楊振興，李占鴻，李卓然，李 樂，楊 恒，牛保生，姚萍芬，朱建波* (．云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 6504；．云南省師宗縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南 曲靖 655700)

西藏環(huán)狀病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)屬呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)，病毒粒子呈20面體，大小約為80 nm，為無包膜雙鏈RNA(dsRNA)病毒[1]。病毒基因組為21 kb，由 10個(gè)節(jié)段長度不同的dsRNA(Seg-1～Seg-10)組成，可以編碼(VP1～VP7)7種結(jié)構(gòu)蛋白和(NS1～NS4)4 種非結(jié)構(gòu)蛋白[2]。其中Seg-6長1 100 bp，編碼346個(gè)氨基酸殘基的病毒核心蛋白VP6，為解旋酶，參與ssRNA和dsRNA結(jié)合與解旋，不同毒株間Seg-9的核酸序列高度保守，相似度高于95%[3]。

TIBOV(XZ0906)于2009年首次從我國西藏采集的圓斑按蚊中分離到，這是一種新型環(huán)狀病毒[1]。2009年和2011年分別在廣東省的致倦庫蚊和湖南的三帶喙庫蚊中分離到TIBOV(D181/2008和HN11121)，其中三帶喙庫蚊是我國乙腦病毒的重要傳播媒介，不僅分布范圍廣而且是很多地區(qū)的優(yōu)勢蚊種[4]。2012、2013和2019年分別在云南省芒市、西雙版納傣族自治州和師宗縣采集的庫蠓中相繼分離到TIBOV(DH13C12、YN12246和YNSZ/V290/2019)[5-7]。在云南省江城、師宗、景洪和德宏等地區(qū)采集到的牛、羊和豬血清中均檢測到TIBOV的中和抗體，抗體效價(jià)較高，且多地牛血清抗體陽性率高于20%[7]。以上研究結(jié)果表明TIBOV已經(jīng)在我國多地被發(fā)現(xiàn)和分離，并可感染多種家畜動(dòng)物，有文獻(xiàn)報(bào)道TIBOV是家畜動(dòng)物不明熱和流產(chǎn)的潛在致病性病原，對(duì)我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成了潛在威脅[3]，因此建立TIOBV的快速可視化病原學(xué)檢測診斷方法對(duì)疫病的防控具有指導(dǎo)作用。

目前，已建立了TIBOV的常規(guī)RT-PCR和qRT-PCR檢測方法[7]，雖然這2種檢測方法均具有準(zhǔn)確可靠的優(yōu)勢，但常規(guī)RT-PCR耗時(shí)長，靈敏度低，擴(kuò)增結(jié)束后需通過電泳檢測，易污染，而且很難在感染初期檢出病毒；qRT-PCR檢查方法的靈敏度和時(shí)效性上有所提高，但是需要昂貴的檢測設(shè)備。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由NOTOMI等[8]于2000年發(fā)明的一種新型恒溫核酸擴(kuò)增方法，該技術(shù)借助具有鏈置換作用的Bst DNA聚合酶的幫助，可在等溫條件下進(jìn)行靶序列高效快速擴(kuò)增，避免了常規(guī)RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的梯度升降溫模式[9]。所以，LAMP無需昂貴的設(shè)備，而且該技術(shù)可以根據(jù)反應(yīng)管中液體顏色的變化，通過肉眼識(shí)別即可做出判斷，做到了真正意義上的現(xiàn)場可視化快檢[10]。近年來，國內(nèi)外已將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、真菌和病毒等病原微生物的檢測，其靈敏度、特異性和時(shí)效性都有很好的體驗(yàn)。

鑒于目前尚未見LAMP方法用于TIBOV的檢測，本研究選擇我國分離TIBOV(YNSZ/V290/2019)毒株[6]的Seg-9序列作為靶基因，根據(jù)高保守區(qū)域設(shè)計(jì)RT-LAMP特異性引物，建立了針對(duì)TIBOV的特異性RT-LAMP檢測方法，為開展我國TIOBV的檢測與流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 毒株和昆蟲樣品流行性出血病病毒(epizootic haemorrhagic disease virus，EHDV)YNSZ/V003/2012[11]、藍(lán)舌病病毒(bluetongue virus,BTV)GDST008[12]、中山病病毒(Chuzan virus，CHUV)SZ187[13]、廣西環(huán)狀病毒(Guangxi orbivirus，GXOV)V172/GX/2015[14]、阿卡斑病毒(Akabane virus，AKAV)V287/YNSZ/2019[15]、版納病毒(Banna virus,BAV)YNSZ043[16]、芒市病毒(Mangshi virus,MSV)V301/YNJH/2019[17]和TIBOV(YNSZ/V290/2019)等蟲媒病毒由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。昆蟲樣品為采集自云南省景洪和師宗不同地區(qū)牛羊養(yǎng)殖場的2 596只蠓蟲和蚊蟲，其中蠓蟲1 947只，蚊蟲649只。

1.2 主要試劑WarmStart?LAMP變色預(yù)混液(M1800)購自新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)公司(北京)；一步法RT-PCR試劑盒、DL5000 DNA Marker和DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa；pLB零背景快速克隆試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；磁珠法病毒核酸提取試劑盒(MagMAX-96 Viral RNA Isolation Kit)購自Thermo公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)和合成從GenBank中下載TIBOV株的Seg-9基因序列，與本研究室前期分離的TIBOV(YNSZ/V290/2019)毒株Seg-9序列進(jìn)行比對(duì)，選擇高度保守區(qū)域，利用PrimerExplorer V5(http://primerexplorer.jp/e/)在線軟件設(shè)計(jì)6條特異性引物：1對(duì)外引物TIBOV-F3/B3，1對(duì)內(nèi)引物TIBOV-FIP/BIP和1對(duì)環(huán)引物TIBOV-Floop/Bloop(表1)。引物由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。

表1 TIBOV的RT-LAMP檢測引物相關(guān)信息

1.4 核酸的提取及質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建使用磁珠法病毒RNA提取試劑盒，按照產(chǎn)品說明書對(duì)EHDV、BTV、CHUV、GXOV和TIBOV毒株及昆蟲樣品進(jìn)行RNA提取。標(biāo)記編號(hào)后，PCR儀上95℃加熱5 min后，迅速冰浴冷卻進(jìn)行變性處理，解開病毒基因組的雙鏈RNA，-70℃保存?zhèn)溆谩＠肨IBOV RT-LAMP的外側(cè)引物F3/B3對(duì)提取的TIBOV核酸進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將回收產(chǎn)物與pLB載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后，篩選、鑒定出正確的重組質(zhì)粒，并進(jìn)行測序驗(yàn)證。經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定質(zhì)粒濃度后，根據(jù)公式計(jì)算出質(zhì)?？截悢?shù)。

1.5 可視化RT-LAMP反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化以TIBOV核酸為模板，配置反應(yīng)體系(25 μL)：WarmStart LAMP 2×Master Mix 12.5 μL、TIBOV-F3/PALV-B3引物(10 μmol/L)各1 μL、TIBOV-FIP/PALV-BIP 引物(20 μmol/L)各1 μL、TIBOV-Floop/Bloop(20 μmol/L)各1 μL，模板核酸2 μL，加入無核酸酶滅菌水至25 μL。在此反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，利用棋盤法分別優(yōu)化內(nèi)外引物比例(1∶1，2∶1，3∶1，4∶1和5∶1)、反應(yīng)溫度(60，62，64，66℃)，反應(yīng)時(shí)間(40，50，60，70 min)，核酸模板(1，1.5，2 μL)，確定最佳反應(yīng)體系和條件。

1.6 特異性試驗(yàn)取EHDV、BTV、CHUV、GXOV、BAV、MSV和TIBOV等蟲媒病毒的核酸為模板，以ddH2O為陰性對(duì)照，用建立的RT-LAMP方法同時(shí)進(jìn)行檢測，分析該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn)將已經(jīng)測定拷貝數(shù)的TIBOV重組質(zhì)粒用無核酸酶滅菌水10倍梯度稀釋成100～106拷貝/μL 7個(gè)梯度，每個(gè)反應(yīng)管加入1 μL稀釋的核酸樣品作為模板，進(jìn)行TIBOV RT-LAMP和常規(guī)RT-PCR[7]擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分析比較兩種方法的敏感性。

1.8 昆蟲樣品檢查用TIBOV RT-LAMP和常規(guī)RT-PCR方法[7]分別檢查2 596份蠓蟲和蚊蟲的核酸樣品，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，比較2種方法的檢出率，并計(jì)算兩者的符合率。

2 結(jié)果

2.1 可視化RT-LAMP反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化經(jīng)棋盤法確定優(yōu)化后的RT-LAMP反應(yīng)體系(25 μL)：WarmStart LAMP 2×Master Mix 12.5 μL、TIBOV-F3/PALV-B3引物(10 μmol/L)各0.2 μL、TIBOV-FIP/PALV-BIP引物(20 μmol/L)各0.4 μL、TIBOV-Floop/Bloop(20 μmol/L)各0.4 μL，模板核酸1.5 μL，加入無核酸酶滅菌水至25 μL；反應(yīng)條件：64℃ 50 min，80℃ 5 min終止反應(yīng)。RT-LAMP反應(yīng)結(jié)束后，TIBOV核酸樣品反應(yīng)液顏色由紅色變?yōu)辄S綠色，電泳呈現(xiàn)梯度狀條帶，為陽性；而陰性對(duì)照的反應(yīng)液仍為粉紅色，電泳無條帶出現(xiàn)(圖 1)，表明優(yōu)化所得RT-LAMP可視化反應(yīng)結(jié)果良好。

A.電泳結(jié)果；B.目測結(jié)果；1.陰性對(duì)照；2.TIBOV；M.DL5000 DNA Marker圖1 TIBOV RT-LAMP 最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下的檢測結(jié)果

2.2 特異性試驗(yàn)對(duì)EHDV、BTV、CHUV、GXOV、AKAV、BAV、MSV和TIBOV的核酸進(jìn)行RT-LAMP檢測，結(jié)果顯示僅TIBOV核酸檢測結(jié)果出現(xiàn)梯度狀條帶，反應(yīng)管顏色變?yōu)辄S綠色，顯現(xiàn)為陽性，而其他病毒的檢測結(jié)果均為陰性(圖2)，表明該檢測方法具有較強(qiáng)的特異性。

A.電泳結(jié)果；B.目測結(jié)果。1.TIBOV；2.EHDV；3.BTV；4.CHUV；5.GXOV；6.AKAV；7.BAV；8.MSV；M.DL5000 DNA Marker圖2 TIBOV RT-LAMP特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 敏感性試驗(yàn)經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定構(gòu)建的TIBOV基因重組質(zhì)粒(pLB-TIBOV/V209/Seg-9)的質(zhì)量濃度為38.5 mg/L，根據(jù)公式計(jì)算出核酸拷貝數(shù)為1.82×1011拷貝/μL。用無核酸酶滅菌水將質(zhì)粒10倍梯度稀釋成1.82×100～1.82×106拷貝/μL的7個(gè)濃度梯度，各取1 μL為模板同時(shí)進(jìn)行TIBOV RT-LAMP和常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示RT-LAMP和RT-PCR分別檢出TIBOV的最低核酸濃度分別為18.2和182 拷貝/μL(圖3)，但RT-PCR的電泳條帶較弱，c高10倍以上。

A.RT-PCR電泳結(jié)果；B.RT-LAMP電泳結(jié)果；C.RT-LAMP目測結(jié)果。0～6.為TIBOV陽性質(zhì)粒(pLB-TIBOV/V209/Seg-9)10倍梯度稀釋至1.82×100～1.82×106 拷貝/μL的7個(gè)梯度樣品；N.陰性對(duì)照；M.DL5000 DNA Marker圖3 TIBOV RT-LAMP靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 昆蟲樣品的檢查用TIBOV RT-LAMP和常規(guī)RT-PCR方法分別檢測2 596份蠓蟲和蚊蟲的核酸樣品，結(jié)果顯示(表2)，RT-LAMP檢測86份為陽性，2 510份為陰性，陽性檢出率為3.31%；RT-PCR檢測31份為陽性，2 565份為陰性，陽性檢出率為1.19%；2種方法檢測同為陽性和陰性的樣品各為31份和2 510份，符合率為[(31+2 510)/2 596]×100%=97.88%。表明RT-PCR雖能用于檢測昆蟲樣品中的病毒核酸，但因敏感性較RT-LAMP低，導(dǎo)致部分病毒載量較低的陽性樣品檢查結(jié)果為陰性。

表2 RT-LAMP和RT-PCR方法檢測結(jié)果的符合率 份

3 討論

近年來隨著人們對(duì)環(huán)狀病毒屬病毒的深入研究，不斷有新型環(huán)狀病毒被陸續(xù)分離和發(fā)現(xiàn)，一方面拓展了人們對(duì)環(huán)狀病毒屬病毒的認(rèn)識(shí)，另一方面掌握新發(fā)環(huán)狀病毒屬病毒的流行特征對(duì)動(dòng)物疫病防控與保障公共衛(wèi)生安全具有重要的意義。作為一種新發(fā)環(huán)狀病毒的西藏環(huán)狀病毒，目前國內(nèi)外已報(bào)道了病原分離[6]、病毒抗體[3]及核酸檢測等多種方法。病原分離工作量大、耗時(shí)長，不便于進(jìn)行快速檢測；抗體檢測方法，由于抗體的產(chǎn)生相對(duì)于病毒感染存在一定的滯后性，不利于疫病的早期診斷和防控；核酸檢測方法如巢式PCR[18]、RT-PCR及qRT-PCR[7]等，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但主要局限于實(shí)驗(yàn)室檢測，無法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測。因此本研究以TIBOV的Seg-9為靶基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立了RT-LAMP檢測方法，完善了TIBOV檢測技術(shù)體系。

本研究針對(duì)TIOBV靶片段設(shè)計(jì)了6條特異性引物，提高了擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增產(chǎn)物。由于RT-LAMP比RT-PCR的擴(kuò)增效率高，開管檢測的方式更容易造成污染，這是RT-LAMP技術(shù)在基層推廣中遇到的最大問題[19]。通過使用含鈣黃素的預(yù)混染料，在反應(yīng)結(jié)束后，陽性樣品管會(huì)出現(xiàn)明亮的黃綠色，而陰性樣品管為粉紅色，在自然光下肉眼觀察直接觀察對(duì)比顏色變化，直接判斷樣品的陰陽性。此外，陽性樣品由于擴(kuò)增產(chǎn)生了大量產(chǎn)物，與陰性對(duì)照相比陽性管溶液會(huì)更為渾濁。本研究建立的可視化RT-LAMP方法避免了其他方法采用電泳等開管方式檢測時(shí)，容易使擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠溢出，污染試驗(yàn)環(huán)境從而出現(xiàn)假陽性的可能。

EHDV、BTV、CHUV、GXOV、BAV和MSV均為蠓蟲或蚊蟲傳播的蟲媒病毒，自然環(huán)境中多種蟲媒病毒流行區(qū)域重疊或同時(shí)感染易感動(dòng)物的情況普遍存在[20]。因此，為確保TIBOV RT-LAMP檢測方法的特異性，我們對(duì)以上6種病毒的核酸進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陰性，表明本研究建立的RT-LAMP檢測方法具有較好的特異性。同時(shí)通過引入1對(duì)環(huán)引物(LF/LB)，摸索最佳擴(kuò)增溫度，提高了RT-LAMP的反應(yīng)效率，進(jìn)一步縮短反應(yīng)時(shí)長，加速顯色反應(yīng)，以TIBOV質(zhì)粒為檢測對(duì)象，其最低檢出限為18.2拷貝/μL，反應(yīng)時(shí)間僅為RT-PCR的1/2，敏感性是RT-PCR方法的10倍以上。

昆蟲樣品檢測結(jié)果顯示，RT-LAMP檢出陽性86份，檢出率為3.31%，RT-PCR檢出陽性31份，檢出率為1.19%，因?yàn)殛栃岳ハx樣品的病毒載量較低，而RT-LAMP的靈敏度更高，因此病毒檢出率是常規(guī)RT-PCR的2倍以上。同時(shí)發(fā)現(xiàn)RT-PCR檢測昆蟲樣品時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶較弱，可能導(dǎo)致一些樣品檢測時(shí)出現(xiàn)假陰性。因此RT-LAMP有更好的靈敏度和時(shí)效性，更適合大規(guī)模樣品的快速檢測和病原學(xué)調(diào)查。本研究建立的RT-LAMP為我國開展TIBOV的流行病學(xué)調(diào)查和疫病的現(xiàn)場快速檢測提供了有效的技術(shù)支撐。