周倩宇,呂曉玲,王改麗,李 姿,賀文琦* (.吉林大學 動物醫(yī)學學院，吉林 長春 006；.山西農業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，山西 晉中 00800；.吉林省畜牧獸醫(yī)科學研究院，吉林 長春 006)

豬血凝性腦脊髓炎病毒(PHEV)屬于單鏈RNA病毒，是一種典型的嗜神經性冠狀病毒，主要感染哺乳期仔豬，引起腦脊髓炎和/或消化系統(tǒng)疾病，以嘔吐、衰竭及中樞神經系統(tǒng)障礙為特征[1-2]。該病毒攻擊宿主中樞神經系統(tǒng)的神經細胞，但其神經損傷機制尚不清楚[3]。肌動蛋白(F-actin)是真核細胞骨架的重要組成部分，神經細胞的突觸可塑性、胞質環(huán)流、神經遞質傳遞及信號轉導等均受其動態(tài)調節(jié)所驅動[4]。同時，細胞F-actin骨架重塑在防御病毒入侵、病毒胞內運輸及病毒粒子釋放過程中扮演重要的角色[5-7]。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)具有磷脂酰肌醇激酶活性和絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，通常為激活細胞整合素信號所必需的，參與特定病毒的入侵過程，如單純皰疹病毒1型(HSV-1)、愛潑斯坦-巴爾病毒(EBv)和腺病毒(adenovirus)[8-11]。哺乳動物中的絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt又稱蛋白激酶B，包括3種亞型Akt1、Akt2和Akt3，它們是PI3K信號轉導通路中的關鍵分子。PI3K調節(jié)亞基可與細胞膜上的相應受體結合，對其催化亞基進行激活以催化PIP3形成，隨后將Akt募集到細胞膜上而起作用[12-13]。同時，PI3K可通過下游Akt信號調控F-actin細胞骨架重塑過程[14]。盡管PHEV通過劫持整合素α5β1-黏著斑激酶(FAK)-絲切蛋白(CFL)信號調節(jié)神經細胞F-actin骨架已被證實[15]，但PI3K信號通路是否在這一過程中起作用尚不明確。

PI3K-Akt通路的下游調控因子眾多，其中Ras相關蛋白超家族研究較廣泛。Ras蛋白與信號轉導有關，Ras蛋白結合GDP時為失活態(tài)，結合GTP時為活化態(tài)。當細胞外存在信號分子時，Ras蛋白釋放出自身的GDP并結合GTP，從而由失活態(tài)向活化態(tài)轉變，最終實現將胞外信號向胞內傳遞。Ras相關蛋白超家族可分為3個亞家族Rho、Rac和Cdc42，它們可以利用鳥嘌呤核苷酸結合和水解循環(huán)發(fā)揮作用[16-18]。其中，小G蛋白Rho亞家族GTP酶成員A(Rho A)可以調節(jié)細胞骨架系統(tǒng)，特別是肌動蛋白CFL的功能[19]，已經被廣泛認可?；诖?，本研究擬探究PI3K-Akt-Rho A信號通路是否參與PHEV入侵宿主細胞過程以及該通路在PHEV入侵過程中的調控機制，有助于進一步闡明PHEV誘導神經損傷的致病機制，并尋找有吸引力的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞小鼠神經母細胞瘤細胞(N2a細胞，ATCC：CCL131)在DMEM(6%胎牛血清)中傳代培養(yǎng)。

1.2 病毒PHEV CC14毒株(GenBank：MF083115.1)由吉林大學動物醫(yī)學學院動物病理解剖實驗室保存，在N2a細胞中傳代繁殖。

1.3 主要試劑鼠源PHEV-N單克隆抗體，由本實驗室提取并保存；Cofilin(3318)、p-cofilin(3313)、PI3K(4255)、p-PI3K(4228)、Akt(4685)、p-Akt(4060)等單克隆抗體購于CST公司；GAPDH(60004-1)、FITC-phalloidin F-actin(SA00003-2)等單克隆抗體購于Proteintech公司；PI3K抑制劑(LY 294002)、Rho A抑制劑(CCG-1423)等購于GLPBIO公司；RNAiso-plus(9109)、SYBR Green qPCR試劑盒等購于TaKaRa公司。

1.4 蛋白質免疫印跡PHEV(MOI=1)孵育N2a細胞2 h，并給予藥物干預。細胞在RIPA緩沖液中裂解，12 000 r/min離心后，取上清液重懸于5×SDS-PAGE緩沖液中，并煮沸?？扇苄约毎呀猱a物在12% SDS-PAGE凝膠上分離，轉移到0.45 μm孔徑硝化纖維素膜上，用5%牛血清白蛋白封閉并孵育抗體。用ImageJ軟件進行灰度值分析。

1.5 熒光實時定量PCR(RT-qPCR)利用RNAiso-plus試劑提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，采用TaKaRa SYBR Green qPCR試劑盒進行RT-qPCR檢測。特異性引物：PHEV-P1，5′-TCT GGG AAT CCT GAC GAG C -3′；PHEV-P2，5′-AGG CGC TGC AAC ACT TAC-3′；GAPDH-P1，5′-CTC AAC TAC ATG GTC TAC ATG TTC-3′；GAPDH-P2，5′-ATT TGA TGT TAG TGG GGT CTC GCT C-3′。

1.6 間接免疫熒光將N2a細胞接種于細胞爬片，用信號分子抑制劑干預細胞后，再用PHEV孵育1 h，用0.1 mol/L PBS洗滌細胞3次，去除細胞表面未結合的病毒，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。用4%多聚甲醛和冷甲醇固定細胞，0.5% Triton X-100透膜處理，5% BSA封閉。孵育FITC-phalloidin特異性標記F-actin或PHEV-N一抗，Hoechst染核后于激光掃描共聚焦熒光顯微鏡(Olympus FluoView FV1000)下觀察。

1.7 統(tǒng)計學分析利用GraphPad Prism 5.0軟件進行數據分析，2組間差異用雙邊非配對t-test檢驗，3組及以上組間差異用單因素方差分析檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。*示P<0.05，**示P<0.01，***示P<0.001。

2 結果

2.1 PHEV入侵N2a細胞激活PI3K-Akt信號通路如圖1A所示，PHEV感染N2a細胞5 min時PI3K迅速發(fā)生磷酸化，隨后其磷酸化水平下降，并在20 min后磷酸化作用消失。檢測PI3K下游底物Akt活性發(fā)現，PHEV感染早期(5～15 min)Akt磷酸化水平較高，20 min后其活性逐漸下降(圖1B)。利用滅活的PHEV感染細胞后，PI3K磷酸化水平并未見顯著變化(圖1C)。該結果表明，PHEV入侵N2a細胞早期可迅速激活PI3K-Akt信號通路。

A，B.Western blot檢測PHEV入侵N2a細胞后PI3K/p-PI3K及Akt/p-Akt蛋白水平；C.Western blot檢測滅活PHEV入侵N2a細胞后p-PI3K和p-Akt蛋白水平圖1 病毒感染時PI3K和Akt蛋白水平變化

2.2 PI3K信號失活抑制PHEV入侵N2a細胞為了檢測PI3K-Akt信號通路對F-actin動態(tài)重塑及PHEV入侵的影響，使用PI3K特異性抑制劑LY294002(LY)預處理N2a細胞，然后接種PHEV 15 min。結果表明，PI3K抑制劑顯著抑制PHEV蛋白表達(圖2A)，并呈劑量依賴性抑制PHEV感染效率(圖2B)。免疫熒光標記研究表明，5 μmol/L LY可有效降低F-actin骨架結構的穩(wěn)定性，同時抑制病毒內化作用(圖2C)。上述研究證明，PI3K信號通路障礙可破壞F-actin骨架動態(tài)穩(wěn)定性從而抑制PHEV入侵N2a細胞。

A.Western blot檢測PHEV蛋白水平；B.RT-qPCR檢測PHEV mRNA水平；C.共聚焦顯微鏡觀察F-actin骨架及病毒入侵圖2 PHEV入侵及F-actin骨架重塑

2.3 Rho A調控PHEV入侵N2a過程前期研究已證實，PHEV入侵N2a細胞過程中cofilin(CFL)磷酸化和去磷酸化呈動態(tài)變化，CFL活性的動態(tài)變化可以引起F-actin骨架發(fā)生一系列變化[20]。為了研究PI3K信號通路中Rho GTP酶成員Rho A對F-actin骨架重塑和PHEV入侵的影響，我們用Rho A特異性抑制劑CCG-1423(CCG)對N2a細胞進行預處理，并接種PHEV。如圖3A所示，CCG-1423可使PHEV感染效率呈藥物濃度依賴性降低。免疫熒光檢測表明，1 μmol/L CCG-1423可降低病毒內化，并且降低F-actin骨架穩(wěn)定性(圖3B)。上述研究證明，在PHEV感染早期，增強Rho A信號可以調控PHEV入侵N2a細胞。

A.Rho A被抑制后p-CFL和PHEV的蛋白水平檢測；B.共聚焦顯微鏡觀察PHEV入侵圖3 Rho A對F-actin骨架重塑和PHEV入侵的影響

3 討論

前期研究工作已證實，PHEV入侵神經細胞可激活整合素α5β1-FAK-CFL信號通路，從而誘導細胞F-actin骨架動態(tài)重排[15]。PI3K對整合素信號敏感，且其效應底物Akt可以通過活化下游因子進一步調節(jié)細胞功能[21-22]。為了明確PHEV入侵N2a細胞時PI3K-Akt這一經典通路的激活狀態(tài)，本研究進行了系統(tǒng)地檢測。結果顯示PI3K/p-PI3K和Akt/p-Akt在PHEV感染早期出現動態(tài)變化，提示PHEV有效入侵可以激活PI3K-Akt信號通路。結合PI3K抑制劑處理及F-actin骨架形態(tài)學觀察，我們進一步證明PI3K-Akt信號通路可以調控PHEV入侵N2a細胞過程。

Rho A作為Rho家族中的一個成員，是調節(jié)細胞骨架重構的關鍵分子，激活后的Rho A可參與調節(jié)許多細胞形態(tài)和功能變化過程，包括細胞骨架的組裝、轉錄因子的激活、細胞周期的調節(jié)和屏障功能的調節(jié)等[23]。因此，Rho A又被稱為肌動蛋白細胞骨架和細胞形態(tài)異質性的分子開關。有研究證明PI3K-Akt信號調控F-actin骨架重塑過程與其下游Rho A信號密切相關[14,24]。因此Rho A信號分子

在PHEV入侵宿主細胞過程中可能發(fā)揮重要作用，本研究發(fā)現，抑制Rho A功能顯著降低PHEV感染效率，表明在PHEV感染早期，增強Rho A信號可以調節(jié)PHEV入侵N2a細胞。

綜上所述，本研究證實PHEV入侵能夠激活PI3K-Akt信號通路，且Rho A作為該信號通路的下游調控因子參與調控F-actin骨架穩(wěn)定性及PHEV入侵神經細胞過程。該研究為闡明PHEV誘導神經損傷性疾病的發(fā)病機制奠定了理論依據，并為抗病毒藥物篩選提供了潛在靶標。