蔣萬(wàn)威 楊國(guó)輝

貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550004

心臟是膿毒癥常見(jiàn)的靶器官，超過(guò)1/4 的膿毒癥 心肌損傷患者在28 d 內(nèi)死亡[1-2]。超過(guò)10%的患者可進(jìn)一步發(fā)展為膿毒癥性心肌病，長(zhǎng)期影響患者的心臟功能[3-4]。自噬作為機(jī)體在應(yīng)激時(shí)的保護(hù)機(jī)制之一，可清除受損細(xì)胞器或病原體，處于多種穩(wěn)態(tài)途徑的十字路口[5-6]。PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路是自噬的主要調(diào)控通路之一，其表達(dá)水平的上調(diào)可抑制自噬。本研究利用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（cecum ligation and puncture，CLP）建立膿毒癥急性心肌損傷小鼠模型，使用雷帕霉素不敏感的Rictor 特異性抑制劑干預(yù)，研究膿毒癥時(shí)Rictor 對(duì)心肌細(xì)胞自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SPF 級(jí)昆明種小鼠36 只，6～7 周齡，體重40～60 g，購(gòu)于貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SYXK（黔）2018-0001，合格證：110324210104222 683]，實(shí)驗(yàn)操作符合動(dòng)物倫理要求（2001133）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

主要實(shí)驗(yàn)試劑：Rictor 抑制劑JR-AB2-011（美國(guó)Aobious 公司，批號(hào)：AOB31722）；LC3B 抗體、Akt（pan）抗體、磷酸化Akt（phospho-Aktser473）抗體、Rictor 抗體（美國(guó)CST 公司，批號(hào)：#2775、#4685S、# 4071S、#9476S）；Raptor 抗體、GAPDH 抗體（美國(guó)Bioword 公司，批號(hào)：AP1001、BS65483M）。

主要實(shí)驗(yàn)儀器：蛋白電泳及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國(guó)BIORAD 公司，型號(hào)：Mini-PROTEAN）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Syngene 公司，型號(hào)GeneGnome XRQ）；全自動(dòng)生化儀（美國(guó)Abbott 公司，型號(hào)：ARCHITECT 8000）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型及實(shí)驗(yàn)分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為假手術(shù)組、模型組、實(shí)驗(yàn)組，每組12 只。術(shù)前禁食12 h，不禁飲。使用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹部正中逐層切開(kāi)暴露盲腸。模型組及實(shí)驗(yàn)組在盲腸遠(yuǎn)端1/2 處結(jié)扎，并用7 號(hào)針頭于不同部位貫穿兩次，擠壓穿孔部位使腸內(nèi)容物溢出少許，還納盲腸并逐層縫合；假手術(shù)組暴露盲腸后直接還納。術(shù)后實(shí)驗(yàn)組給予JR-AB2-011 10 mg/kg 腹腔注射[7]，假手術(shù)組及模型組給予同等劑量的生理鹽水。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：小鼠CLP 術(shù)后蘇醒延遲、反應(yīng)遲鈍、精神萎靡、活動(dòng)明顯減少，進(jìn)食、進(jìn)飲減少，呼吸頻率加快；剖腹可見(jiàn)惡臭味血性滲液，腸管水腫粘連，盲腸結(jié)扎遠(yuǎn)端壞死變黑。

1.3.2 標(biāo)本收集 術(shù)后12 h 及24 h 分別取各組6 只小鼠，麻醉后腹主動(dòng)脈采血0.3 ml，開(kāi)胸摘取小鼠心臟。全血分離血清后-80℃保存，取心尖組織進(jìn)行蛋白表達(dá)水平檢測(cè)及組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)。

1.3.3 心肌損傷標(biāo)志物檢測(cè) 使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）及肌酸激酶同工酶（creatine kinase MB，CK-MB）水平。

1.3.4 心肌組織相關(guān)蛋白檢測(cè) 使用SDS 提取小鼠心肌組織蛋白，利用蛋白凝膠電泳及濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，使用Rictor（1∶1000）、panAkt（1∶1000）、Phospho-Aktser473（1∶2000）、Raptor（1∶1000）、LC3B（1∶1000）、GAPDH（1∶5000）4℃孵育過(guò)夜。對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育1 h 后顯影。

1.3.5 心肌組織病理學(xué)檢查 取小鼠心尖組織，于10%甲醛及2.5%戊二醛固定，前者使用HE 染色后掃描電鏡下觀察，后者于透射電鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)表示。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組cTnI、CK-MB 水平比較

模型組各時(shí)間點(diǎn)cTnI、CK-MB 水平高于假手術(shù)組；實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)cTnI、CK-MB 水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組cTnI、CK-MB 水平比較（）

表1 各組cTnI、CK-MB 水平比較（）

注 與假手術(shù)組同期比較，aP ＜0.05；與模型組同期比較，bP ＜0.05。cTnI：心肌肌鈣蛋白I；CK-MB：肌酸激酶同工酶

2.2 各組心肌組織蛋白表達(dá)水平比較

模型組各時(shí)間點(diǎn)Rictor、Phospho-AKTser473、Raptor 高于假手術(shù)組；術(shù)后12 h，模型組LC3B 高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)Rictor、Phospho-AKTser473、Raptor 低于模型組，LC3B 高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)圖1、表2。

表2 各組心肌組織蛋白表達(dá)水平比較（）

表2 各組心肌組織蛋白表達(dá)水平比較（）

注 與假手術(shù)組同期比較，aP ＜0.05；與模型組同期比較，bP ＜0.05

2.3 各組心肌組織形態(tài)學(xué)觀察

假手術(shù)組心肌組織排列正常；模型組可見(jiàn)心肌纖維中度水樣變性；實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)少量心肌纖維水樣變性，細(xì)胞腫脹（圖2A）。透射電鏡下，模型組及實(shí)驗(yàn)組均可觀察到自噬體及自噬溶酶，后者更為顯著（圖2B）。

3 討論

膿毒癥強(qiáng)烈的免疫和炎癥反應(yīng)，直接誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞損傷的發(fā)生，進(jìn)一步發(fā)展為膿毒癥心功能障礙，是患者死亡的重要原因之一[8]。高達(dá)50%的膿毒癥休克患者合并膿毒癥心功能障礙，早期出現(xiàn)的心肌細(xì)胞損傷和心功能障礙，常提示患者的預(yù)后不良[9-10]。除膿毒癥本身所致的心肌損傷外，還包括并發(fā)的低氧血癥、酸中毒、代謝紊亂及免疫系統(tǒng)功能異常等多方面因素，共同構(gòu)成了心肌細(xì)胞復(fù)雜的損傷機(jī)制[11-13]。cTn水平升高常提示心肌細(xì)胞損傷，可用以判斷膿毒癥患者心肌損傷程度及預(yù)后[14]。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥小鼠血清cTnI、CK-MB 水平在早期即明顯升高，提示心肌細(xì)胞損傷的發(fā)生。

自噬作為機(jī)體的保護(hù)機(jī)制之一，參與受損細(xì)胞及細(xì)胞器的修復(fù)、回收、再利用等過(guò)程，減輕組織器官的損傷；自噬在膿毒癥中起到保護(hù)心肌細(xì)胞及清除受損細(xì)胞器的作用，自噬不足會(huì)引起心肌細(xì)胞損傷的增加[15-16]。當(dāng)病原微生物入侵機(jī)體后，多個(gè)自噬信號(hào)通路被激活，從而增強(qiáng)自噬水平，減輕炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度，并改善及控制感染[17-18]。PI3K/Akt/mTOR 作為自噬抑制通路在膿毒癥患者中表達(dá)水平升高，抑制自噬水平，限制了組織器官的自我修復(fù)[19-20]。

膿毒癥合并心肌損傷患者自噬水平更低，心肌細(xì)胞損傷顯著，其潛在機(jī)制可能是通過(guò)mTOR 的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的[1,21]。當(dāng)膿毒癥發(fā)生后，胰島素樣生長(zhǎng)因子通過(guò)PI3K 活化mTORC2[22]，Rictor 作為其關(guān)鍵組成部分，活化Akt 并增強(qiáng)mTORC1 的表達(dá)水平，發(fā)揮自噬負(fù)調(diào)控作用[23-25]。本研究結(jié)果顯示，該信號(hào)通路在小鼠心肌組織中被激活，Rictor 表達(dá)升高，Akt 磷酸化增加，限制了LC3B 的活化、抑制自噬；通過(guò)抑制Rictor 的表達(dá)，LC3B 的表達(dá)水平明顯提高，自噬小體及自噬溶酶體增多，心肌酶下降，體現(xiàn)了自噬對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

綜上所述，膿毒癥中自噬水平的不足加劇了心肌細(xì)胞損傷的程度，通過(guò)抑制Rictor 可提高心肌細(xì)胞的自噬水平，有利于清除受損的細(xì)胞器，減少壞死及凋亡的發(fā)生，從而減輕因膿毒癥導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷。