楊 杰，陳 蓉，胡文娟，佟曉楠,2，李興濤,2

(1.贛南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西贛州 341000；2.國家臍橙工程技術(shù)研究中心，江西贛州 341000)

TIFY蛋白是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，被稱為花序分生組織中表達的鋅指蛋白(Zinc-finger protein expressed in inflorescence meristem，ZIM)家族，因其編碼高度保守的TIFY氨基酸序列(TIF[F/Y]XG)，所以被命名為TIFY基因家族[1]。現(xiàn)有研究結(jié)果表明，TIFY基因家族成員分為TIFY、JAZ、ZML和PPD共4個亞族[1-3]。其中TIFY亞族只包含TIFY結(jié)構(gòu)域；JAZ亞族包含TIFY和Jas結(jié)構(gòu)域；ZML亞族包含TIFY、CCT和ZML結(jié)構(gòu)域；PPD亞族包含TIFY、PPD和一個不完整的Jas結(jié)構(gòu)域[4]。

TIFY基因最早在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，因其含有TIFY保守結(jié)構(gòu)域并參與花序發(fā)育而得到確認[5]。目前，牽牛花[6]、桃[7]和番茄[8]等植物中的TIFY基因已被陸續(xù)鑒定出來，并對其調(diào)控植物成花相關(guān)功能進行了深入研究。Kim等[6]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將牽?；ǖ腜nFL2轉(zhuǎn)入擬南芥后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株較對照更早開花；Sherif等[7]發(fā)現(xiàn)PpJAZ1是桃JA信號通路的一個組成部分，在成花期參與調(diào)節(jié)花瓣擴張過程；另外過表達SlJAZ2的轉(zhuǎn)基因番茄株側(cè)芽萌發(fā)早，花期提前，控制開花時間的基因明顯上調(diào)，促進植株由營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變[8]。

甜橙(Citrussinensis)為蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(Citrus)多年生果樹，已逐漸成為中國柑橘產(chǎn)區(qū)的主要栽培品種[9-11]。但中國甜橙的品種結(jié)構(gòu)單一，成熟期集中，大量鮮果在短期集中上市，出現(xiàn)季節(jié)性賣果困難，降低了果農(nóng)收益[12]?！M南早’是甜橙品種‘紐荷爾’的芽變系，與‘紐荷爾’相比，‘贛南早’花期和熟期分別提前10 d和30 d以上[13]。研究證明，果樹提前開花，其果實可提早成熟[14-15]。TIFY轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥的花序發(fā)育和開花中起重要作用[5]，但至今其在甜橙成花誘導(dǎo)過程中的作用機制尚未被報道。本研究基于甜橙基因組數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)技術(shù)對CsTIFYs進行挖掘鑒定，解析該基因家族的蛋白理化性質(zhì)、染色體定位、結(jié)構(gòu)和進化等信息，并使用qRT-PCR對比分析甜橙不同花期品種成花過程中CsTIFYs的相對表達量，為進一步研究CsTIFYs參與甜橙開花調(diào)控中的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗甜橙品種‘贛南早’(CitrussinensisOsbeck)和‘紐荷爾’(CitrussinensisOsbeck)由贛南師范大學(xué)國家臍橙工程技術(shù)研究中心提供，樹齡均為8 a生。分別于‘贛南早’開花前120 d(T1)、90 d(T2)、60 d(T3)、30 d(T4)和0 d(T5)采集兩甜橙品種短枝新梢(方向朝南)處的花芽和葉片(3個生物學(xué)重復(fù))。經(jīng)液氮速凍后置于 ―80 ℃保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 甜橙TIFY基因家族成員鑒定分析 從CPBD(http://citrus.hzau.edu.cn/)下載甜橙基因組數(shù)據(jù)，使用下載于Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)的TIFY-family模型，通過HMMER軟件篩選CsTIFYs。蛋白序列提交CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/term)、InterPro(https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/)和Pfam鑒定TIFY保守結(jié)構(gòu)域，刪除不含有該結(jié)構(gòu)域的蛋白，得到的CsTIFYs根據(jù)其在染色體的位置依次進行命名。

將所有的甜橙TIFY蛋白序列提交至ExPASy在線工具ProtParam(http：//web.expasy.org/compute_pi/)、ProtComp9.0(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl & group=programs & subgroup=proloc)和SOPM(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/nps a_automat.pl?page=npsa_sopma.html)，確定TIFY蛋白序列長度、等電點、亞細胞定位、二級結(jié)構(gòu)等信息；通過Map MG2C(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)繪制CsTIFYs在染色體的位置分布圖；利用GSDS v2.0(http://gsds.gao-lab.org/)繪制CsTIFYs的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)圖；通過MeMe(http://meme-suite.org/)來注釋甜橙中TIFY蛋白保守基序，Motif數(shù)量設(shè)置為10；基于擬南芥和甜橙的TIFY蛋白序列，使用MEGA 6.0的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，Bootstrap為1 000；從CPBD獲取CsTIFYs上游2 kb序列，利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進行順式作用元件的分析；根據(jù)CPBD中已發(fā)布的甜橙RNA-Seq數(shù)據(jù)，使用TBtools軟件繪制CsTIFYs表達熱圖。

1.2.2 甜橙TIFY基因家族成員表達分析 取出-80 ℃保存的試驗材料，使用新景植物總RNA提取試劑盒(SIMGEN，中國杭州)提取RNA，之后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(SIMGEN，中國杭州)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用Beacon Designer 7.0軟件設(shè)計qRT-PCR引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，利用2×SYBR Green PCR Mix(SIMGEN，中國杭州)在羅氏Light-Cycler 480型實時熒光定量PCR儀(Roche，Basel，Switzerland)進行qRT-PCR。反應(yīng)體系10 μL： 2×SYBR Green PCR Mix 5 μL，正反向引物各 0.5 μL，cDNA(已稀釋10倍)和ddH2O各2 μL；反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性60 s， 95 ℃變性20 s， 60 ℃復(fù)性20 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。每個樣品進行3次技術(shù)重復(fù)。采用2-△△Ct法[16]計算CsTIFYs相對表達量，使用DPS 9.01數(shù)據(jù)處理軟件對其進行顯著性差異分析，利用SigmaPlot 14.0繪制柱形圖并注明各組間的差異顯著性。

表1 甜橙TIFY基因家族成員定量引物信息Table 1 Quantitative primer sequences of TIFY gene family members in Citrus sinensis

2 結(jié)果與分析

2.1 甜橙TIFY基因家族成員的鑒定和序列 分析

利用甜橙基因組通過HMMER軟件篩選及TIFY結(jié)構(gòu)域分析，共鑒定出13個CsTIFYs，依次命名為CsTIFY1～CsTIFY13(表2)。結(jié)果表明，甜橙TIFY基因編碼的核苷酸長度為363～ 1 122 bp，氨基酸長度為120～373 aa，等電點為4.68～9.49，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為13.55～40.63 ku。其中僅有CsTIFY1、CsTIFY6、CsTIFY7、CsTIFY10和CsTIFY12的等電點小于7，為酸性蛋白，其余8個甜橙TIFY基因家族成員均為堿性蛋白。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，絕大多數(shù)CsTIFYs定位于細胞核，而CsTIFY4、CsTIFY5、CsTIFY8和CsTIFY11定位于細胞外。

表2 甜橙TIFY基因家族成員基本信息Table 2 Basic information of TIFY gene family members in Citrus sinensis

2.2 甜橙TIFY蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

甜橙TIFY蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示(表3)，無規(guī)則卷曲是構(gòu)成甜橙TIFY蛋白結(jié)構(gòu)的重要組成部分，所占比例為50.00%～73.42%；其次是α-螺旋和β-折疊，所占比例分別為 13.06%～34.30%和2.17%～5.49%。

表3 甜橙TIFY蛋白二級結(jié)構(gòu)組成Table 3 Secondary structure composition of TIFY proteins in Citrus sinensis

2.3 甜橙TIFY基因家族成員的染色體定位 分析

13個CsTIFYs不均勻的分布在甜橙8條染色體上(圖1)。其中chr1上分布的CsTIFYs最多，有3個；chr2、chr3和chr4上分布的CsTIFYs均為2個；chr5、chr7、chr8和chr9上分布的CsTIFYs最少，各僅有1個。

圖1 甜橙TIFY基因家族成員在染色體上的分布Fig.1 Chromosomal distribution of TIFY gene family members in Citrus sinensis

2.4 甜橙TIFY基因家族成員的結(jié)構(gòu)及保守基序分析

甜橙TIFY基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)存在較大差異(圖2)。CsTIFYs中內(nèi)含子的數(shù)量為 1～9個，其中CsTIFY6和CsTIFY12均含有9個，數(shù)量最多；CsTIFY3含有1個，數(shù)量最少；其余CsTIFYs均含2～8個不等。為明確CsTIFYs的進化關(guān)系，將13個CsTIFY蛋白序列構(gòu)建進化樹，結(jié)果顯示在進化樹中位置相近的CsTIFYs具有相似的基因結(jié)構(gòu)。

數(shù)值表示1 000次重復(fù)抽樣所得75%以上的置信度

甜橙TIFY蛋白序列含有10個保守的Motif(圖3)，位于同一亞族CsTIFY蛋白的Motif數(shù)量、類型和分布相似。其中Motif 1、Motif 2和Motif 5存在于所有CsTIFY蛋白上，可能在CsTIFY蛋白功能發(fā)揮中起了重要作用；Motif 3僅存在于G亞族，而Motif 6和Motif 10僅存在于C亞族，Motif 7和Motif 9則僅存在于H亞族。

圖3 甜橙TIFY基因家族成員的保守基序Fig.3 Conserved motifs of TIFY gene family members in Citrus sinensis

2.5 甜橙、擬南芥和水稻TIFY基因家族成員的系統(tǒng)進化分析

甜橙(13個)、擬南芥(18)和水稻(20)TIFY蛋白的系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示(圖4)，51個蛋白序列聚類為10亞族(A～J)，甜橙TIFY蛋白分布于B、C、D、E、F、G、H和I亞族中。其中G亞族含有甜橙TIFY蛋白數(shù)量最多，為4個；C和H亞族次之，均為2個；其余5個亞族最少，各僅有1個。此外，甜橙TIFY蛋白與擬南芥進化關(guān)系較近，與水稻進化關(guān)系較遠。

分支上數(shù)值表示大于75%的自展支持率

2.6 甜橙TIFY基因家族成員啟動子的順式作用元件分析

CsTIFYs上游2 kb序列中順式作用元件的預(yù)測分析結(jié)果顯示(圖5)，CsTIFYs啟動子區(qū)的順式作用元件種類及分布具有多樣性。其中13個CsTIFYs均包含多個光響應(yīng)元件和激素響應(yīng)元件，說明CsTIFYs參與了光調(diào)控和激素誘導(dǎo)等過程；CsTIFY7和CsTIFY11包含生理控制響應(yīng)元件；除CsTIFY1、CsTIFY7、CsTIFY10、和CsTIFY12外，其余9個CsTIFYs均包含數(shù)目不一的逆境響應(yīng)元件，表明CsTIFYs可能在響應(yīng)非生物脅迫中發(fā)揮重要的作用。

圖5 甜橙TIFY基因家族成員啟動子的順式作用元件Fig.5 Cis-acting elements within promoter of TIFY gene family members in Citrus sinensis

2.7 甜橙TIFY基因家族成員的組織表達分析

基于甜橙轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對其不同組織中CsTIFYs的表達差異進行分析(圖6)。結(jié)果表明，13個CsTIFYs在甜橙愈傷組織、花、葉和果實中均有表達，但表達豐度存在明顯差異。其中CsTIFY1、CsTIFY5、CsTIFY6、CsTIFY8、CsTIFY11和CsTIFY12在甜橙愈傷組織中優(yōu)勢表達；CsTIFY1、CsTIFY5、CsTIFY8、CsTIFY10和CsTIFY11在甜橙花中高表達；而在甜橙葉中高表達的CsTIFYs僅有3個，分別為CsTIFY5、CsTIFY6和CsTIFY10；此外，除CsTIFY2、CsTIFY7、CsTIFY11、CsTIFY12和CsTIFY13外，其余CsTIFYs均在甜橙果實中優(yōu)勢表達。

2.8 甜橙TIFY基因家族成員的表達特異性 分析

使用qRT-PCR對甜橙花芽(圖7)與葉片(圖8)中高表達基因CsTIFY1、CsTIFY5、CsTIFY6、CsTIFY8、CsTIFY10和CsTIFY11的時空表達差異進行檢測。結(jié)果顯示，于T1～T5時期中6個CsTIFYs在兩甜橙品種的花芽和葉片中均有不同程度的表達。其中各時期CsTIFYs在花芽和葉片中的相對表達量，甜橙早花品種‘贛南早’均高于對照品種‘紐荷爾’。T4和T5時期，除CsTIFY1和CsTIFY6外，其余4個CsTIFYs在兩甜橙品種的表達差異較顯著。這些結(jié)果暗示CsTIFYs可能參與甜橙成花發(fā)育和開花時期的調(diào)控過程。

圖6 甜橙TIFY基因家族成員在其不同組織中的表達模式Fig.6 Expression patterns of TIFY gene family members in different tissues of Citrus sinensis

3 討 論

基因組測序技術(shù)的發(fā)展為植物基因家族的鑒定及表達分析提供了有利條件。近年來，已在多種植物中鑒定獲得TIFY基因家族成員，這些研究結(jié)果揭示植物TIFY基因家族成員在植物生長發(fā)育及多種生理生化過程中起重要的調(diào)控作用[17-21]。然而，TIFY基因家族成員的數(shù)目因物種不同而有所差異[4]。本研究從甜橙基因組中鑒定獲得13個TIFY基因家族成員。CsTIFYs外顯子數(shù)量在2～10個基因結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜，這與水稻[17]、擬南芥[18]、葡萄[1]、小麥[20]、蘋果[19]等植物的研究結(jié)果相類似，表明TIFY基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)在不同物種中具有保守性。

*表示P<0.05水平上的差異顯著性，**表示P<0.01水平上的差異顯著性，下同

同一簇的大部分基因通常包含相似的內(nèi)-外顯子結(jié)構(gòu)和基序組成[22]。本研究根據(jù)進化關(guān)系將13個CsTIFY蛋白劃分為8個亞族，聚在同一亞族的大部分CsTIFYs具有相似的內(nèi)-外顯子結(jié)構(gòu)和基序組成；然而，G亞族中CsTIFY1和CsTIFY7的基因結(jié)構(gòu)不同于其余CsTIFYs，推測同一亞族不同基因在進化過程中發(fā)生了內(nèi)含子的丟失或增加。為進一步分析進化關(guān)系，構(gòu)建了CsTIFYs、AtTIFYs和OsTIFYs的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示這些成員被劃分為10個亞族，其中J亞族只含OsTIFYs，暗示該亞族可能形成于單子葉植物和雙子葉植物分化之后；此外，相對于單子葉植物水稻而言，甜橙的進化關(guān)系更接近于雙子葉植物擬南芥，驗證了甜橙和擬南芥這些雙子葉植物具有共同祖先[23]。

基因的表達受啟動子順式作用元件的調(diào)控[24]。CsTIFYs啟動子分析發(fā)現(xiàn)大量與激素相關(guān)的響應(yīng)元件，但不同成員之間含有元件的種類和個數(shù)均不同，證明CsTIFYs響應(yīng)激素的種類和程度不同，進而導(dǎo)致CsTIFYs之間功能的差異化。此外，部分CsTIFYs還同時含有多個脅迫響應(yīng)元件，推測CsTIFYs作為中間轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)不同激素間的調(diào)控，從而響應(yīng)逆境脅迫。為分析CsTIFYs在甜橙生長發(fā)育中的作用，本研究對CsTIFYs進行了組織特異性分析，結(jié)果顯示46%的CsTIFYs在甜橙花和葉片中高表達，表明CsTIFYs在甜橙花芽分化和開花中發(fā)揮一定的調(diào)控作用。前人研究也發(fā)現(xiàn)TIFY基因家族成員對植物花發(fā)育有重要作用[7,8,25]，支持了本研究的分析結(jié)果。

圖8 甜橙 CsTIFYs基因在兩甜橙品種葉片中的相對表達量Fig.8 Relative expression of CsTIFYs in leaves

本試驗發(fā)現(xiàn)花和葉片中高表達CsTIFYs在甜橙不同花期品種的成花過程中存在瞬時表達差異，于T1～T3時期中CsTIFYs的表達水平均呈上升趨勢。此外，CsTIFY1等6個基因均在早花品種‘贛南早’中優(yōu)勢表達。這些結(jié)果證明CsTIFYs積極參與了甜橙成花誘導(dǎo)過程。這與桃中TIFY基因家族成員在其花誘導(dǎo)和開花過程發(fā)揮作用的研究結(jié)果相符[7]。本研究全面分析了甜橙TIFY基因家族成員，發(fā)現(xiàn)CsTIFYs參與甜橙花、葉片、果實和愈傷組織的發(fā)育過程，初步證明了CsTIFYs對甜橙花芽分化和開花的響應(yīng)，為后續(xù)深入開展相關(guān)研究提供基礎(chǔ)資料。