 通過STRING軟件構(gòu)建了METTL14互作蛋白網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果如圖12所示，牦牛METTL14相互作用的蛋白有10個(gè)，包括作用于DNA(或RNA)甲基化過程的METTL3、METTL4等MT-A70家族蛋白，參與修復(fù)被甲基化損傷的DNA(或RNA)的ALKBH1、ALKBH5等AlkB家族蛋白，以及WTAP、ENSBTAG00000002641、KIAA1429、YTHDF1、CBLL1等其他參與m6A甲基化修飾的相關(guān)蛋白。METTL14在這個(gè)互作網(wǎng)絡(luò)中有RNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性、RNA結(jié)合和催化等分子功能，與各互作蛋白共同參與RNA的甲基化修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)加工、剪接等生物過程。

圖12 牦牛METTL14蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)

2.5 METTL14表達(dá)譜分析qRT-PCR結(jié)果顯示，METTL14 mRNA在牦牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背最長(zhǎng)肌和皮下脂肪組織中都有所表達(dá)，但存在一定的差異，METTL14在肝臟高表達(dá)，在脾臟則低表達(dá)；與脂肪組織中的表達(dá)量相比，METTL14在脾臟的表達(dá)量最低，差異極顯著(P<0.001)；在心臟、背最長(zhǎng)肌的表達(dá)量極顯著高于脂肪組織(P<0.01) (圖13A)。牦牛生長(zhǎng)發(fā)育不同階段METTL14的表達(dá)量也有差異，30月齡牦牛脂肪組織中METTL14表達(dá)量顯著高于18月齡的(P<0.05) (圖13B)，表明牦牛METTL14隨著個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)行，表達(dá)也表現(xiàn)出差異。為了進(jìn)一步探究METTL14在牦牛前體脂肪細(xì)胞分化過程中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，誘導(dǎo)牦牛前體脂肪細(xì)胞分化并培養(yǎng)12 d，發(fā)現(xiàn)隨著前體脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的分化，METTL14在0，4，8，12 d的表達(dá)量呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)，4，8 d的表達(dá)量顯著高于0 d (P<0.05)，并且12 d的表達(dá)量極顯著高于0 d (P<0.01) (圖13C)，表明在脂肪細(xì)胞分化后期METTL14發(fā)揮著重要的作用。

A.牦牛METTL14基因在不同組織中的表達(dá)；B.牦牛METTL14基因在2個(gè)不同時(shí)期的表達(dá)；C.牦牛METTL14基因在脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)(0，4，8，12 d)。*.示P<0.05;**.示0.05

3 討論

本試驗(yàn)經(jīng)克隆獲得牦牛脂肪組織METTL14基因的完整CDS區(qū)，由起始密碼子ATG開始到終止密碼子TAG結(jié)束共1 371 bp。大通牦牛METTL14核苷酸與氨基酸序列與其他物種同源性比較結(jié)果顯示，11個(gè)物種之間都有差異但相似性很高，說明METTL14基因結(jié)構(gòu)和功能存在物種及品種特異性，但也保持了酶自身在不同物種中的一致性，進(jìn)一步說明依賴METTL14功能的m6A在真核生物中廣泛存在。大通牦牛METTL14基因和野牦牛親源關(guān)系最近，與雞和小鼠的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。這3組進(jìn)化關(guān)系數(shù)據(jù)說明METTL14具有高度保守性，但存在一定的種屬特異性，不同物種間保守性不高。

大通牦牛METTL14基因CDS區(qū)共編碼456個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為52 193.33 kDa，負(fù)電荷氨基酸殘基總數(shù)比正電荷氨基酸殘基總數(shù)多20個(gè)，其-COOH解離程度大于-NH3解離程度，等電點(diǎn)為5.89，表明METTL14為酸性氨基酸；親疏水性預(yù)測(cè)結(jié)合GRAVY值，可以判斷METTL14具有較強(qiáng)的親水性，有利于其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮活性； METTL14在氨基酸序列186～363位預(yù)測(cè)到1個(gè)MT-A70的保守結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域比較接近DNA6mA的甲基轉(zhuǎn)移酶。有研究表明，METTL14是DNA6mA同源物的一個(gè)獨(dú)立亞分支，MT-A70酶結(jié)構(gòu)域和具有替代機(jī)制偏好的結(jié)構(gòu)域相連，催化DNA6mA的形成[28]。由此推斷，牦牛METTL14中MT-A70的保守結(jié)構(gòu)域維持了甲基轉(zhuǎn)移酶的保守機(jī)制；有試驗(yàn)用免疫共沉淀法定位WTAPMETTL3METTL14酶復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)其定位在細(xì)胞核上且富集在核斑點(diǎn)上，并一一對(duì)復(fù)合物的單個(gè)蛋白進(jìn)行核定位信號(hào)(nuclear localization signals，NLS)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)METTL14不包含功能性NLS，而METTL3和METTL14構(gòu)成的異質(zhì)二聚體在細(xì)胞質(zhì)中形成，細(xì)胞質(zhì)中METTL3的功能性NLS攜帶METTL14一起轉(zhuǎn)運(yùn)到核中[29]，這與預(yù)測(cè)的METTL14的信號(hào)肽概率為0.092%，幾乎不存在引導(dǎo)蛋白質(zhì)定位到亞細(xì)胞內(nèi)的短肽序列的結(jié)果一致，而且METTL14不屬于分泌蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，所以新合成的METTL14沒有分泌通路，無法分泌到細(xì)胞外而存在于細(xì)胞質(zhì)中，但本試驗(yàn)METTL14亞細(xì)胞定位主要定位在細(xì)胞核上，細(xì)胞質(zhì)中有4.3%，核定位預(yù)測(cè)結(jié)果同樣有69.60%的該蛋白定位在細(xì)胞核上，其可能原因與它的功能相關(guān)，METTL14雖然不具有單獨(dú)的m6A催化活性，但METTL14在細(xì)胞核中決定RNA上靶基因的結(jié)合，促進(jìn)METTL3的催化，參與了RNA甲基化修飾。牦牛METTL14潛在磷酸化位點(diǎn)總共有40個(gè)，其中蘇氨酸上潛在的磷酸化位點(diǎn)數(shù)占42.5%，高于絲氨酸(35%)及酪氨酸(22.5%)上的潛在磷酸化位點(diǎn)，磷酸化作用與甲基化作用一樣是蛋白質(zhì)性質(zhì)改變的方法之一，同樣需要通過激活來影響蛋白理化性質(zhì)；METTL14和METTL3的甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合在一起，形成異質(zhì)二聚體，METTL3和 METTL14中各有56個(gè)和67個(gè)氨基酸參與了相互作用，互作界面的氨基酸非常保守，研究中作者根據(jù)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了一系列的點(diǎn)突變，但還是很難破壞其穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[30]。但METTL14的不穩(wěn)定系數(shù)為52.02，是不穩(wěn)定水溶性酸性蛋白，其高級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，卷曲的柔性構(gòu)象會(huì)使肽鏈改變走向，METTL14自身不具備穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，由此推測(cè)METTL14單獨(dú)表達(dá)時(shí)，疏水互作界面暴露出來，導(dǎo)致蛋白不穩(wěn)定而與METTL3互作共表達(dá)時(shí)2個(gè)蛋白相互起到穩(wěn)定異質(zhì)二聚體構(gòu)象的作用。在METTL3和METTL14之間有1條富含正電荷的溝槽對(duì)RNA 的結(jié)合有著重要的功能[30]，參與RNA甲基化修飾、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)加工、剪接等生物過程。

METTL14在18齡大通牦牛各組織中均有表達(dá)，心臟、背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)高于脂肪組織中的表達(dá)，在脾臟表達(dá)量最低，表明牦牛METTL14的表達(dá)具有組織特異性，與動(dòng)物代謝活動(dòng)具有一定的相關(guān)性；隨著牦牛生長(zhǎng)發(fā)育，30月齡的牦牛脂肪組織中METTL14表達(dá)量高于18月齡的，說明該基因的表達(dá)量受時(shí)空的影響；METTL14在牦牛前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)隨著前體脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的發(fā)育呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，表明在脂肪細(xì)胞分化后期METTL14發(fā)揮著重要的作用。本研究從分子水平和細(xì)胞水平都表明METTL14基因的表達(dá)與脂肪沉積之間存在一定的相關(guān)性。

脂肪組織的發(fā)育是由一個(gè)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的過程，除了轉(zhuǎn)錄調(diào)控外，在以往的研究中發(fā)現(xiàn)可通過表觀遺傳分子機(jī)制調(diào)控脂肪的發(fā)育和脂質(zhì)的沉積，近年來除了DNA甲基化修飾、組蛋白修飾和染色質(zhì)空間重塑等DNA和蛋白質(zhì)上的化學(xué)修飾外，RNA修飾日趨成為表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[31-32]。新的證據(jù)表明，m6A修飾在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育過程中,對(duì)脂肪發(fā)育和脂質(zhì)沉積起著至關(guān)重要的作用[33-35]。 m6A修飾位點(diǎn)具有典型的一致序列DRACH(D=G，A或U；R=G或A；H=A、C或U)，前體mRNAs(pre-mRNAs)上的m6A可以招募剪接因子兩種核糖核蛋白A2和B1(HnRNPA2B1)或加強(qiáng)側(cè)翼RNA序列對(duì)剪接因子A2和B1的可變性[36]。據(jù)報(bào)道，METTL14可以對(duì)組蛋白H3賴氨酸36三甲基化(H3K36me3)修飾進(jìn)行識(shí)別，并選擇性介導(dǎo)m6A富集在mRNA上[37]。構(gòu)建Cre/loxP基因敲除小鼠，敲除METTL14會(huì)使小鼠胰島素β細(xì)胞中胰島素分泌量減少，促進(jìn)肝臟脂肪分解，使脂肪細(xì)胞中的脂質(zhì)沉積減少[38]。m6A依賴METTL14修飾非編碼RNA，影響微小RNA microRNAs(miRNAs)的表達(dá)和環(huán)狀RNA(circRNA)的生物合成[39-40]，由此可見，理論上機(jī)體內(nèi)脂肪沉積的含量、脂質(zhì)代謝的過程可以通過METTL14基因進(jìn)行微調(diào)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，METTL14在大通牦牛脂肪沉積過程中發(fā)揮了一定作用，但其作用于脂肪沉積的機(jī)制尚未明確。對(duì)此，后期可將METTL14作為調(diào)控牦牛m6A脂肪沉積的候選基因進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)進(jìn)一步為METTL14基因在牦牛脂肪沉積調(diào)控機(jī)制的研究奠定了理論基礎(chǔ)。