鄧聿杉，徐 鶯

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 成都 610065)

1 引 言

核糖體失活蛋白(Ribosome-inactivating proteins,RIPs)是一種rRNA N-糖苷酶，它能夠催化28S rRNA特定位點(diǎn)上腺嘌呤的糖苷鍵斷裂從而抑制蛋白質(zhì)的正常合成[1].此外，這種蛋白還具有抗病毒，抗腫瘤，抗真菌等多種生物學(xué)活性，因此也受到了科研人員的廣泛關(guān)注[2].

Curcin和Curcin C均是從麻瘋樹(Jatrophacurcas)中分離得到的核糖體失活蛋白.1976年Stripe首次從麻瘋樹胚乳中分離出Curicn[3]，Barbieri等人將其鑒定為Ⅰ型RIPs[4].2017年Zhang等人從麻瘋樹的子葉中分離純化出了一種新型的RIP并將其命名為Curcin C[5].研究表明，兩種蛋白體外翻譯抑制的IC50分別是0.19 nmol/L和0.05 nmol/L，這表示它們兩者之間的N-糖苷酶活性可能存在差異[5,6].為了了解Curcin和Curcin C N-糖苷酶活性的主要差異，我們實(shí)驗(yàn)室于2019年通過SWISS_MODEL對(duì)兩種蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測，并使用AutoDock將兩種蛋白與腺嘌呤進(jìn)行了分子對(duì)接，通過LigPlot+對(duì)腺嘌呤與Curcin及Curcin C之間的互作方式進(jìn)行了分析.受限于當(dāng)時(shí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測技術(shù)的不成熟，預(yù)測得到的三級(jí)結(jié)構(gòu)質(zhì)量并不高.此外，當(dāng)時(shí)在進(jìn)行分子對(duì)接前并未對(duì)Curcin及Curicn C的活性位點(diǎn)信息進(jìn)行預(yù)測而是直接進(jìn)行對(duì)接，這也導(dǎo)致了對(duì)接結(jié)果并不理想，最終得到的互作方式和其它已知RIPs與腺嘌呤的互作模式之間具有明顯差異.

如今，許多結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域的生物信息學(xué)軟件不斷被開發(fā)出來，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測技術(shù)也愈發(fā)成熟，這為完善之前的研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)條件.為了得到更加準(zhǔn)確的結(jié)論，本文使用新的蛋白質(zhì)預(yù)測方法對(duì)Curcin和CurcinC的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，使用質(zhì)量評(píng)估軟件對(duì)預(yù)測結(jié)果進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)估，在對(duì)接前預(yù)測了兩種蛋白活性位點(diǎn)的氨基酸組成信息，最后使用分子對(duì)接方法探究了Curcin和Curcin C與腺苷及腺嘌呤之間的相互作用模式，并對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行了比較分析，為闡明兩種蛋白N-糖苷酶活性差異的潛在機(jī)制提供了更為可靠的理論基礎(chǔ).

麻瘋樹核糖體失活蛋白Curcin(Genbank登記號(hào)：NP_001295744.1)和Curicn C(Genbank登記號(hào)：XP_012074358.2)的氨基酸序列從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中檢索獲得.蓖麻毒素A鏈與腺嘌呤的晶體復(fù)合體結(jié)構(gòu)從PDB數(shù)據(jù)庫(PDBID：2p8n)中檢索獲得.

2.2 方 法

2.2.1 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件trRosetta[7]預(yù)測Curcin和Curcin C的三級(jí)結(jié)構(gòu).

2.2.2 模型質(zhì)量評(píng)估 為了確保預(yù)測得到的蛋白質(zhì)模型具備較高的質(zhì)量以保證后續(xù)分析結(jié)果的有效性，本文采用PROCHECK[8]及Qmean[9]兩款質(zhì)量評(píng)估軟件對(duì)預(yù)測模型進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)估.

2.2.3 小分子配體的預(yù)處理 從PubChem數(shù)據(jù)庫中下載腺嘌呤的2D結(jié)構(gòu)，使用Chem3D將2D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為mol2格式后進(jìn)行能量最小化處理.

2.2.4 活性位點(diǎn)信息預(yù)測 使用UCSF Chimerav.1.12.1[10]預(yù)測Curcin和Curcin C的活性位點(diǎn)信息：使用MatchMaker將Ricin分別與Curcin和Curcin C進(jìn)行蛋白質(zhì)疊合，并基于結(jié)構(gòu)進(jìn)行序列比對(duì)，以Ricin活性位點(diǎn)信息為參考預(yù)測Curcin和Curcin C的活性位點(diǎn)信息.

2.2.5 分子對(duì)接 分子對(duì)接使用AutoDock4.2，預(yù)測Curcin和Curcin C與腺苷及腺嘌呤之間的相互作用模式.對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理：加氫，計(jì)算電荷，轉(zhuǎn)換為PDBQT格式；根據(jù)預(yù)測得到的活性位點(diǎn)信息設(shè)置GridBox.受體蛋白設(shè)置為剛性，小分子配體設(shè)置為柔性.對(duì)接算法選用遺傳算法(Genetic Alogorithm)尋找配體合適的結(jié)合取向.

3 結(jié)果與分析

3.1 Curcin和Curcin C的三級(jí)結(jié)構(gòu)的質(zhì)量評(píng)估

采用PROCHECK和Qmean兩款質(zhì)量評(píng)估軟件對(duì)Curcin和Curcin C的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖1a，圖1b)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估.PROCHECK的評(píng)估結(jié)果以拉氏圖的形式呈現(xiàn)給用戶，結(jié)果顯示Curcin的所有氨基酸殘基中有89.4%位于拉氏圖的最可信區(qū)域，10.3%的氨基酸殘基位于次級(jí)可信區(qū)域，0.4%的氨基酸位于不可信區(qū)域(圖1c).Curcin C的所有氨基酸中有86.3%位于拉氏圖的最可信區(qū)域，13.4%的氨基酸位于次可信區(qū)域，0.4%的氨基酸位于允許區(qū)域(圖1D).通常情況下蛋白質(zhì)模型的氨基酸殘基中位于最可信區(qū)域及次級(jí)可信區(qū)域的氨基酸總數(shù)占比超過90%就表示被評(píng)估的結(jié)構(gòu)具備較高的質(zhì)量.Qmean將評(píng)估對(duì)象與PDB數(shù)據(jù)庫中具有類似大小的非冗余結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，評(píng)估結(jié)果同樣以圖表形式返回給用戶，同時(shí)還會(huì)將評(píng)估結(jié)果量化為Qmean Z-Score.Qmean評(píng)估結(jié)果顯示，Curcin和Curcin C模型的Z-Score得分分別為-0.01和-1.16，兩者的得分都位于|Z-Score|<2的范圍內(nèi)(圖1E,圖1F)，這意味著兩種蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)也同樣通過了Qmean的質(zhì)量評(píng)估.PROCHECK及Qmean的評(píng)估結(jié)果一致顯示Curcin的模型質(zhì)量要略高于Curcin C，但兩者的三級(jí)結(jié)構(gòu)都通過了兩款軟件的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，因此trRosetta預(yù)測得到的兩種蛋白質(zhì)模型都具備較高質(zhì)量，可以用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析.

圖1 基于trRosetta預(yù)測的Curcin和Curcin C三維結(jié)構(gòu)示意圖

3.2 Curcin和Curcin C的活性位點(diǎn)的預(yù)測

在分子對(duì)接之前需要確定腺嘌呤與Curcin和CurcinC結(jié)合的活性位點(diǎn)才能確保對(duì)接結(jié)果具有更高的準(zhǔn)確性.本文采用UCSF Chimera v.1.12.1軟件以RicinA鏈為參考模型，將RicinA與Curcin和CurcinC基于結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)(圖2)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果及RicinA的活性位點(diǎn)信息預(yù)測得到了兩種蛋白活性位點(diǎn)的氨基酸組成信息.預(yù)測結(jié)果顯示，Curcin和CurcinC活性位點(diǎn)處的氨基酸組成完全一致，分別由Ala117，Tyr118，Leu119，Phe131，Gly157，Ser158，Tyr159，Pro208，Glu209以及Arg212共10個(gè)氨基酸組成.

圖2 Ricin C原子與Curcin和Curcin C疊加的立體帶狀圖

3.3 與腺苷及腺嘌呤分子的對(duì)接研究

為了比較Curcin及Curcin C的活性位點(diǎn)在發(fā)揮N-糖苷酶活性過程中的結(jié)構(gòu)差異，本文將Curcin與Curcin C分別與腺苷及腺嘌呤兩種底物進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)反應(yīng)前后的兩種狀態(tài)進(jìn)行對(duì)接分析.對(duì)接結(jié)果選用LigPlot+進(jìn)行可視化分析(圖3).經(jīng)AutoDock計(jì)算，Curcin與腺嘌呤之間的結(jié)合能大小為-4.92 KJ/mol,參與氫鍵相互作用的氨基酸分別是Leu119和Gly157，參與疏水相互作用的氨基酸有Ala117,Tyr118,Tyr159，Phe162以及Ile204.Curcin C與腺嘌呤之間的結(jié)合能大小為-5.18 KJ/mol，參與氫鍵相互作用的氨基酸有Leu119，Gly157以及Arg212,參與疏水相互作用的氨基酸有Tyr118，Phe131，Tyr159以及Ile204.不難發(fā)現(xiàn)，Curcin C與腺嘌呤之間的結(jié)合能要低于Curcin，但兩者之間結(jié)合能大小差異并不明顯，還不足以造成兩者在體外翻譯抑制能力上產(chǎn)生明顯差異.因此，兩種蛋白與腺嘌呤之間的結(jié)合能差異可能只是導(dǎo)致兩者體外翻譯抑制能力上產(chǎn)生明顯差異的原因之一.

圖3 Curcin和Curcin C與腺苷及腺嘌呤的相互作用示意圖

Curcin與腺苷之間的結(jié)合能大小為-5.65 KJ/mol，參與氫鍵相互作用的氨基酸有Tyr118,Leu119,Gly157,Glu209和Glu238,參與疏水相互作用的氨基酸殘基有Tyr159,Ile204和Arg212.Curcin C與腺苷之間的結(jié)合能大小為-6.07 KJ/mol，參與氫鍵相互作用的氨基酸殘基有Tyr118,Leu119,Glu209,Arg212和Glu238,參與疏水相互作用的氨基酸有Gly157,Tyr159和Ile204.可以發(fā)現(xiàn)兩種RIPs與腺苷的結(jié)合能均低于腺嘌呤.

通過Curcin和Curcin C對(duì)接結(jié)果的比較分析，我們還發(fā)現(xiàn)Curcin和Curicn C與腺苷及腺嘌呤的相互作用模式具有較高的相似性，但是Curcin在與兩種配體互作時(shí)都缺少一個(gè)關(guān)鍵氨基酸Arg的參與,而Arg在RIPs的活性位點(diǎn)中往往起著非常重要的作用.為了進(jìn)一步探究Curcin與腺嘌呤相互作用時(shí)Arg缺失的原因，我們將Curcin和Curcin C結(jié)合口袋中Arg與底物腺嘌呤中N3原子之間的距離進(jìn)行了測量(圖4).結(jié)果顯示Curcin中Arg與腺嘌呤的N3原子之間的最短距離為3.5 ?而Curcin C中Arg與N3原子之間的距離為2.79 ?，這意味著Curcin中Arg與腺嘌呤相互作用的缺失很有可能是因?yàn)閮烧咴诰嚯x上相距較遠(yuǎn)造成的，這會(huì)影響Arg對(duì)N3原子的質(zhì)子化作用從而阻礙N-糖苷酶反應(yīng)的正向進(jìn)行.

圖4 腺嘌呤N3原子與Curcin和Curcin C活性位點(diǎn)處Arg的距離測量示意圖

4 討 論

相較于先前的實(shí)驗(yàn)，本次研究所采用的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件trRosetta預(yù)測得到的Curcin和CurcinC模型的質(zhì)量更高，PROCHECK評(píng)估結(jié)果顯示Curcin和CurcinC位于不可信區(qū)域以外的氨基酸占比分別為99.6%和100%(之前研究中Curcin和Curcin C的占比分別為98.1%和97.8%).此外，兩個(gè)蛋白模型都通過了Qmean的質(zhì)量評(píng)估(之前研究中Curcin和Curcin C都未通過).這表明本次實(shí)驗(yàn)所使用的三級(jí)結(jié)構(gòu)質(zhì)量更高，使用該模型進(jìn)行后續(xù)分析得到的結(jié)論也應(yīng)該更具有說服力.本次研究還加入了活性位點(diǎn)預(yù)測的步驟，活性位點(diǎn)是小分子配體與受體結(jié)合的位置，該位置的確定能夠進(jìn)一步限制對(duì)接空間，有效降低了小分子配體在活性位點(diǎn)之外結(jié)合的概率，進(jìn)而提高對(duì)接結(jié)果的精確度.此外，本次實(shí)驗(yàn)不僅考慮了反應(yīng)后受體與配體的相互作用，即腺嘌呤與Curcin及Curcin C的相互作用，還考慮了反應(yīng)前受體與配體之間的相互作用，將腺苷與兩種RIPs進(jìn)行了分子對(duì)接，分析了造成Curcin與Curcin C N-糖苷酶活性差異的可能原因，從N-糖苷酶機(jī)制入手對(duì)活性位點(diǎn)處的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行了分析.

從對(duì)接結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)，Curcin和Curcin C與腺苷之間的結(jié)合能普遍低于腺嘌呤，通常情況下結(jié)合能越低產(chǎn)物越穩(wěn)定，這就意味著Curicn與Curcin C更容易與腺苷相結(jié)合.理論上，在RIPs發(fā)揮脫嘌呤作用時(shí)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的底物應(yīng)該是完整的腺苷，糖苷鍵斷裂后形成才形成了腺嘌呤與RIP的復(fù)合體，隨后腺嘌呤從結(jié)合口袋中脫落，RIP再與其它RNA的腺苷結(jié)合進(jìn)行下一次的催化.這就意味著在RIP催化N-糖苷酶反應(yīng)的過程中腺嘌呤與腺苷之間存在一種競爭抑制的關(guān)系，如果RIP與腺苷之間的結(jié)合能低于腺嘌呤則有利于反應(yīng)的正向進(jìn)行，若兩者的結(jié)合能相近則會(huì)阻礙下一次反應(yīng)的開始.Curcin與腺嘌呤及腺苷的結(jié)合能相差0.73 KJ/mol，Curcin C與腺嘌呤和腺苷之間的結(jié)合能相差0.89 KJ/mol，可以看出Curcin C與腺苷及腺嘌呤之間結(jié)合能的差異更加明顯，這可能會(huì)導(dǎo)致腺苷在與腺嘌呤競爭Curcin C的活性位點(diǎn)時(shí)更加占據(jù)優(yōu)勢，進(jìn)而提升了Curicn C的N-糖苷酶活性.

Frankel等人利用x射線結(jié)構(gòu)指導(dǎo)了一系列Ricin的定向突變實(shí)驗(yàn),他們發(fā)現(xiàn)Arg和Glu在RIPs發(fā)揮N-糖苷酶作用的過程中起著非常重要的作用[11].當(dāng)Ricin中Arg 180轉(zhuǎn)化為Gln時(shí)(R180Q)N-糖苷酶活性會(huì)降低2500倍，Glu 177轉(zhuǎn)化為Gln(E177Q)活性降低至少170倍.這與Arg的質(zhì)子化作用有關(guān)，研究表明，質(zhì)子化作用可以明顯降低N-糖苷鍵離子解離通道所需要的能量，降低其水解所需的活化能，穩(wěn)定水解產(chǎn)物，極大的促進(jìn)N-糖苷鍵的水解.RIP在與底物結(jié)合時(shí),Arg就可以使腺苷的N3原子質(zhì)子化，從而促進(jìn)了N-糖苷鍵的水解.當(dāng)N-糖苷鍵斷裂后，腺嘌呤環(huán)上會(huì)聚集負(fù)電荷，堿基會(huì)聚集正電荷，Arg的質(zhì)子化作用恰好可以中和腺嘌呤上的負(fù)電荷，Glu則促使水分子水解，水解產(chǎn)物氫氧根離子平衡堿基上的正電荷，最終達(dá)到使產(chǎn)物穩(wěn)定的作用[12].從受體與配體之間的結(jié)合方式來看，Curcin在與兩種配體互作時(shí)都缺少一個(gè)關(guān)鍵氨基酸Arg的參與,測量結(jié)果顯示Curcin活性位點(diǎn)處Arg與腺嘌呤之間的距離要遠(yuǎn)于Curcin C.因此，Arg在Curcin和Curcin C活性位點(diǎn)處所處的位置也是造成兩者N-糖苷酶活性差異的重要原因.

最終通過對(duì)接結(jié)果的比較分析，我們找到了三個(gè)可能造成Curcin C擁有更強(qiáng)N-糖苷酶活性的潛在原因.1.Curcin C與腺嘌呤及腺苷的結(jié)合能都要低于Curcin；2.Curcin與腺嘌呤結(jié)合時(shí)，活性位點(diǎn)處的Arg與腺嘌呤的N3原子距離較遠(yuǎn)，不利于質(zhì)子化作用，不利于N-糖苷鍵的水解；3.Curcin C與腺苷及腺嘌呤之間的結(jié)合能差異更大，腺苷相較于腺嘌呤對(duì)活性位點(diǎn)具有更強(qiáng)的競爭力，有利于Curcin C在反應(yīng)結(jié)束后快速參與到下一次反應(yīng)中.