李 峰，楊占清，周博文，曹 宇，李 雯，葛玉松，付守鵬，柳巨雄* (.吉林大學 動物醫(yī)學學院，吉林 長春 3006；.天津嘉立荷唐山牧場，河北 唐山 063099)

乳腺是哺乳動物分泌乳汁以哺育后代的唯一器官，其發(fā)育程度決定了仔畜的生長狀況。乳腺的發(fā)育主要受體內(nèi)激素水平的影響[1]，其發(fā)育階段可分為胚胎期、青春期、妊娠期、泌乳期和退化期[2]。乳腺的基本結構自出生時發(fā)育完成，隨后一直到青春期，乳腺的發(fā)育基本保持靜止。進入青春期后，隨著激素水平的升高， 乳腺上皮細胞(MECs)和乳腺終末端乳芽迅速增殖，乳腺導管進入脂肪墊形成分支，初步組成導管網(wǎng)絡[3-4]。隨后，乳腺導管在妊娠期進一步發(fā)育形成腺泡樣結構，逐漸具備泌乳性能直到泌乳結束。泌乳結束后乳腺進入退化期，腺泡結構開始退化，失去泌乳功能[5-6]。乳腺的狀態(tài)隨著動物的妊娠呈周期性變化[7]。由乳腺的發(fā)育進程可知，青春期乳腺的發(fā)育程度決定了乳腺在泌乳期分泌乳汁的能力[8]。因此，青春期是乳腺發(fā)育的關鍵時期，對雌性哺乳動物哺育后代尤為重要。

MECs是乳腺中唯一具有泌乳能力的細胞，MECs的增殖活性和數(shù)量決定了乳腺的發(fā)育程度和泌乳性能。因此，研究影響MECs增殖活性的因素及調(diào)控機制是闡明乳腺發(fā)育機制的有效途徑。MECs的增殖活性主要受到激素的調(diào)控，但隨著研究的不斷深入，其他營養(yǎng)素也被證實能夠影響MECs的增殖活性，在缺少脂肪酸和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的情況下，MECs的增殖活性較低[9]，煙酸、月桂酸和油酸等均被證實可以通過提高mMECs的增殖活性從而促進乳腺發(fā)育[9-11]。

氨基酸是機體不可或缺的營養(yǎng)素，已有研究表明，精氨酸、絲氨酸等均對細胞增殖具有影響[12-13]。蛋氨酸(Met)作為機體的必需氨基酸，目前已被證實對mMECs的泌乳性能具有促進作用[14]，但是其對小鼠乳腺發(fā)育的影響尚不清楚。因此，本研究通過在青春期小鼠飲用水中添加蛋氨酸以及使用蛋氨酸處理mMECs的方法，分別在體內(nèi)和體外探索蛋氨酸對青春期小鼠乳腺發(fā)育的影響及調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 細胞的復蘇培養(yǎng)與處理將凍存的mMECs復蘇后轉(zhuǎn)移至含有10% FBS的DMEM中培養(yǎng)，隨后傳代于60 mm培養(yǎng)皿中。待細胞融合至50%～60%時，用不同濃度的蛋氨酸(0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mmol/L)處理細胞48 h，期間每隔24 h更換新鮮培養(yǎng)基，重新添加蛋氨酸處理。

1.2 CCK-8細胞增殖活性檢測將mMECs傳代于96孔板中，添加蛋氨酸處理48 h后，使用CCK-8細胞增殖活性檢測試劑盒，按照操作說明檢測細胞增殖活性。

1.3 Western blot用蛋氨酸處理mMECs 48 h后，提取細胞總蛋白。測定蛋白質(zhì)量濃度后，用NP40及5×SDS分別將不同的蛋白質(zhì)樣品配制成相同質(zhì)量濃度，并高溫變性。通過SDS-PAGE分離目標蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜，于4℃與相應的一抗孵育過夜后，用相對應的二抗進行孵育，每次抗體孵育完成后使用TBST洗滌PVDF膜，最后用ECL超敏發(fā)光液于暗室中顯影。

1.4 全組織染色脫頸處死小鼠后，剝離第4對乳腺組織。將乳腺組織充分展開于載玻片上，用卡諾氏固定液固定過夜。依次在70%，35%，15%的乙醇中浸泡10 min。用胭脂紅染色液 (2 g/L) 染色。隨后依次在95%，100%，100%乙醇中浸泡10 min，置于二甲苯溶液中浸泡2 h。封片后在顯微鏡下觀察乳腺發(fā)育情況。

1.5 在體試驗研究中所涉及的動物試驗均按照吉林大學動物保護福利規(guī)程進行。將出生后4周的青春期雌性小鼠分為對照組和試驗組(飲用水中分別含有0.025%，0.05%，0.1%的蛋氨酸)，每組4只。對照組飼喂正常水，試驗組小鼠采取蛋氨酸間隔飼喂法，即每隔2 d更換含蛋氨酸飲用水為正常水，持續(xù)4周。

1.6 數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)均顯示為平均值±標準差。使用ImageJ 軟件(Rawak Software，Inc.德國) 分析蛋白水平變化。使用Graphpad Prism 8.0.1中單方差分析(ANOVA)對數(shù)據(jù)進行分析。P<0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 蛋氨酸對青春期小鼠乳腺導管分支的影響本研究結果顯示，分別飼喂0.025%，0.05%，0.1%蛋氨酸后，青春期小鼠的乳腺導管分支呈現(xiàn)不同程度的增多(圖1)。

A.空白對照組小鼠的乳腺導管分支程度；B.飼喂含有0.025%蛋氨酸飲用水試驗組小鼠的乳腺導管分支程度；C.飼喂含有0.05%蛋氨酸飲用水試驗組小鼠的乳腺導管分支程度；D.飼喂含有0.1%蛋氨酸飲用水試驗組小鼠的乳腺導管分支程度圖1 蛋氨酸對青春期小鼠乳腺導管分支的影響

2.2 蛋氨酸對mMECs增殖活性的影響用蛋氨酸處理mMECs后，對mMECs的增殖活性進行了檢測。結果顯示，蛋氨酸呈濃度依賴的方式顯著增強mMECs的增殖活性(圖2)。

*示P<0.05,**示P<0.01，****示P<0.001，與NT組比較具有顯著性差異圖2 蛋氨酸對mMECs細胞增殖活性的影響

2.3 蛋氨酸對mMECs中增殖標志蛋白的影響Cyclin D1 和 PCNA 的上調(diào)是細胞增殖的表征。為了闡明蛋氨酸促進mMECs增殖的機制，檢測了蛋氨酸處理后mMECs中Cyclin D1和PCNA的變化。結果顯示，添加0.4,0.6,0.8,1.0 mmol/L的蛋氨酸可呈濃度依賴方式顯著促進mMECs中Cyclin D1和PCNA的表達(圖3A,B,C)。

A.Western blot 檢測不同濃度蛋氨酸處理mMECs后Cyclin D1和PCNA的蛋白水平變化;B.Cyclin D1;C.PCNA。***示P<0.005及****示P<0.001，與NT組比較差異顯著圖3 蛋氨酸對mMECs中 Cyclin D1和PCNA蛋白水平的影響

2.4 蛋氨酸對mTOR-4EBP1信號通路活性的影響為了深入探究蛋氨酸促進mMECs增殖活性的機制，檢測了蛋氨酸對mTOR信號通路的影響。結果顯示，蛋氨酸顯著提高了mTOR和4EBP1的活化水平(圖4A,B,C)。

A.Western blot 檢測使用不同濃度蛋氨酸處理mMECs后mTOR和4EBP1信號分子的活性變化； B.p-mTOR/mTOR;C.p-4EBP1/4EBP1。**示P<0.01,***示P<0.005及****示P<0.001，與NT組比較差異顯著圖4 蛋氨酸對mMECs中mTOR和4EBP1信號分子活性的影響

2.5 蛋氨酸通過mTOR-4EBP1信號軸對增殖標志蛋白的影響為了探索蛋氨酸是否可以通過mTOR-4EBP1信號軸影響增殖標志蛋白的水平，調(diào)控mMECs的增殖活性，在添加蛋氨酸處理mMECs前，先使用雷帕霉素(rapamycin,Rapa，mTOR的特異性抑制劑)預處理mMECs抑制mTOR信號通路的活性。隨后檢測Cyclin D1、PCNA 和 p-Rb的蛋白水平。結果顯示，用Rapa預處理后，mMECs中Cyclin D1、PCNA和p-Rb的蛋白水平顯著降低，蛋氨酸對mTOR-4EBP1信號軸的激活作用被顯著抑制(圖5A,B,C)，并阻斷了蛋氨酸對Cyclin D1、PCNA和p-Rb的蛋白水平的上調(diào)作用(圖5A,D,E,F)。

A.Western blot檢測添加Rapa后，mMECs中mTOR、4EBP1和Rb信號分子的活性變化及Cyclin D1和PCNA的蛋白水平變化;B.p-mTOR/mTOR;C.p-4EBP1/4EBP1;D.Cyclin D1;E.PCNA;F.p-Rb/Rb。**示P<0.01,***示P<0.005,****/####示P<0.001；*示與NT組比較差異顯著，#示與Met組比較差異顯著圖5 蛋氨酸激活mTOR-4EBP1信號軸對mMECs中增殖標志蛋白的影響

2.6 蛋氨酸對青春期小鼠乳腺組織中mTOR信號通路及增殖標志蛋白的影響本研究進一步檢測了飼喂蛋氨酸后青春期小鼠乳腺組織中mTOR信號通路活性及Cyclin D1和PCNA的蛋白水平變化，結果發(fā)現(xiàn)，飼喂含有0.05%和0.1%蛋氨酸的飲用水顯著提高了小鼠乳腺組織中Cyclin D1和PCNA的蛋白水平(圖6A,B,C)。并且，添加0.025%、0.05%和0.1%蛋氨酸顯著提高了乳腺組織中mTOR信號的活性(圖6D)。

A.Western blot 檢測青春期小鼠乳腺組織中Cyclin D1、PCNA及mTOR信號分子的活性變化；B.Cyclin D1;C.PCNA;D.p-mTOR/mTOR;*示P<0.05,****示P<0.001，與NT組比較差異顯著圖6 蛋氨酸(Met)對小鼠乳腺組織中mTOR信號分子活性及Cyclin D1和PCNA蛋白水平的影響

3 討論

乳腺是哺乳動物為新生子代提供營養(yǎng)和先天免疫的唯一器官，乳腺的發(fā)育狀況直接影響新生幼畜的存活，而青春期乳腺發(fā)育的程度決定了泌乳期乳腺泌乳的能效，因此研究青春期乳腺發(fā)育的內(nèi)在調(diào)控機制，尋找有效刺激乳腺發(fā)育的營養(yǎng)物質(zhì)具有重要意義。乳腺的發(fā)育受到多種因素的影響，日糧中的營養(yǎng)水平對青春期母畜的乳腺發(fā)育具有較大的影響[15]。氨基酸作為蛋白質(zhì)合成的底物，也參與調(diào)控機體的生長發(fā)育。目前蛋氨酸已經(jīng)被證實能夠促進MECs乳合成[16-17]，但是能否促進乳腺發(fā)育尚不清楚。在本研究中，通過飼喂含有蛋氨酸的飲用水，發(fā)現(xiàn)蛋氨酸可以促進乳腺導管形成分支；使用不同濃度的蛋氨酸處理mMECs，發(fā)現(xiàn)蛋氨酸可以通過增強mTOR-4EBP1信號通路活性提高Cyclin D1和PCNA蛋白水平以及Rb的磷酸化水平，顯著增強mMECs的增殖活性。

Cyclin D1是推動細胞增殖周期進程的關鍵蛋白，在G1期和G2期高表達[18]；PCNA是DNA聚合酶的輔助蛋白，在DNA復制和細胞分裂中具有重要作用[19]。PCNA已被證實可以與周期蛋白依賴性激酶 (cyclin-dependent kinases,CDKs) 或Cyclin 形成復合物參與細胞增殖[20-21]。因此，Cyclin D1和PCNA的表達水平是檢測細胞增殖的重要指標。研究發(fā)現(xiàn)Cyclin D1可以與CDK4/6和Rb蛋白形成復合物，推動細胞周期進程[22-23]。也有研究發(fā)現(xiàn)Rb蛋白的磷酸化水平升高后，可釋放E2F轉(zhuǎn)錄因子，促進細胞分裂[24-26]。在本研究中，蛋氨酸以濃度依賴的方式顯著提高mMECs中Cyclin D1和PCNA的蛋白水平以及Rb蛋白的磷酸化水平。而且，在體試驗結果顯示，蛋氨酸也顯著增加乳腺組織中Cyclin D1和PCNA的蛋白水平。這些結果均表明蛋氨酸可以通過提高mMECs中Cyclin D1和PCNA的蛋白水平，促進mMECs增殖。

以往的研究表明，mTOR信號通路在調(diào)控細胞增殖過程中發(fā)揮重要作用[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)蛋氨酸顯著提高了mMECs及乳腺組織中mTOR信號分子的活化水平。因此，為了探究蛋氨酸是否能通過激活mTOR信號影響增殖相關蛋白的水平，本研究使用雷帕霉素抑制mTOR信號通路的活性，進一步探索mTOR在蛋氨酸調(diào)節(jié)乳腺發(fā)育中的作用。結果表明，mTOR信號通路被抑制后，阻斷了蛋氨酸對mMECs中Cyclin D1和PCNA蛋白水平的上調(diào)作用。而且蛋氨酸對Rb的激活作用也被顯著抑制。以上結果均表明，蛋氨酸可通過mTOR-4EBP1調(diào)控Cyclin D1和PCNA的表達以及Rb的磷酸化水平，繼而影響mMECs的增殖活性。

綜上研究結果表明，蛋氨酸通過激活mTOR-4EBP1信號軸提高Cyclin D1和PCNA的表達水平及Rb的磷酸化水平，增強mMECs的增殖活性，促進乳腺導管分支，最終促進青春期乳腺發(fā)育。