李艷張曉琳韋園園溫淑娟林興黃權(quán)芳

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧530021； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧530023）

肝纖維化是肝臟對(duì)各種慢性刺激進(jìn)行的損傷修復(fù)反應(yīng)，也是以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）在肝內(nèi)大量沉積的病理過(guò)程［1-2］。肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）是ECM 的主要來(lái)源，在肝纖維化的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用［3］?；罨腍SCs 可通過(guò)在肝損傷部位移行、增殖，表達(dá)各種信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，并產(chǎn)生大量細(xì)胞因子和以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)成分，是肝纖維化形成的始動(dòng)環(huán)節(jié)［4］。PI3K／Akt／mTOR 通路是參與肝纖維化發(fā)生發(fā)展的重要信號(hào)傳導(dǎo)通路之一［5］，可調(diào)節(jié)HSCs 增殖、活化和凋亡，是目前治療肝纖維化較有效的干預(yù)靶點(diǎn)［3］。

中藥具有多成分、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，對(duì)病理復(fù)雜的肝纖維化可發(fā)揮綜合優(yōu)勢(shì)［6］。委陵菜是薔薇科植物委陵菜Potentilla chinensisSer.的全草，在前期對(duì)委陵菜進(jìn)行化學(xué)成分提取、分離及其活性成分篩選研究中，得到委陵菜酸，并在LPS／D-GalN 誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型中發(fā)現(xiàn)，委陵菜酸可降低炎癥相關(guān)因子的表達(dá)，抑制NF-κB 活性，減輕肝組織病理的損傷程度［7］。本研究以PI3K／Akt／mTOR 信號(hào)通路為切入點(diǎn)，探討委陵菜酸對(duì)血小板衍生因子-BB（platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB）誘導(dǎo)活化的肝星狀細(xì)胞LX-2 的抗纖維化作用機(jī)制，為其治療肝纖維化提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 人肝星狀細(xì)胞株LX-2 購(gòu)自上海美軒生物科技有限公司。

1.2 試劑與藥物 人PDGF-BB（美國(guó)PeproTech 公司，批號(hào) 0507CY420 ）；PI3K 抑制劑 LY294002（美 國(guó)Medchemexpress 公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司）；胎牛血清（澳大利亞AusGeneX 公司）；兔抗Collagen-I 多克隆抗體、鼠抗PI3K 多克隆抗體、兔抗mTOR多克隆抗體（美國(guó)Proterntech 公司）；兔抗磷酸化PI3K 多克隆抗體（美國(guó)Signalway Antibody 公司，批號(hào)5602）；兔抗Akt 多克隆抗體、兔抗磷酸化Akt 多克隆抗體、兔抗磷酸化mTOR 多克隆抗體、兔抗P70S6K 多克隆抗體、兔抗磷酸化P70S6K 多克隆抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司）；BCA 試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Western 轉(zhuǎn)膜液、封閉液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；聚偏氟乙烯（PVDF）膜（美國(guó)Millipore 公司，批號(hào)R5HA8393E）。委陵菜酸（純度90.08%），提取分離參照前期研究方法［7］。

1.3 儀器 超微量分光光度計(jì)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；7300 熒光定量PCR 儀（美國(guó)Applied Biosystem 公司）；雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（美國(guó)LICOR 公司）。

2 方法

2.1 委陵菜酸的配制 稱(chēng)取適量委陵菜酸加入DMSO 溶解，配置成濃度10 mmol／L 的溶液，用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 設(shè)置6 個(gè)組，分別為正常組、刺激組（PDGF-BB 20 ng／mL）、LY294002 組（PDGF-BB 20 ng／mL ＋LY294002 20 μmol／L）和委陵菜酸高、中、低劑量組（PDGF-BB 20 ng／mL＋委陵菜酸35、25、15 μmol／L）。將LX-2 細(xì)胞株置于含10% 胎牛血清、1% 青霉素-鏈霉素的1640 培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，每1～2 d 更換培養(yǎng)液。待細(xì)胞生長(zhǎng)至單層致密狀，棄培養(yǎng)液，PBS 洗2次，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代或凍存。

2.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LX-2 細(xì)胞接種于96 孔板培養(yǎng)24 h，加入委陵菜酸（10～60 μmol／L）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入MTT 溶液10 μL，使用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)測(cè)各孔光密度（OD）值，計(jì)算半抑制濃度（IC50）。LX-2 細(xì)胞接種于96 孔板，除正常組外，其余各組用20 ng／mL PDGF-BB 預(yù)處理30 min，刺激組加入完全培養(yǎng)基，藥物組分別加入15、25、35 μmol／L 委陵菜酸和20 μmol／L 的LY294002，作用24 h 后棄去原培養(yǎng)基，每孔加入90 μL 無(wú)血清培養(yǎng)基和10 μL MTT 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基后加入100 μL DMSO，使用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)每個(gè)孔的OD值，計(jì)算抑制率。

2.4 LDH 活性的檢測(cè) 將LX-2 細(xì)胞以每孔1×104個(gè)的密度接種于96 孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁后，按“2.3”項(xiàng)下分組和給藥，培養(yǎng)24 h。收集上清液，按說(shuō)明書(shū)步驟處理后，使用酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測(cè)OD值，并對(duì)細(xì)胞LDH 值進(jìn)行量化［8］。

2.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LX-2 細(xì)胞接種于6 孔板，待細(xì)胞貼壁后，用槍頭垂直于直尺，對(duì)單層細(xì)胞劃出一條無(wú)細(xì)胞的刮除帶，用PBS 洗去劃下的細(xì)胞后，按“2.3”項(xiàng)下分組和給藥，并分2 個(gè)時(shí)間段（0、24 h）觀察并拍照［9］。

2.6 集落生成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LX-2 細(xì)胞接種于6 孔板，細(xì)胞密度為每孔500 個(gè)。第2 天更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，同步化饑餓細(xì)胞6 h。按“2.3”項(xiàng)下分組和給藥，將6 孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)7 d，用0.1%結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞固定染色，在顯微鏡下觀察菌落大小和數(shù)量等集落的生成情況。50 個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，計(jì)為1 個(gè)集落。

2.7 RT-qPCR 法檢測(cè)相關(guān)基因mRNA 表達(dá) 收集各組細(xì)胞，采用Trizol 一步法提取細(xì)胞RNA，用超微量分光光度法檢測(cè)總RNA 濃度，并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。采用PCR儀以20 μL 體系開(kāi)始擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸31 s，循環(huán)40次［10］，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列表

2.8 蛋白免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加入含RIPA 緩沖液、1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑的裂解液裂解細(xì)胞，冰面上靜置10 mim，離心取上清液［11］，即得，用BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。用10% SDSPAGE 凝膠將蛋白質(zhì)按分子量大小進(jìn)行分離，電泳結(jié)束后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，封閉后與一抗4 ℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的大鼠IgG 二抗孵育，免疫反應(yīng)帶的強(qiáng)度用雙色紅外熒光掃描成像測(cè)定，采用Image-Pro Plus 圖像分析管理系統(tǒng)分析［7］。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行處理，結(jié)果以（）表示，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，方差齊則采用單因素方差分析；方差不齊則采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 委陵菜酸對(duì)PDGF-BB 刺激LX-2 細(xì)胞LDH 活性的影響 委陵菜酸對(duì)LX-2 細(xì)胞IC50為43.287 μmol／L。與刺激組比較，藥物干預(yù)后LX-2 細(xì)胞LDH 活性隨濃度增加而升高（P＜0.01），對(duì)細(xì)胞有一定毒性，見(jiàn)表2。

表2 委陵菜酸對(duì)PDGF-BB 刺激LX-2 細(xì)胞LDH 活性的影響（， n＝3）

表2 委陵菜酸對(duì)PDGF-BB 刺激LX-2 細(xì)胞LDH 活性的影響（， n＝3）

注：與正常組比較，＃P＜0.05；與刺激組比較，**P＜0.01。

3.2 委陵菜酸對(duì)PDGF-BB 刺激LX-2 細(xì)胞增殖的影響 與正常組比較，20 ng／mL PDGF-BB 促進(jìn)LX-2 細(xì)胞的增殖（P＜0.01）；與刺激組比較，委陵菜酸和LY294002 對(duì)PDGF-BB 引起的細(xì)胞增殖具有抑制作用（P＜0.01），并呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)表3。

表3 委陵菜酸對(duì)PDGF-BB 刺激LX-2 細(xì)胞增殖的影響（， n＝5）

表3 委陵菜酸對(duì)PDGF-BB 刺激LX-2 細(xì)胞增殖的影響（， n＝5）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與刺激組比較，**P＜0.01。

3.3 委陵菜酸對(duì)PDGF-BB 刺激LX-2 細(xì)胞活化的影響 與正常組比較，PDGF-BB 刺激后LX-2 細(xì)胞Col-Ⅰ蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），表明LX-2 細(xì)胞已被激活；與刺激組比較，委陵菜酸干預(yù)能抑制活化的LX-2 細(xì)胞Col-Ⅰ蛋白表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，見(jiàn)圖1。與刺激組比較，委陵菜酸干預(yù)能抑制Col-Ⅰ和Col-ⅢmRNA 表達(dá)（P＜0.01），見(jiàn)表4。

表4 委陵菜酸對(duì)PDGF-BB 刺激LX-2 細(xì)胞Col-Ⅰ和Col-ⅢmRNA 表達(dá)的影響（， n＝3）

表4 委陵菜酸對(duì)PDGF-BB 刺激LX-2 細(xì)胞Col-Ⅰ和Col-ⅢmRNA 表達(dá)的影響（， n＝3）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與刺激組比較，**P＜0.01。

圖1 委陵菜酸對(duì)PDGF-BB 激活的LX-2 細(xì)胞Col-Ⅰ蛋白表達(dá)的影響（， n＝3）

3.4 委陵菜酸對(duì)PDGF-BB 刺激LX-2 細(xì)胞遷移的影響 如圖2、表5 所示，與正常組比較，刺激組LX-2 細(xì)胞遷移距離增加（P＜0.01），PDGF-BB 促進(jìn)了LX-2 細(xì)胞的遷移；與刺激組比較，各給藥組LX-2 細(xì)胞遷移距離縮短（P＜0.01），委陵菜酸對(duì)PDGF-BB 刺激LX-2 細(xì)胞遷移具有抑制作用，且呈劑量依賴(lài)性。

表5 委陵菜酸對(duì)PDGF-BB 刺激LX-2 細(xì)胞遷移的影響（， n＝3）

表5 委陵菜酸對(duì)PDGF-BB 刺激LX-2 細(xì)胞遷移的影響（， n＝3）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與刺激組比較，**P＜0.01。

圖2 各組LX-2 細(xì)胞遷移的情況（×100）

3.5 委陵菜酸對(duì)PDGF-BB 刺激LX-2 細(xì)胞集落形成的影響 如圖3、表6 所示，與正常組比較，PDGF-BB 促進(jìn)了LX-2 細(xì)胞的集落形成（P＜0.01）；與刺激組比較，藥物干預(yù)可抑制LX-2 細(xì)胞的集落形成（P＜0.01），其抑制率呈劑量依賴(lài)性。

圖3 各組LX-2 細(xì)胞集落形成的情況

表6 委陵菜酸對(duì)PDGF-BB 刺激LX-2 細(xì)胞集落形成的影響（， n＝3）

表6 委陵菜酸對(duì)PDGF-BB 刺激LX-2 細(xì)胞集落形成的影響（， n＝3）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與刺激組比較，**P＜0.01。

3.6 委陵菜酸對(duì)PDGF-BB 刺激LX-2 細(xì)胞PI3K／Akt／mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 如圖4 所示，與正常組比較，PDGF-BB 刺激上調(diào)了LX-2 細(xì)胞p-Akt、p-PI3K、P70S6K、p-FAK、p-mTOR 蛋白表達(dá)（P＜0.05）；與刺激組比較，藥物干預(yù)下調(diào)了LX-2 細(xì)胞p-Akt、p-PI3K、P70S6K、p-FAK、p-mTOR 蛋白表達(dá)（P＜0.01），且呈劑量依賴(lài)性。

圖4 委陵菜酸對(duì)PDGF-BB 刺激LX-2 細(xì)胞PI3K／Akt／mTOR 信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響（， n＝3）

4 討論

肝纖維化是各種慢性肝臟疾病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段［4］。HSCs 在肝纖維化過(guò)程中扮演著重要角色，其活化、增殖是肝纖維化形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［12］。在正常情況下，HSCs處于靜息狀態(tài)，主要負(fù)責(zé)儲(chǔ)存維生素A，當(dāng)受到外界刺激時(shí)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，胞內(nèi)的維生素A 消失，HSCs 發(fā)生活化，轉(zhuǎn)變成為肌成纖維樣細(xì)胞［13］，活化的HSCs 增殖、遷移和收縮能力增強(qiáng)，以膠原為主的ECM 釋放增加，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生［5］。因此，抑制HSCs 細(xì)胞活化和減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的關(guān)鍵。PDGF-BB 是對(duì)HSCs有效的激活劑，當(dāng)肝臟受到刺激時(shí)，PDGF 被HSCs 以自分泌或旁分泌途徑被釋放，HSCs 的PDGF 受體被誘導(dǎo)至細(xì)胞表面，二者形成一個(gè)有效的正反饋環(huán)，不斷激活HSCs［14］，同時(shí)PDGF 還可激活下游PI3K、ERK 和其他途徑的信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)其增殖、遷移和分泌ECM［12］。通過(guò)PDGF-BB 刺激HSCs后，加入委陵菜酸24 h，發(fā)現(xiàn)LX-2 細(xì)胞增殖被抑制。提示委陵菜酸對(duì)活化的LX-2 細(xì)胞有抑制作用。

HSCs 活化后，增殖和遷移能力增強(qiáng)［14］。PDGF-BB 刺激后LX-2 細(xì)胞的增殖率和遷移率升高；LY294002 和委陵菜酸均能抑制LX-2 細(xì)胞的增殖和遷移，并呈劑量依賴(lài)性。提示委陵菜酸具有抑制LX-2 細(xì)胞增殖和遷移的能力。

HSCs 細(xì)胞表型發(fā)生轉(zhuǎn)化后，合成ECM 的能力增加，大量Col-Ⅰ和Col-Ⅲ因溶解失衡而過(guò)度沉積，從而造成肝纖維化的發(fā)生［5］，膠原水平的高低可以反映肝纖維化程度。PDGF-BB 刺激后LX-2 細(xì)胞Col-Ⅰ表達(dá)增加，委陵菜酸干預(yù)能下調(diào)Col-I 蛋白表達(dá)，且可降低Col-Ⅰ和Col-ⅢmRNA 表達(dá)。提示委陵菜酸能抑制HSCs 的ECM 過(guò)度沉積及膠原的形成，從而達(dá)到抗肝纖維化的作用。

PI3K／Akt／mTOR 信號(hào)通路在促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化，促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲，抗凋亡以及肝纖維化的發(fā)展中發(fā)揮重要作用［9］。PI3K 是細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)通路中一個(gè)重要的激酶，當(dāng)PDGF 與相應(yīng)的配體結(jié)合后，能與PI3K 85 kDa 亞基結(jié)合，使其發(fā)生磷酸化活化［15］，磷酸化的PI3K 促進(jìn)Akt聚集于細(xì)胞膜上并被活化，活化的Akt 可直接磷酸化mTOR致其激活，mTOR 激活后可通過(guò)下游核糖體S6 蛋白激酶通路調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖［15］。細(xì)胞粘附斑激酶可作為PI3K／Akt／mTOR 信號(hào)通路上游刺激因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)［8］。PDGF-BB 刺激24 h，LX-2 細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt、pmTOR、p-FAK 蛋白表達(dá)上調(diào)，PI3K／Akt 通路被激活。委陵菜酸和LY294002 干預(yù)下調(diào)了細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt、pmTOR、p-FAK 蛋白表達(dá)。提示委陵菜酸能夠抑制HSCs 活化和增殖、減少膠原沉積，其機(jī)制可能與抑制PI3K／Akt／mTOR 信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，委陵菜酸可通過(guò)PI3K／Akt／mTOR 信號(hào)途徑有效抑制HSCs 活化，起到抗纖維化的作用。