夏 方，趙麗麗，繆雨臻，蘭新財(cái)，安麗娜，伊鵬霏，韋旭斌#

（1.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130012；2.浙江金大康動(dòng)物保健品有限公司，浙江金華 321016；3.石家莊藏諾藥業(yè)股份有限公司，河北石家莊 050021）

石榴皮止瀉散是由石榴皮飲片和滑石經(jīng)加工制成的散劑，具有澀腸止瀉之功效，擬用于仔豬白痢。為評(píng)價(jià)該制劑的臨床用藥安全性，依據(jù)農(nóng)業(yè)部獸藥評(píng)審中心獸藥急性毒性實(shí)驗(yàn)（LD50測(cè)定）指導(dǎo)原則[1]，參照中華人民共和國(guó)獸藥典相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[2]，本項(xiàng)目組進(jìn)行急性毒性研究，為亞慢性毒性試驗(yàn)、藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)劑量選擇等提供依據(jù)。

1 材料

1．1 受試藥物

石榴皮止瀉散，由浙江金大康動(dòng)物保健品有限公司生產(chǎn)，包裝規(guī)格：100 g/袋，批號(hào)：20150526；用法：口服。

1．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其飼養(yǎng)條件

SPF 級(jí)昆明小鼠72 只，18～22 g，雌雄各半；SPF 級(jí)Wistar 大鼠72 只，雌雄各半，體重180～220 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001，維持飼料購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0003。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)在吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房，動(dòng)物房許可證號(hào)：SYXK（吉）2016-0001。大、小鼠飲用水為無(wú)菌水，雌雄動(dòng)物分籠飼養(yǎng)；飼養(yǎng)溫度控制在21℃～25℃之間，相對(duì)濕度控制在40%～70%；光照強(qiáng)度控制在200～300 lux；光源采取人工明暗各12 h；氨濃度控制在14 mg/m3以下；噪聲控制在60 dB以下。

1．3 其它器材

大、小鼠灌胃器，1 ml、2.5 ml 注射器，電子天平（常熟市天量?jī)x器有限責(zé)任公司，LT 302），量杯，燒杯和毒理實(shí)驗(yàn)室常規(guī)設(shè)備等。

2 試驗(yàn)方法

2．1 小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)

2．1．1 預(yù)試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)置高、中、低3 個(gè)劑量組，給藥劑量分別為5000 mg/kg體重、1000 mg/kg體重、200 mg/kg體重，高、中、低劑量按5 倍依次遞減以期找出4/4 致死劑量和0/4 致死劑量，每個(gè)劑量組均為4 只小鼠（雌雄各半），試驗(yàn)前禁食不禁水12 h。用蒸餾水將石榴皮止瀉散水煎液稀釋4 倍（1 ml 相當(dāng)于250 mg 生藥）、20 倍（1 ml 相當(dāng)于50 mg 生藥）、100 倍（1 ml 相當(dāng)于10 mg 生藥）后分別給高、中、低劑量組小鼠灌胃，小鼠灌胃體積為0.2 ml/10 g 體重。給藥后觀察小鼠的一般表現(xiàn)、中毒癥狀和死亡情況，觀察期7 d。試驗(yàn)結(jié)果顯示：預(yù)備試驗(yàn)中各劑量組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均未見(jiàn)死亡，即高劑量組（5000 mg/kg 體重）亦未見(jiàn)死亡，因此正式試驗(yàn)的劑量定為5000 mg/kg 體重。

2．1．2 正式試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果，正式試驗(yàn)的給藥劑量確定為5000 mg/kg 體重。將正式試驗(yàn)的30 只試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為3 組，每組10 只（雌雄各半），每次取1 組進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)3 次，試驗(yàn)前小鼠禁食不禁水12 h。用蒸餾水將石榴皮止瀉散水煎液稀釋4 倍（1 ml 相當(dāng)于250 mg 生藥）后給小鼠灌胃，小鼠灌胃體積為0.2 ml/10 g 體重。給藥后觀察小鼠的一般表現(xiàn)、中毒癥狀和死亡情況，觀察期7 d。如所有試驗(yàn)動(dòng)物均未死亡，則試驗(yàn)結(jié)束時(shí)將受試動(dòng)物進(jìn)行大體剖檢并做好記錄。

2．1．3 最大給藥量試驗(yàn)

取30 只小鼠隨機(jī)分為3 組，每組10 只（雌雄各半），每次取1 組進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)3 次，試驗(yàn)前小鼠禁食不禁水12 h。將石榴皮止瀉散水煎液濃縮至2 g 生藥/ml，給小鼠灌胃，小鼠灌胃體積為0.2 ml/10 g 體重，每組重復(fù)給藥3 次，每次間隔2 h。給藥量達(dá)到120 g/kg 體重。給藥后觀察小鼠的一般表現(xiàn)、中毒癥狀和死亡情況，觀察期7 d。如所有試驗(yàn)動(dòng)物均未死亡，則試驗(yàn)結(jié)束時(shí)將受試動(dòng)物進(jìn)行大體剖檢并做好記錄。

2．2 大鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)

2．2．1 預(yù)試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)置高、中、低3 個(gè)劑量組，給藥劑量分別為5000 mg/kg體重、1000 mg/kg體重、200 mg/kg體重，高、中、低劑量按5 倍依次遞減以期找出4/4 致死劑量和0/4 致死劑量，每個(gè)劑量組均為4 只大鼠（雌雄各半），試驗(yàn)前禁食不禁水12 h。用蒸餾水將石榴皮止瀉散水煎液稀釋2 倍（1 ml 相當(dāng)于500 mg 生藥）、10 倍（1 ml 相當(dāng)于100 mg 生藥）、50 倍（1 ml 相當(dāng)于20 mg 生藥）后分別給高、中、低劑量組大鼠灌胃，大鼠灌胃體積為1 ml/100 g 體重。給藥后觀察大鼠的一般表現(xiàn)、中毒癥狀和死亡情況，觀察期7 d。試驗(yàn)結(jié)果顯示：預(yù)備試驗(yàn)中各劑量組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均未見(jiàn)死亡，即高劑量組（5000 mg/kg 體重）亦未見(jiàn)死亡，因此正式試驗(yàn)的劑量定為5000 mg/kg 體重。

2．2．2 正式試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果，正式試驗(yàn)的給藥劑量確定為5000 mg/kg 體重。將正式試驗(yàn)的30 只試驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為3 組，每組10 只（雌雄各半），每次取1 組進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)3 次，試驗(yàn)前大鼠禁食不禁水12 h。用蒸餾水將石榴皮止瀉散水煎液稀釋2 倍（1 ml 相當(dāng)于500 mg 生藥）后給大鼠灌胃，大鼠灌胃體積為1 ml/100 g 體重。給藥后觀察大鼠的一般表現(xiàn)、中毒癥狀和死亡情況，觀察期7 d。如所有試驗(yàn)動(dòng)物均未死亡，則試驗(yàn)結(jié)束時(shí)將受試動(dòng)物進(jìn)行大體剖檢并做好記錄。

2．2．3 最大給藥量試驗(yàn)

取30 只試驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為3 組，每組10 只（雌雄各半），每次取1 組進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)3 次，試驗(yàn)前大鼠禁食不禁水12 h。將石榴皮止瀉散水煎液濃縮至2 g 生藥/ml，給大鼠灌胃，大鼠灌胃體積為1 ml/100 g 體重，每組重復(fù)給藥3 次，每次間隔2 h。給藥量達(dá)到60 g/kg 體重。給藥后觀察大鼠的一般表現(xiàn)、中毒癥狀和死亡情況，觀察期7 d。如所有試驗(yàn)動(dòng)物均未死亡，則試驗(yàn)結(jié)束時(shí)將受試動(dòng)物進(jìn)行大體剖檢并做好記錄。

3 結(jié)果

3．1 小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)

3．1．1 預(yù)試驗(yàn)

所有受試小鼠在試驗(yàn)觀察期內(nèi)均未見(jiàn)中毒癥狀，亦未見(jiàn)死亡。

3．1．2 正式試驗(yàn)

正式試驗(yàn)中受試小鼠在試驗(yàn)觀察期內(nèi)均未見(jiàn)中毒癥狀，亦未見(jiàn)死亡，且試驗(yàn)結(jié)束時(shí)大體剖檢小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃腸道等組織器官未見(jiàn)異常變化（表1～2）。

表1 小鼠臨床癥狀觀察結(jié)果

表2 小鼠大體剖檢觀察結(jié)果

按5000 mg/kg 體重劑量經(jīng)口給藥，經(jīng)3 次重復(fù)試驗(yàn)，在試驗(yàn)觀察期內(nèi)小鼠死亡率均為0%（0/10、0/10、0/10）（表3），可判定石榴皮止瀉散對(duì)昆明小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)的LD50 大于5000 mg/kg 體重。

表3 小鼠死亡情況觀察結(jié)果

3．1．3 最大給藥量試驗(yàn)

所有受試小鼠在試驗(yàn)觀察期內(nèi)均未見(jiàn)中毒癥狀，亦未見(jiàn)死亡，且試驗(yàn)結(jié)束時(shí)大體剖檢小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃腸道等組織器官未見(jiàn)異常變化。

120 g/kg體重劑量經(jīng)口給藥，經(jīng)3次重復(fù)試驗(yàn)，在試驗(yàn)觀察期內(nèi)，各組小鼠死亡率均為0%，可判定石榴皮止瀉散對(duì)昆明小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)的LD50大于120 g/kg 體重。

3．2 大鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)

3．2．1 預(yù)試驗(yàn)

所有受試大鼠在試驗(yàn)觀察期內(nèi)均未見(jiàn)中毒癥狀，亦未見(jiàn)死亡。

3．2．2 正式試驗(yàn)

正式試驗(yàn)中受試大鼠在試驗(yàn)觀察期內(nèi)均未見(jiàn)中毒癥狀，亦未見(jiàn)死亡，且試驗(yàn)結(jié)束時(shí)大體剖檢大鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃腸道等組織器官未見(jiàn)異常變化（表4～5）。

表4 大鼠臨床癥狀觀察結(jié)果

表5 大鼠大體剖檢觀察結(jié)果

按5000 mg/kg 體重劑量經(jīng)口給藥，經(jīng)3 次重復(fù)試驗(yàn)，在試驗(yàn)觀察期內(nèi)大鼠死亡率均為0%（0/10、0/10、0/10）（表6），可判定石榴皮止瀉散對(duì)大鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)的LD50大于5000 mg/kg 體重。

表6 大鼠死亡情況觀察結(jié)果

組別 性別 動(dòng)物數(shù)（只） 劑量（mg/kg） 中毒癥狀組3 雄性 5 5000 未見(jiàn)中毒癥狀雌性 5 5000 未見(jiàn)中毒癥狀

3．2．3 最大給藥量試驗(yàn)

所有受試大鼠在試驗(yàn)觀察期內(nèi)均未見(jiàn)中毒癥狀，亦未見(jiàn)死亡，且試驗(yàn)結(jié)束時(shí)大體剖檢大鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃腸道等組織器官未見(jiàn)異常變化。

60 g/kg 體重劑量經(jīng)口給藥，經(jīng)3 次重復(fù)試驗(yàn)，在試驗(yàn)觀察期內(nèi)，各組大鼠死亡率均為0%，可判定石榴皮止瀉散對(duì)大鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)的LD50大于60 g/kg 體重。

表7 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中毒表現(xiàn)觀察項(xiàng)目

4 討論

石榴皮止瀉散是以石榴皮和滑石為原料加工而成的中獸藥制劑，石榴皮為石榴科植物石榴Punica granatum L.的干燥果皮，味酸、澀，性溫，歸大腸經(jīng)，具有澀腸止瀉、止血，驅(qū)蟲(chóng)等功效，臨床用于治療瀉痢，便血，脫肛以及蟲(chóng)積等病證[2～3]。石榴皮中多酚類(lèi)成分占干重的10.4%～21.3%，主要為鞣質(zhì)和黃酮類(lèi)，包括石榴苷、石榴素、石榴鞣花素、石榴皮亭A、石榴皮亭B、沒(méi)食子酸、安石榴林、鞣云實(shí)精、鞣花酸等，其次含有多種氨基酸，糖及其苷類(lèi)、皂苷、有機(jī)酸、生物堿類(lèi)、樹(shù)脂、樹(shù)膠、黏液質(zhì)、果膠、甘露醇、香豆素、油脂類(lèi)以及Ca、P、Mg、K、Na、Fe、Zn 等礦物質(zhì)元素[4]。

石榴皮是一味具有悠久應(yīng)用歷史的中藥，《中國(guó)人民共和國(guó)藥典》和《中國(guó)人民共和國(guó)獸藥典》均無(wú)“有毒”記載。武果桃等用石榴皮鞣質(zhì)制成鞣質(zhì)顆粒，經(jīng)試驗(yàn)對(duì)雞安全用量為每千克體重0.7～1.44 g/d[5]；李志富等用石榴皮醇提物對(duì)小鼠經(jīng)口灌服進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，結(jié)果證明，LD50均大于5000 mg/kg，認(rèn)為其屬實(shí)際無(wú)毒類(lèi)物質(zhì)[6]。

滑石是一味應(yīng)用歷史非常悠久的中藥，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味甘、淡，性寒；歸膀胱、肺及胃經(jīng)；具有利尿通淋，清熱解暑和外用祛濕斂瘡功效；主治熱淋、石淋、濕熱泄瀉、暑熱，外用治療濕疹和濕瘡等。滑石的主要成分為硅酸鎂[Mg3（Si4O10）（OH）2]，還含有鋁、錳、鎳、鈣、鉀、銅、鋇、鈉等元素及少量雜質(zhì)[7～8]。農(nóng)以寧等做過(guò)滑石粉酸中可溶物安全性研究，證明其LD50大于5000mg/kg體重[9]。

本試驗(yàn)將石榴皮止瀉散水煎液按5000 mg/kg體重對(duì)大、小鼠進(jìn)行經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)研究，未出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)；將石榴皮止瀉散水煎液按120 g/kg 體重對(duì)小鼠進(jìn)行經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)，未出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)；將石榴皮止瀉散水煎液按60 g/kg體重對(duì)大鼠進(jìn)行經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)，未出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)。表明該制劑具有較高的臨床用藥安全性。

5 小結(jié)

將石榴皮止瀉散水煎液按5000 mg/kg 體重給大、小鼠灌胃，不能引起試驗(yàn)動(dòng)物死亡，亦未見(jiàn)明顯的臨床毒性反應(yīng)和剖檢病變，表明石榴皮止瀉散對(duì)大、小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)的LD50大于5000 mg/kg 體重，證明其實(shí)際無(wú)毒。將石榴皮止瀉散水煎液按120 g/kg 體重對(duì)小鼠進(jìn)行經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)，未出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)和剖檢病變；將石榴皮止瀉散水煎液按60 g/kg 體重對(duì)大鼠進(jìn)行經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)，未出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)和剖檢病變。表明該制劑具有較高的安全性。