喬麒龍，黃 慶，王白玉，楊盼盼，趙月政，王寶玲，崔麗瑾，苗玉和，趙 軍* (.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；.福建圣維生物技術(shù)有限公司，福建 南平35400)

雞傳染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)感染引起的一種急性、高度接觸性傳染病[1]。IBDV主要感染3～6周齡的雛雞，感染后導(dǎo)致雛雞中樞免疫器官法氏囊嚴(yán)重受損，B淋巴細胞功能損壞，從而導(dǎo)致機體產(chǎn)生免疫抑制、引起其他病原的繼發(fā)感染。IBDV屬于雙RNA病毒科禽雙RNA病毒屬，其基因組包括A、B 2個節(jié)段。A節(jié)段編碼VP2、VP3、VP4和VP5 4個蛋白。其中VP2是IBDV的衣殼蛋白和主要的宿主保護性抗原，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性中和抗體，是研制IBD基因工程疫苗的首選靶抗原[2-3]。隨著疫苗的廣泛使用，IBD的流行出現(xiàn)了新的變化。20世紀(jì)90年代出現(xiàn)的以急性、高致死率為臨床特征的IBDV超強毒株逐漸被新型變異株所取代，非典型IBD不斷出現(xiàn)[4-5]。IBDV新型變異株感染雞無明顯臨床癥狀，但可造成中樞免疫器官法氏囊的嚴(yán)重萎縮導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫抑制，對我國養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重威脅。因此研發(fā)針對我國流行的IBDV新型變異毒株引起IBD疫苗具有現(xiàn)實意義。

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染引起的能夠感染各種禽類的急性、高度接觸性和致死性傳染病，嚴(yán)重危害我國和世界養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展[6-7]。NDV顆粒表面的融合蛋白(F)和血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)是2種重要的功能性糖蛋白，在病毒感染、裝配、出芽、決定宿主和組織嗜性等方面發(fā)揮重要作用。F蛋白介導(dǎo)病毒—細胞和細胞—細胞的融合，且與NDV的毒力直接相關(guān)。HN蛋白是1個多功能蛋白，在病毒感染過程中發(fā)揮重要作用，參與識別細胞表面的唾液酸受體，促進F蛋白的融合活性；HN蛋白的神經(jīng)氨酸酶活性可以去除子代病毒顆粒上的唾液酸，防止病毒顆粒自我凝集[8-11]。NDV目前只有1個血清型，但根據(jù)F基因的差異可以區(qū)分為18個基因型，目前我國禽群中NDV主要流行株以基因Ⅶ型為主[12-13]。

疫苗免疫是防控IBD和ND的重要手段。現(xiàn)有的商品化IBD和ND疫苗包括單聯(lián)或多聯(lián)的弱毒活苗和滅活疫苗。與單苗相比較，多聯(lián)疫苗在控制混合感染和降低疫苗接種勞動強度、減少動物應(yīng)激等方面具有顯著優(yōu)勢。傳統(tǒng)的多聯(lián)疫苗生產(chǎn)需要分別制備多種抗原，生產(chǎn)工藝繁瑣，生產(chǎn)成本高。IBDV變異株的高效分離和高滴度培養(yǎng)目前還存在一定困難，基于IBDV VP2蛋白的亞單位疫苗存在純化成本高和內(nèi)毒素導(dǎo)致的安全隱患等問題。利用合適載體制備的基因工程多聯(lián)疫苗能夠克服傳統(tǒng)多聯(lián)疫苗制備工藝的缺陷。國內(nèi)外利用基因Ⅱ型NDV LaSota疫苗株作為載體構(gòu)建了表達多種外源基因的基因工程多聯(lián)疫苗[14-15]。但由于我國雞群中普遍存在高水平抗NDV LaSota株母源抗體和LaSota株疫苗不能有效控制我國目前流行的基因Ⅶ型NDV的感染等原因[16]，使得基于LaSota株的重組活載體疫苗的臨床應(yīng)用受到限制。雖然我國已經(jīng)有商品化的防控基因Ⅶ型NDV的單聯(lián)滅活疫苗[17]，但由于新獸藥證書的限制和安全性的問題，目前國內(nèi)尚沒有防控基因Ⅶ型NDV的多聯(lián)滅活疫苗和弱毒活疫苗。綜合上述因素，我們前期利用反向遺傳技術(shù)將LaSota疫苗株的HN和F基因分別替換為基因Ⅶ型NDV強毒株的HN基因和帶有蛋白酶裂解位點氨基酸突變的F基因，構(gòu)建了含有基因Ⅶ型F和HN基因的嵌合型LaSota弱毒株—LaSota-ⅦF/HN。在證明其安全性和免疫原性的基礎(chǔ)上，將優(yōu)化合成的不同IBDV流行變異毒株VP2基因共有序列插入到LaSota-ⅦF/HN基因組中，構(gòu)建出能夠表達IBDV流行變異毒株VP2蛋白的重組嵌合型NDV，以期作為多聯(lián)疫苗制備用種毒為研發(fā)有效防控IBDV變異株和基因Ⅶ型NDV感染的廉價高效疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞和病毒BHK-21細胞、NDV LaSota疫苗株和表達T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒vTF7-3均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院傳染病教研室保存。

1.2 主要試劑和材料含有基因Ⅶ型NDV毒株F和HN基因的嵌合型NDV LaSota-ⅦF/HN全長基因組cDNA的質(zhì)粒pNDFL-ⅦF/HN、表達LaSota株NP、P和L蛋白的輔助質(zhì)粒pCIneo-NP-P-L[18]、pGEM-PM穿梭載體和含有中國近年來IBDV流行變異毒株VP2基因共有序列的質(zhì)粒pUC-VP2均由本實驗室構(gòu)建。pGEM-PM穿梭載體含有NDV LaSota株的P和M部分基因以及2者之間的非編碼區(qū)，在P和M序列之間引入額外的NDV基因終止(GE)和基因起始(GS)序列，并在GE和GS下游引入2個SapⅠ限制性內(nèi)切酶位點以方便外源基因的插入。IBDV VP2單克隆抗體由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究所制備。SapⅠ、ApaⅠ和PmlⅠ限制性內(nèi)切酶及T4DNA連接酶均購自NEB公司；DNA膠回收試劑盒及質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒購自Thermo Fisher公司；病毒基因組RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；SPF雞胚購自山東昊泰實驗動物繁育有限公司；HRP酶標(biāo)記羊抗鼠IgG購自Proteintech Group公司；ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒購自Milipore公司。

1.3 表達VP2蛋白的重組NDV 感染性克隆的構(gòu)建以pUC-VP2質(zhì)粒為模板，利用帶有SapⅠ限制性內(nèi)切酶位點的特異性引物(表1)進行PCR擴增VP2基因。VP2基因經(jīng)SapⅠ酶切后克隆至pGEM-PM質(zhì)粒中獲得pGEM-PM-VP2重組質(zhì)粒；然后利用ApaⅠ和PmlⅠ分別雙酶切pGEM-PM-VP2和pNDFL-VIIF/HN質(zhì)粒，將IBDV VP2基因克隆至pNDFL-ⅦF/HN載體中，構(gòu)建含有IBDV變異毒株VP2基因的重組NDV全長感染性克隆，將ApaⅠ和PmlⅠ雙酶切鑒定和測序正確的重組質(zhì)粒命名為pNDFL-ⅦF/HN-VP2(圖1)。

表1 引物序列及相關(guān)信息

圖1 含有VP2基因的重組NDV基因組全長感染性克隆構(gòu)建示意圖

1.4 重組NDV的拯救將BHK-21細胞培養(yǎng)于6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)生長至80%單層時，用表達T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒vTF7-3(MOI=1)感染細胞1 h，吸棄重組痘苗病毒vTF7-3感染物，然后將2 μg轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pNDFL-ⅦF/HN-VP2與2 μg 輔助質(zhì)粒pCIneo-NP-P-L按照Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明共轉(zhuǎn)染BHK-21細胞。轉(zhuǎn)染后24 h，棄去轉(zhuǎn)染混合物，用PBS洗滌細胞2次，加入含有2%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基繼續(xù)孵育至96 h，收獲培養(yǎng)物上清，接種10日齡的SPF雞胚并培養(yǎng)120 h，收獲HA陽性尿囊液即為拯救的重組病毒rChiLaSota-VP2。

1.5 rChiLaSota-VP2的鑒定

1.5.1rChiLaSota-VP2的RT-PCR鑒定 利用病毒基因組RNA提取試劑盒分別提取LaSota株尿囊液和rChiLaSota-VP2雞胚尿囊液的總RNA。針對IBDV VP2基因插入位點兩側(cè)基因序列設(shè)計鑒定引物JD-F： 5′-GGAAAATCAAGCGCCTTGCTC-3′和JD-R：5′-GACGATCGGAAATGCTAACAGG-3′，進行RT-PCR；對PCR產(chǎn)物進行序列測定，以鑒定IBDV VP2基因是否正確插入。

1.5.2rChiLaSota-VP2的Western blot鑒定 為了驗證rChiLaSota-VP2是否成功表達IBDV強毒株的VP2 蛋白，分別取rChiLaSota-VP2雞胚尿囊液、LaSota株雞胚尿囊液進行SDS-PAGE，將蛋白電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素(NC)膜上，以抗VP2單克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG為二抗進行Western blot，并利用ECL試劑盒進行顯色并拍照。

1.6 rChiLaSota-VP2的生物學(xué)特性分析為了評估重組NDV rChiLaSota-VP2的生物學(xué)特性，按照OIE標(biāo)準(zhǔn)測定第25代rChiLaSota-VP2的雞胚平均致死時間(MDT)、雞胚半數(shù)感染量(EID50)、1日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)(ICPI)及6周齡雞靜脈接種致病指數(shù)(IVPI)致病性指標(biāo)[19]。

1.7 rChiLaSota-VP2在雞胚中的生長特性分析將NDV LaSota疫苗株和第25代rChiLaSota-VP2按每胚102EID50的劑量分別接種10日齡SPF雞胚，在接種后24，48，72，96 h分別收獲雞胚尿囊液，測定EID50，分析LaSota株與rChiLaSota-VP2在雞胚中的生長特性差異。

2 結(jié)果

2.1 帶有IBDV VP2基因的重組NDV 感染性克隆的鑒定為了構(gòu)建表達IBDV流行變異株VP2基因的重組NDV，首先將完整的VP2基因克隆至含有基因Ⅶ型NDV F和HN基因的嵌合型LaSota株全長基因組轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pNDFL-ⅦF/HN中，獲得重組質(zhì)粒pNDFL-ⅦF/HN-VP2。利用限制性內(nèi)切酶ApaⅠ和PmlⅠ對pNDFL-ⅦF/HN-VP2進行酶切鑒定，結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒被切成16 093和2 884 bp 2個預(yù)期大小片段(圖2)，質(zhì)粒測序結(jié)果也與目的序列相符，證明重組質(zhì)粒pNDFL-ⅦF/HN-VP2構(gòu)建成功。

M.DL15000 DNA Marker；1. 重組質(zhì)粒pNDFL-ⅦF/HN-VP2；2. ApaⅠ、PmlⅠ酶切 重組質(zhì)粒pNDFL-ⅦF/HN-VP2圖2 重組質(zhì)粒pNDFL-ⅦF/HN-VP2的酶切鑒定

2.2 表達IBDV變異株VP2基因的重組NDV的拯救與鑒定為了拯救表達IBDV變異株VP2基因的重組NDV，首先用表達T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒感染BHK-21細胞，然后用pNDFL-ⅦF/HN-VP2和輔助質(zhì)粒pCIneo-NP-P-L 共轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染后96 h，收集細胞上清接種至10日齡SPF雞胚尿囊腔，接種后120 h收集HA陽性的雞胚尿囊液，拯救出重組病毒rChiLaSota-VP2。將拯救的重組NDV rChiLaSota-VP2在SPF雞胚中連續(xù)傳代10次，提取雞胚尿囊液中的病毒基因組RNA，利用針對VP2基因插入位點兩側(cè)基因序列的特異性引物進行RT-PCR對重組病毒進行鑒定。結(jié)果顯示，rChiLaSota-VP2模板中能夠擴增出重組病毒中包含VP2基因的1 681 bp預(yù)期大小片段，而LaSota株對照模板僅能擴增出325 bp預(yù)期大小片段(圖3)；同時，PCR產(chǎn)物序列的測定結(jié)果顯示重組病毒中插入的IBDV VP2基因序列正確。

M.DL2000 DNA Marker；1.NDV LaSota株的RT-PCR擴增產(chǎn)物；2.rChiLaSota-VP2的RT-PCR擴增產(chǎn)物圖3 重組NDV rChiLaSota-VP2的RT-PCR鑒定

2.3 rChiLaSota-VP2表達IBDV VP2蛋白的鑒定為驗證重組病毒rChiLaSota-VP2是否表達IBDV流行變異株的VP2蛋白，將收獲的rChiLaSota-VP2和LaSota株感染雞胚尿囊液進行 SDS-PAGE，然后分別用抗IBDV VP2蛋白單克隆抗體和HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG做為第一和第二抗體進行Western blot。圖4結(jié)果顯示，抗IBDV VP2單克隆抗體可以在rChiLaSota-VP2感染雞胚尿囊液中特異性檢測到與IBDV VP2蛋白的理論分子量大小一致的約48 kDa蛋白條帶，證明重組NDV rChiLaSota-VP2成功表達IBDV中國流行變異株的VP2 蛋白。

M.預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.重組病毒rChiLaSota-VP2尿囊液； 2.NDV LaSota株尿囊液圖4 重組病毒rChiLaSota-VP2表達VP2蛋白的鑒定

2.4 rChiLaSota-VP2的生物學(xué)特性分析為了確定將LaSota疫苗株的F和HN基因替換為Ⅶ型NDV的F和HN基因，以及插入IBDV VP2基因是否保留NDV LaSota株的優(yōu)良生物學(xué)特性，本研究參照OIE標(biāo)準(zhǔn)，對第25代rChiLaSota-VP2的生物學(xué)特性進行了分析。結(jié)果顯示，重組NDV rChiLaSota-VP2第25代雞胚毒的MDT為134 h，ICPI與IVPI均為0，表明重組病毒rChiLaSota-VP2具有與LaSota疫苗株類似的生物學(xué)特性，且遺傳穩(wěn)定性良好。

本研究比較了第25代重組NDV rChiLaSota-VP2與LaSota疫苗株在10日齡SPF雞胚中的復(fù)制動態(tài)。結(jié)果顯示， rChiLaSota-VP2與LaSota株保持相近的復(fù)制動態(tài)，可以在雞胚上高滴度繁殖，第25代重組NDV rChiLaSota-VP2的EID50最高可達10-8.16/100 μL(圖5)。

圖5 重組NDV rChiLaSota-VP2與LaSota株在SPF雞胚中的復(fù)制動態(tài)比較

3 討論

近年來由IBDV變異毒株引起的非典型IBD和基因Ⅶ型NDV導(dǎo)致的ND給中國養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟損失。我國目前雖然有用于防控IBD和ND的傳統(tǒng)多聯(lián)滅活疫苗，但尚未有同時防控IBDV變異株和基因Ⅶ型NDV感染的商品化多聯(lián)疫苗。研發(fā)能夠同時防控IBDV變異株引起的IBD和基因Ⅶ型NDV所致ND的新型高效、廉價多聯(lián)疫苗具有重要的現(xiàn)實意義。本研究利用NDV反向遺傳學(xué)技術(shù)平臺，在前期成功利用基因Ⅶ型NDV的HN和蛋白酶裂解位點附近氨基酸突變的F基因替換LaSota疫苗株的HN和F基因的基礎(chǔ)上，將我國流行的IBDV變異株的VP2抗原基因插入到含有基因Ⅶ型NDV F和HN基因的嵌合型LaSota株全長基因組轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pNDFL-ⅦF/HN中，獲得重組質(zhì)粒pNDFL-ⅦF/HN-VP2，并成功拯救出表達IBDV變異株VP2蛋白的重組NDV，將為滿足我國防控IBD和ND的現(xiàn)實需求奠定基礎(chǔ)。

傳統(tǒng)的多聯(lián)疫苗生產(chǎn)需要分別制備多種抗原，生產(chǎn)成本高，工藝繁瑣。動物病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展為研發(fā)廉價多聯(lián)疫苗提供了契機?；贜DV LaSota株良好的生物安全性和在雞胚中的高滴度復(fù)制特性，國內(nèi)外利用屬于基因Ⅱ型的NDV LaSota疫苗株作為載體構(gòu)建了表達包括IBDV VP2在內(nèi)的多種外源基因的基因工程多聯(lián)疫苗[20-24]。但基于LaSota株的疫苗不能對基因Ⅶ型NDV感染提供良好保護，以及我國雞群中普遍存在的高水平抗NDV LaSota株母源抗體等因素限制了基于LaSota株的重組活載體疫苗的臨床應(yīng)用。理論上利用致弱的基因Ⅶ型NDV作為載體可以彌補LaSota株載體疫苗的缺陷，但由于目前基因Ⅶ型NDV的致弱局限于通過改變F蛋白的蛋白酶裂解位點附近的幾個氨基酸(111～118 aa)來實現(xiàn)[25-26]，因而基于致弱的基因Ⅶ型NDV的載體活疫苗在使用過程中存在與自然毒株同源重組而發(fā)生毒力返強的風(fēng)險，本研究利用改造的基因Ⅶ型NDV的F和HN基因替換LaSota疫苗株的相應(yīng)基因的策略，不但避免了重組病毒毒力返強的風(fēng)險，同時又可以提供針對基因Ⅶ型NDV感染的防控，具有明顯的特色和優(yōu)勢。我們前期的研究證明，構(gòu)建的表達禽腺病毒血清4型Fiber2蛋白的重組NDV，即可以直接作為二聯(lián)活疫苗使用，又可以作為制備二聯(lián)滅活疫苗的種毒，從而實現(xiàn)培養(yǎng)一種病毒，即可制備二聯(lián)或多聯(lián)疫苗[27]。本研究結(jié)果證明，構(gòu)建的表達IBDV變異株VP2蛋白的重組rChiLaSota-VP2保留了LaSota 株的安全性和在雞胚中高滴度復(fù)制等生物學(xué)特性，提示其可以作為活疫苗使用，從而能夠誘導(dǎo)針對IBDV變異株和基因Ⅶ型NDV的黏膜免疫、體液免疫和細胞免疫等全方位免疫。也可以作為制備新城疫-傳染性法氏囊病二聯(lián)滅活疫苗的新型種毒，為制備更廉價的二聯(lián)或多聯(lián)疫苗奠定基礎(chǔ)。

總之，本研究成功構(gòu)建的表達流行IBDV變異株VP2基因重組病毒rChiLaSota-VP2，將為研發(fā)防控IBDV變異株和基因Ⅶ型NDV感染的新型高效、廉價二聯(lián)和多聯(lián)疫苗提供新思路，為有效防控IBD和ND提供新的輔助工具。