吳同壘，冀夢(mèng)瑤，周詩(shī)淼，張瑩輝，李佩國(guó)*，蔣 卉* (.河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島 066004；.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 00080)

腸炎沙門菌能夠引起多種動(dòng)物的腹瀉、嘔吐等臨床癥狀，以及幼齡動(dòng)物的大規(guī)模死亡[1-2]；成年動(dòng)物抵抗力強(qiáng)，往往呈隱性感染，但可通過其分泌物向外界排菌，這也是導(dǎo)致其所致疾病難以凈化的主要原因[3]。被污染的動(dòng)物產(chǎn)品被人類食用或人類直接接觸感染動(dòng)物可引起胃腸炎等疾病，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅[4]。因此，控制動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品中沙門菌的流行，對(duì)人類健康和公共衛(wèi)生有著重要意義。目前防控沙門菌感染主要依賴抗生素，但耐藥菌株的出現(xiàn)給防控工作帶來(lái)了巨大壓力。進(jìn)一步研究其耐藥機(jī)制，對(duì)防治沙門菌感染具有重要意義。

生物被膜能夠顯著增強(qiáng)細(xì)菌的耐藥性，幫助細(xì)菌逃避機(jī)體的免疫防御反應(yīng)，造成慢性感染，給疾病防控帶來(lái)一定的困難。甘油激酶(glycerokinase，GlpK)在大多數(shù)細(xì)菌和動(dòng)物細(xì)胞中普遍存在，主要參與甘油代謝和質(zhì)膜的合成[5]。多項(xiàng)研究證實(shí)，分枝桿菌屬細(xì)菌可利用GlpK調(diào)節(jié)細(xì)菌的耐藥性，針對(duì)GlpK靶點(diǎn)而設(shè)計(jì)的藥物可有效治療結(jié)核病，揭示了GlpK與耐藥性之間的關(guān)系[6-7]。腸炎沙門菌GlpK能否影響細(xì)菌生物被膜的形成，進(jìn)而影響其耐藥性，需要進(jìn)一步闡明。

本研究構(gòu)建了腸炎沙門菌GlpK基因敲除菌株，并進(jìn)行生物被膜分析和藥敏試驗(yàn)，為新型靶向抗菌藥物的研發(fā)奠定了重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源腸炎沙門菌c50336、溫敏型質(zhì)粒pKD3、pCP20，重組酶表達(dá)質(zhì)粒pKD46，由河北科技師范學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pMD18-T購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 試劑和試劑盒Taq酶、T4連接酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DNA Marker、熒光定量PCR試劑購(gòu)自康為世紀(jì)生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑、限制性內(nèi)切酶和蛋白Marker購(gòu)自Thermal Scientific公司；L-阿拉伯糖購(gòu)自Sigma公司；ID32E生化鑒定試紙條購(gòu)自Biomerieux公司，細(xì)菌RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 基因敲除和回補(bǔ)相關(guān)引物的設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI的GenBank中腸炎沙門菌基因組GlpK的基因信息設(shè)計(jì)引物。引物P3和P4由兩部分組成，用于擴(kuò)增氯霉素基因，下劃線部分與GlpK基因同源，其余部分與氯霉素基因同源；引物P5、P6根據(jù)引物P3和P4與GlpK同源片段兩側(cè)的序列設(shè)計(jì)，用于敲除菌株的鑒定；引物P1和P2用于pKD46質(zhì)粒的鑒定；引物P7、P8用于GlpK回補(bǔ)表達(dá)菌株的構(gòu)建。引物信息見表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列及相關(guān)信息

1.4 GlpK基因敲除菌株及回補(bǔ)株的構(gòu)建提取質(zhì)粒pKD46，電擊轉(zhuǎn)化至腸炎沙門菌c50336中，具體操作：取c50336培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，使用預(yù)冷的去離子水洗滌3次并重懸，87 μL/管分裝，取3 μL質(zhì)粒pKD46，與之混勻進(jìn)行電擊，電壓為1.8 kV，電擊后使用LB液體培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)，涂布含Amp的LB平板，長(zhǎng)出單菌落后，以引物P1和P2鑒定。

以質(zhì)粒pKD3為模板，使用引物P3、P4進(jìn)行擴(kuò)增和回收，獲得同源片段；在培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的c50336(攜帶pKD46)菌液中加入終濃度30 mmol/L的阿拉伯糖誘導(dǎo)2 h，將同源片段電擊轉(zhuǎn)化至c50336(攜帶pKD46)菌株中，電擊過程同前所述；涂布含氯霉素的LB平板，長(zhǎng)出單菌落后使用引物P5和P6鑒定。陽(yáng)性菌經(jīng)42℃熱激去除質(zhì)粒pKD46，命名為c50336::cat。將質(zhì)粒pCP20電轉(zhuǎn)化入c50336::cat，經(jīng)抗性篩選得到丟失氯霉素片段的菌株，即為2次重組菌株c50336ΔglpK，以引物P5和P6對(duì)其進(jìn)行鑒定。42℃熱激去除質(zhì)粒pCP20。

以引物P7和P8擴(kuò)增GlpK基因，雙酶切后克隆至回補(bǔ)質(zhì)粒pMD18-T，即為pMD18-T-glpK，將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至菌株c50336ΔglpK中，即為回補(bǔ)菌株 c50336ΔglpK+glpK。

1.5 生長(zhǎng)曲線測(cè)定和生化特性分析培養(yǎng)過夜細(xì)菌按1∶100轉(zhuǎn)接新鮮LB或LB(含氯霉素)液體培養(yǎng)基，37℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)；在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定菌液D600 nm，并繪制生長(zhǎng)曲線。使用ATB自動(dòng)鑒定系統(tǒng)進(jìn)行菌株生化特性分析，簡(jiǎn)要操作如下：挑取單菌落分散在生理鹽水中，滴加在ID32E生化鑒定試紙條上，并使用礦物油滴加在厭氧孔；將試紙條放在濕盒中，37℃培養(yǎng)過夜；次日向吲哚孔滴加James后上機(jī)分析。

1.6 生物被膜形成能力檢測(cè)采用試管法和微孔板法進(jìn)行生物被膜測(cè)定。試管法操作步驟：過夜培養(yǎng)菌液按照1∶100比例轉(zhuǎn)接到含有6 mL液體培養(yǎng)基的試管中，28℃低速振蕩培養(yǎng)72 h(轉(zhuǎn)速60 r/min )，棄去液體培養(yǎng)基，使用PBS小心洗滌5次。試管洗滌后，使用酒精燈火焰干燥，加入甲醇(要沒過菌液平面)固定10 min，棄去甲醇，用PBS反復(fù)清洗；加入2%的結(jié)晶紫溶液染色30 min，用PBS反復(fù)清洗，觀察試管壁上的生物被膜。微孔板法簡(jiǎn)要步驟：將過夜培養(yǎng)菌液加入到96孔微量板中，每孔加入200 μL，按照上述方法培養(yǎng)、洗滌和染色后，加入100 μL無(wú)水乙醇，溶解孔壁上結(jié)晶紫，測(cè)定D570 nm光密度值。

1.7 藥敏試驗(yàn)取菌液均勻涂板，使用無(wú)菌鑷子取藥敏紙片貼于平板上，37℃倒置培養(yǎng)12 h。觀察抑菌圈并測(cè)量抑菌圈直徑，根據(jù)NCCSL標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

1.8 Curli菌毛和纖維素的檢測(cè)Curli菌毛檢測(cè)步驟：滴加菌液到含有160 mg/L剛果紅與10 mg/L考馬斯亮藍(lán)的無(wú)鹽LB平板上，28℃培養(yǎng)2 d，觀察菌落形態(tài)和顏色。能夠形成Curli菌毛的菌落表面粗糙、干燥，顏色更紅，反之，則出現(xiàn)顏色較淺且光滑的菌落。纖維素的檢測(cè)步驟：滴加菌液到含有 Calcofluor White Stain(200 mg/L)的無(wú)鹽LB平板上，28℃培養(yǎng)2 d，在紫外燈下觀察。能夠形成纖維素的菌落熒光強(qiáng)度高，反之，熒光強(qiáng)度低。

1.9 生物被膜相關(guān)基因的表達(dá)分析培養(yǎng)細(xì)菌c50336、c50336ΔglpK至對(duì)數(shù)期，使用細(xì)菌RNA提取試劑盒提取RNA；用DNaseⅠ去除DNA后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，選擇文獻(xiàn)[8]中與生物被膜形成相關(guān)的基因及其引物，采用染料法進(jìn)行熒光定量PCR分析，內(nèi)參使16S rRNA。引物序列見表2。

表2 PCR引物名稱及序列

2 結(jié)果

2.1 GlpK基因缺失菌株和回補(bǔ)菌株的構(gòu)建以1次重組菌株c50336ΔglpK::cat和2次重組菌株c50336ΔglpK的菌液為模板，使用引物P5、P6鑒定，結(jié)果見圖1A，與預(yù)期相符，證明GlpK基因敲除菌株構(gòu)建成功。以回補(bǔ)菌株c50336ΔglpK+glpK菌液為模板，以引物P7、P8進(jìn)行鑒定，結(jié)果見圖1B，與預(yù)期結(jié)果一致，表明回補(bǔ)菌株構(gòu)建成功。

A.GlpK基因敲除菌株的鑒定結(jié)果(M.DL5000 Plus DNA Marker;1.c50336;2.c50336ΔglpK::Cat;3.c50336ΔglpK)；B.回補(bǔ)菌株的鑒定結(jié)果(M.DL2000 Plus DNA Marker;1.c50336;2.c50336ΔglpK;3.c50336ΔglpK+glpK)圖1 GlpK基因敲除菌株的鑒定和回補(bǔ)菌株驗(yàn)證

2.2 菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定和生化特性分析生長(zhǎng)曲線繪制結(jié)果(圖2)顯示，3株菌株的生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)一致，基因敲除菌株c50336ΔglpK菌株的生長(zhǎng)相比于野生型c50336菌株，無(wú)明顯差異，表明在LB培養(yǎng)的條件下，腸炎沙門菌缺失GlpK基因?qū)ιL(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)代謝影響不大。生化特性鑒定結(jié)果(表3)顯示，菌株c50336ΔglpK和c50336ΔglpK+glpK的d-纖維二糖發(fā)酵結(jié)果為陰性，野生型菌株c50336為陽(yáng)性，菌株c50336ΔglpK的α-半乳酸酐酶αGAL為陽(yáng)性，菌株c50336為陰性，菌株c50336ΔglpK+glpK為陽(yáng)性，表明GlpK基因缺失腸炎沙門菌的生化特性影響較小。

WT.c50336;KO.c50336ΔglpK;RS.c50336ΔglpK+glpK圖2 生長(zhǎng)曲線

表3 GlpK基因敲除菌株生化鑒定結(jié)果

2.3 生物被膜檢測(cè)采用試管法和微孔板法進(jìn)行生物被膜測(cè)定，試管法檢測(cè)結(jié)果見圖3A，可見菌株c50336ΔglpK試管中形成的生物被膜相比于c50336和c50336ΔglpK+glpK淺且細(xì)。結(jié)晶紫染色法檢測(cè)結(jié)果顯示，c50336ΔglpK菌株黏附的結(jié)晶紫吸光度值，明顯低于菌株c50336和c50336ΔglpK+glpK(圖3B)。上述結(jié)果表明GlpK敲除可降低腸炎沙門菌的生物被膜形成能力。

A.試管法；B.微孔板法。WT.c50336;KO.c50336ΔglpK;RS.c50336ΔglpK+glpK；**.示0.001

2.4 藥敏試驗(yàn)?zāi)退幮越Y(jié)果顯示(表4)，相對(duì)于野生型菌株c50336，菌株c50336ΔglpK對(duì)喹諾酮類藥物、內(nèi)酰胺類藥物中的頭孢曲松和頭孢拉定，替米考星、氨基糖甙類藥物中的諾氟沙星和恩諾沙星，酰胺醇類中的氟苯尼考，以及乙酰甲喹的敏感性顯著提高。回補(bǔ)菌株耐藥性得到部分恢復(fù)，但對(duì)替米考星和乙酰甲喹等藥物敏感性未得到恢復(fù)，可能的原因是回復(fù)菌株GlpK基因表達(dá)水平并未完全達(dá)到生理水平，且由于染色體上GlpK的敲除導(dǎo)致附近處于同一操縱子下的基因的表達(dá)受到抑制，進(jìn)而影響了菌株耐藥性。這些結(jié)果表明敲除GlpK基因降低了腸炎沙門菌的耐藥性。

表4 GlpK基因缺失菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.5 Curli菌毛和纖維素檢測(cè)Curli菌毛試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示菌株c50336和c50336ΔglpK+glpK形成紅色、邊緣粗糙的菌落，而菌株c50336ΔglpK形成白色且邊緣光滑的菌落(圖4A)，表明GlpK基因缺失降低了腸炎沙門菌產(chǎn)生Curli菌毛的能力。纖維素檢測(cè)結(jié)果顯示菌株c50336的菌落熒光強(qiáng)度比菌株c50336ΔglpK亮，菌株c50336ΔglpK+glpK的菌落熒光強(qiáng)度得到一定恢復(fù)(圖4B)。結(jié)果表明敲除GlpK基因能抑制腸炎沙門菌纖維素的產(chǎn)生。

WT.c50336;KO.c50336ΔglpK;RS.c50336ΔglpK+glpK圖4 Curli菌毛(A)和纖維素的檢測(cè)(B)

2.6 生物被膜相關(guān)基因的表達(dá)基因表達(dá)分析結(jié)果顯示bcsgD、bcsA、ropS、ompR、rfbH和fimD表達(dá)量均發(fā)生不同程度降低(圖5)，表明GlpK影響生物被膜的形成是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，這在一定程度上揭示了其在生物被膜形成中的作用機(jī)制。

WT.c50336;KO.c50336ΔglpK；*.示0.01

3 討論

腸炎沙門菌是重要的人獸共患致病菌，主要引起幼齡動(dòng)物死亡和成年動(dòng)物的隱性感染以及人類胃腸炎，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。細(xì)菌可在人、動(dòng)物、動(dòng)物產(chǎn)品和環(huán)境之間循環(huán)傳播，給疾病的防控工作帶來(lái)嚴(yán)重挑戰(zhàn)。在臨床實(shí)踐中，腸炎沙門菌感染往往依靠抗生素進(jìn)行防治，隨著而來(lái)的是耐藥菌株的大量出現(xiàn)。相關(guān)研究顯示，甘油激酶GlpK可介導(dǎo)分枝桿菌的耐藥，針對(duì)該基因設(shè)計(jì)的靶向藥物可有效治療相關(guān)疾病[6-7]。因此，本研究構(gòu)建了腸炎沙門菌GlpK基因敲除菌株，并進(jìn)行了生長(zhǎng)曲線、生化特性、耐藥性和生物被膜形成能力分析，結(jié)果顯示GlpK基因敲除可顯著降低腸炎沙門菌的耐藥性和形成生物被膜的能力，降低了其Curli菌毛和纖維素的產(chǎn)生，下調(diào)了生物被膜形成相關(guān)基因的表達(dá)，研究結(jié)果為腸炎沙門菌新型靶向抗菌藥物的研發(fā)奠定了重要基礎(chǔ)。

耐藥甚至多重耐藥菌株給相關(guān)疾病的防控工作帶來(lái)極大壓力。不同于抗生素類藥物，新型靶向藥物不易產(chǎn)生耐藥，是目前抗菌藥物研發(fā)的重要方向。GlpK可介導(dǎo)分枝桿菌的耐藥性，但在腸炎沙門菌中的作用尚不明確。本研究通過同源重組技術(shù)構(gòu)建了腸炎沙門菌GlpK敲除菌株，采用K-B紙片法分析其耐藥性的變化，證明GlpK基因可介導(dǎo)腸炎沙門菌對(duì)喹諾酮類藥物、內(nèi)酰胺類藥物中的頭孢曲松和頭孢拉定，替米考星、氨基糖甙類藥物中的諾氟沙星和恩諾沙星，酰胺醇類中的氟苯尼考，以及乙酰甲喹的耐藥性。研究結(jié)果證明GlpK可影響腸炎沙門菌的耐藥性，為新型靶向藥物的研制奠定了重要基礎(chǔ)。

生物被膜是為單一或多種類細(xì)菌為適應(yīng)周圍環(huán)境，附著于生物或非生物的固體表面而形成的具有一定結(jié)構(gòu)的微生物群體，可保護(hù)細(xì)菌免于抗菌藥物的殺傷作用，與細(xì)菌耐藥性息息相關(guān)[8-9]。本研究利用試管法和微孔板法證明GlpK基因敲除菌株的生物被膜形成能力顯著降低，從生物被膜角度揭示了其影響耐藥性的作用機(jī)制。卷曲菌毛(Curli菌毛)和纖維素是沙門菌生物被膜的主要成分[10]，本研究證明GlpK敲除菌株生成Curli菌毛和纖維素的能力降低，進(jìn)一步揭示了該基因影響腸炎沙門菌生物被膜形成的機(jī)制。

研究顯示，調(diào)控基因qbcsgD可影響Curli菌毛的生物合成；ropS和ompR基因可激活qbcsgD基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而對(duì)生物被膜產(chǎn)生影響[11-12]；rfbH基因可能通過影響細(xì)菌O-抗原的形成，從而影響生物被膜的形成；fimD基因編碼鞭毛蛋白，鞭毛形成和生物被膜密切相關(guān)[13-14]；bcsA基因也可影響沙門菌生物被膜形成[15-16]。本研究通過熒光定量PCR方法證明GlpK基因敲除后，bcsgD、bcsA、ropS、ompR、rfbH和fimD表達(dá)量降低，研究結(jié)果從分子水平揭示了GlpK影響沙門菌生物被膜形成的機(jī)制。

綜上所述，本研究利用同源重組技術(shù)構(gòu)建了腸炎沙門菌GlpK基因敲除菌株，并進(jìn)行了生物被膜和藥物敏感性檢測(cè)，同時(shí)分析了該基因影響生物被膜形成的作用機(jī)制，為防控沙門菌感染的靶向藥物研發(fā)奠定了重要基礎(chǔ)。