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        UPLC-ESI-Q-TOF MS結(jié)合裂解規(guī)律分析姜科植物中二苯基庚烷類成分

        2022-07-22 08:11:02胡雪雨王彥志宋志敏劉煜飛劉雙晶馮衛(wèi)生
        分析測試學(xué)報 2022年7期
        關(guān)鍵詞:途徑標(biāo)準(zhǔn)

        胡雪雨,王彥志,2*,宋志敏,劉煜飛,劉雙晶,馮衛(wèi)生*

        (1.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,河南 鄭州 450046;2.呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,河南 鄭州 450046)

        二苯基庚烷是一類具有1,7-二取代苯基并以庚烷骨架為母體結(jié)構(gòu)的化合物,可分為線性二苯基庚烷類和環(huán)狀二苯基庚烷類化合物[1]。其主要藥理活性有抗氧化、抗炎、抗病毒、細(xì)胞毒性、抗菌等[2-8],主要存在于姜科植物(如生姜、高良姜、草豆蔻、草果、益智仁)中,是大多數(shù)姜科植物的主要活性成分[9-11]。姜皮,別名生姜衣,為姜科植物姜(Zingiber officinaleRosc.)的干燥根莖外皮[12],在秋季挖取姜的根莖后洗凈并刮取外皮曬干即得,現(xiàn)行中國藥典尚未收載,但部分地方中藥飲片有收載[13]。姜皮味辛性涼,歸于脾、肺經(jīng),可起到發(fā)汗解表和行水消腫等作用[1]。草果,味辛性溫、無毒,為姜科豆蔻屬植物草果(Amomum tsao-ko)的干燥成熟果實[14],具有燥濕健脾、祛痰截瘧之功效,主治痰飲胸滿、心腹疼痛、脾虛泄瀉、瘧疾等證[15]。益智仁是姜科山姜屬植物益智(Alpinia oxyphyllaMiq.)的干燥成熟果實[16],是“四大南藥”之一[17],性溫,歸脾、腎經(jīng),可暖腎固精縮尿、溫脾止瀉攝唾[18]。目前,關(guān)于二苯基庚烷類化合物的研究多集中于姜和高良姜[19-20],由于缺少標(biāo)準(zhǔn)品,只能依據(jù)質(zhì)譜推測的化合物結(jié)構(gòu),推斷此類成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律,故缺乏足夠的準(zhǔn)確性。

        本研究采用具有高分辨率和高準(zhǔn)確性的電噴霧-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(ESI-Q-TOF MS),對11 個不同類型二苯基庚烷類化合物標(biāo)準(zhǔn)品的電噴霧質(zhì)譜碎片離子進(jìn)行全面解析,推測可能的裂解途徑,總結(jié)二苯基庚烷類化合物的裂解規(guī)律,完善了此類化合物的質(zhì)譜鑒定方法。并根據(jù)裂解途徑,采用超高效液相色譜-電噴霧-四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-ESI-Q-TOF MS)對姜科植物來源中藥姜皮、草果、益智仁中的二苯基庚烷類成分進(jìn)行鑒定。

        1 實驗部分

        1.1 主要儀器

        UPLC-Triple TOF 6600 型超高效液相色譜-電噴霧-飛行時間高分辨質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX 公司);BSA224S 型電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);5424R 型低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)。

        1.2 材料與試劑

        (3R,5S)3,5-二羥基-1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-7-(3,4-二羥基苯基)庚烷(標(biāo)準(zhǔn)品1)、(3R,5R)3-乙酰氧基-5-羥基-1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-7-(3,4-二羥基苯基)庚烷(標(biāo)準(zhǔn)品2)、(3R,5S)3,5-二羥基-1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)庚烷(標(biāo)準(zhǔn)品3)、(3R,5R)3-乙酰氧基-5-羥基-1-(4-羥基-3,5-二甲氧基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)庚烷(標(biāo)準(zhǔn)品4)、3,5-二乙酰氧基-1,7-雙(3,4-二羥基苯基)庚烷(標(biāo)準(zhǔn)品5)、3,5-二羥基-1,7-雙(4-羥基-3,5-二甲氧基苯基)庚烷(標(biāo)準(zhǔn)品6)、(3R)3-羥基-1,7-雙(3,4-二羥基苯基)庚烷(標(biāo)準(zhǔn)品7)、1,7-雙(4-羥基-3-甲氧基苯基)-5-甲氧基-3-庚酮(標(biāo)準(zhǔn)品8)、(1S,5S,3R)1,5-環(huán)氧-3-羥基-1-(4,5-二羥基-3-甲氧基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)庚烷(標(biāo)準(zhǔn)品9)、(1S,5S,3S)1,5-環(huán)氧-3-羥基-1-(4,5-二羥基-3-甲氧基苯基)-7-(4,3-二羥基苯基)庚烷(標(biāo)準(zhǔn)品10)、(1S,5S,3R)1,5-環(huán)氧-3-羥基-1-(4-羥基-3,5-二甲氧基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)庚烷(標(biāo)準(zhǔn)品11)(純度>95%)。11 個標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的4 種二苯基庚烷結(jié)構(gòu)類型示于圖1,各化合物的結(jié)構(gòu)信息示于表1。甲醇、乙腈(色譜純,美國Fisher Scientific公司)。實驗用水為蒸餾水(中國屈臣氏公司)。

        表1 11種二苯基庚烷的化學(xué)結(jié)構(gòu)Table 1 Chemical structures of diarylheptanoids

        圖1 4種二苯基庚烷的結(jié)構(gòu)骨架類型Fig.1 Structural skeleton types of 4 diarylheptanoids skeleton R1-R8 were shown in Table 1

        姜皮、草果購于云南省曲靖市紅河縣,益智仁購自海南省瓊中市,經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)陳隨清教授鑒定分別為姜科植物姜Zingiber officinaleRosc. 的根莖外皮,以及姜科植物草果Amomum tsaokoCrevost et Lemarie 和益智Alpinia oxyphyllaMiq. 的干燥成熟果實。

        1.3 色譜分析條件

        色譜柱:Phenomenex C18(100 mm×2.1 mm,1.7μm),柱溫:40 ℃,流速:0.3 mL·min-1,進(jìn)樣量:2 μL,流動相:A 為0.1%甲酸水溶液,B 為乙腈。姜皮成分的洗脫梯度:0~2.0 min,5% B;2.0~4.0 min,5%~15%B;4.0~24 min,15%~70%B;24~25 min,70%~90%B;25~27 min,90%B;27~28.1 min,90%~5% B;28.1~30 min,5% B。草果和益智仁成分的洗脫梯度:0~2.0 min,5% B;2.0~4.0 min,5%~40% B;4.0~23 min,40%~90% B;23~27 min,90% B;27~28 min,90%~5%B;28~30 min,5%B。

        1.4 質(zhì)譜分析條件

        ESI 電離源,正離子掃描,噴霧氣:310 264 Pa(45 psi),輔助加熱氣:344 738 Pa(50 psi),氣簾氣:241 316 Pa(35 psi),去簇電壓:80 V,源溫度:550 ℃,一級質(zhì)譜掃描范圍:m/z100~1 000,二級質(zhì)譜掃描范圍:m/z50~1 000,碰撞電壓:(40±20)V。

        標(biāo)準(zhǔn)品采用針泵注射獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù),注射泵進(jìn)樣速度:10μL/min。

        1.5 樣品處理

        1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備 分別精密稱取各標(biāo)準(zhǔn)品1 mg于10 mL 容量瓶中,用甲醇溶解稀釋至刻度,搖勻,過0.22μm微孔濾膜,備用。

        1.5.2 供試品制備 姜皮用10 倍量50%乙醇加熱回流提取2 次,每次2 h,濾除藥渣后將提取液濃縮干燥得浸膏。用適量50%甲醇溶解,過0.22μm 微孔濾膜,離心(12 000 r/min,15 min),取上清液備用。草果和益智仁分別用10倍量75%乙醇加熱回流提取2次,每次2 h,濾除藥渣后將提取液濃縮,再用乙酸乙酯萃取,萃取液濃縮干燥得浸膏,用適量70%甲醇水溶液溶解,過0.22μm 微孔濾膜,離心(12 000 r/min,15 min),取上清液備用。

        實驗前,分別使用對應(yīng)的校正液對正離子模式進(jìn)行校正。使用進(jìn)樣針分別吸取約200μL 標(biāo)準(zhǔn)溶液,在正離子模式下進(jìn)樣分析。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 正離子模式下二苯基庚烷類化合物的裂解規(guī)律

        在正離子模式下,本實驗?zāi)軌虻玫礁骰衔锴逦亩壻|(zhì)譜圖,及其質(zhì)譜信息(表2)。各標(biāo)準(zhǔn)品的精確質(zhì)荷比與理論質(zhì)荷比相吻合,質(zhì)譜碎片信息全面、穩(wěn)定。

        表2 11個二苯基庚烷的質(zhì)譜信息Table 2 Mass spectrometric informations of diarylheptanoids

        2.1.1 Ⅰ類二苯基庚烷類化合物的裂解規(guī)律 根據(jù)Ⅰ類二苯基庚烷類化合物標(biāo)準(zhǔn)品的碎片特征綜合推斷,此類化合物主要有兩條裂解途徑。

        圖2A 為標(biāo)準(zhǔn)品4的二級質(zhì)譜圖,由圖推測,化合物首先丟失碳鏈上的取代基—OH、—OCOCH3產(chǎn)生碎片m/z371,一條裂解途徑是C7位上的苯環(huán)及其取代基丟失,產(chǎn)生碎片m/z247,然后從C7到C2依次丟失1 個C,產(chǎn)生碎片m/z233、m/z221、m/z207,以及主要特征碎片m/z193、m/z167。另一條裂解途徑是C1位上的苯環(huán)及其取代基丟失,產(chǎn)生碎片m/z217,然后丟失CH2,產(chǎn)生碎片m/z203,隨后分別丟失C2H4、CH2,依次產(chǎn)生碎片m/z175、m/z161;m/z203還可丟失C2H2產(chǎn)生碎片m/z177,碎片m/z177丟失1 個CH2或C3H4,分別產(chǎn)生碎片m/z163 和主要特征碎片m/z137,碎片m/z163 脫水,產(chǎn)生碎片m/z145,隨后丟失1 個CH2,產(chǎn)生碎片m/z131。標(biāo)準(zhǔn)品4 可能的裂解途徑見圖3。通過對標(biāo)準(zhǔn)品1、2、3、5、6的二級碎片離子進(jìn)行全面解析,推測其裂解途徑與標(biāo)準(zhǔn)品4基本一致。

        圖2 二苯基庚烷標(biāo)準(zhǔn)品(4、7、8、10)的二級質(zhì)譜圖Fig.2 ESI-MS/MS spectra of diarylheptanoid standards(4,7,8,10)A. standard 4;B. standard 7;C. standard 8;D. standard 10

        2.1.2 Ⅱ類二苯基庚烷類化合物的裂解規(guī)律 Ⅱ類二苯基庚烷類化合物的裂解途徑與Ⅰ類相似,差別在于,碳鏈在裂解過程中只出現(xiàn)1 個雙鍵(2 個苯環(huán)都丟失的情況除外)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品7 的二級質(zhì)譜圖(圖2B)推測,在正離子模式下,化合物首先丟失碳鏈上的取代基—OH,產(chǎn)生碎片m/z315,然后丟失C6H6O2產(chǎn)生碎片m/z205,進(jìn)一步丟失C3H6產(chǎn)生碎片m/z163,進(jìn)而丟失CH2產(chǎn)生碎片m/z149,碎片m/z149 丟失C2H2形成主要特征碎片m/z123,或者脫水形成碎片m/z131,碎片m/z163還可脫水形成碎片m/z145,然后丟失CH2形成碎片m/z131。其可能的裂解途徑見圖4。

        圖4 標(biāo)準(zhǔn)品7可能的裂解途徑Fig.4 Proposed fragmentation pathways of standard 7

        2.1.3 Ⅲ類二苯基庚烷類化合物的裂解規(guī)律 通過對Ⅲ類標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,推測該類化合物主要有兩條裂解途徑。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品8的二級質(zhì)譜圖(圖2C)推測,一條裂解途徑是C3—C4鍵斷裂產(chǎn)生碎片m/z179,進(jìn)一步丟失O,產(chǎn)生碎片m/z163,隨后丟失C2H2,產(chǎn)生主要特征碎片m/z137。另一條途徑是C2—C3鍵斷裂,產(chǎn)生碎片m/z207,進(jìn)一步丟失CH2O產(chǎn)生碎片m/z177,然后丟失C3H4,產(chǎn)生主要特征碎片m/z137,碎片m/z177還可丟失CH4O產(chǎn)生碎片m/z145,進(jìn)一步丟失CH2產(chǎn)生碎片m/z131。其可能的裂解途徑見圖5。

        圖5 標(biāo)準(zhǔn)品8可能的裂解途徑Fig.5 Proposed fragmentation pathways of standard 8

        2.1.4 Ⅳ類二苯基庚烷類化合物的裂解規(guī)律 不同于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類線性二苯基庚烷,Ⅳ類二苯基庚烷是環(huán)狀二苯基庚烷。

        根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品10的二級質(zhì)譜圖(圖2D),推測該類化合物有兩條裂解途徑,一條途徑是C5—C6鍵斷裂,產(chǎn)生碎片m/z237,再丟失CH2產(chǎn)生碎片m/z223,進(jìn)一步丟失C2H4O產(chǎn)生主要特征碎片m/z179,碎片m/z179分別丟失C2H2、CH4O,產(chǎn)生主要特征碎片m/z153和m/z147,其中m/z147可丟失CO產(chǎn)生碎片m/z119。另一條途徑是含氧環(huán)斷裂產(chǎn)生碎片m/z165,然后丟失C2H2O產(chǎn)生主要特征碎片m/z123。通過對標(biāo)準(zhǔn)品9、11的二級碎片離子進(jìn)行綜合分析,推測其裂解途徑與標(biāo)準(zhǔn)品10基本一致。標(biāo)準(zhǔn)品10可能的裂解途徑見圖6。

        圖6 標(biāo)準(zhǔn)品10可能的裂解途徑Fig.6 Proposed fragmentation pathways of standard 10

        2.2 3種姜科植物中二苯基庚烷類化合物的鑒定

        利用UPLC-ESI-Q-TOF MS 獲得姜皮、草果、益智仁的質(zhì)譜信息,結(jié)合裂解規(guī)律,分別鑒定出14、11、10個二苯基庚烷類化合物(見表3),其詳細(xì)鑒定過程以化合物9、11為例進(jìn)行闡述。

        表3 二苯基庚烷的鑒定結(jié)果Table 3 Identification results of diarylheptanoids

        (續(xù)表3)

        化合物9的[M+H]+為m/z405.191 1,元素組成分析顯示其分子式為C22H28O7。其二級質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品9相似,推測為Ⅳ類二苯基庚烷類化合物,特征碎片離子m/z193.086 0、m/z167.070 2與標(biāo)準(zhǔn)品9的m/z179.071 0、m/z153.054 9相比分別增加14.015 0、14.015 3,結(jié)合裂解規(guī)律以及文獻(xiàn)[21]推測化合物9為1,5-環(huán)氧-3-羥基-1-(4-羥基-3,5-二甲氧基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)庚烷。

        化合物11 的[M+H]+為m/z435.201 2,分子式為C23H30O8。其二級質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品4 相似,推測為Ⅰ類二苯基庚烷類化合物,特征碎片離子m/z179.069 8、m/z153.054 5 與標(biāo)準(zhǔn)品4 的m/z193.086 6、m/z167.071 0 相比分別減少14.016 8、14.016 5,結(jié)合裂解規(guī)律以及文獻(xiàn)[22]推測化合物11 為3-乙酰氧基-5-羥基-1-(3-甲氧基-5,4-二羥基苯基)-7-(3-甲氧基4-羥基苯基)庚烷。

        在3 類藥材中,檢出最多的二苯基庚烷類型是Ⅰ類,其次是Ⅳ類。姜皮和草果中Ⅰ類的二苯基庚

        烷較多,而益智仁中Ⅲ類的二苯基庚烷相對較多。由峰面積比(Area ratio=化合物峰面積/各自藥材中的1,5-環(huán)氧-3-羥基-1-(3,4-二羥基-5-甲氧基苯基)-7-(4-羥基苯基)庚烷的峰面積×100%)可看出,Ⅲ類二苯基庚烷的響應(yīng)值在3種藥材中普遍較高。

        3 結(jié) 論

        本文采用ESI-Q-TOF MS 對11 種二苯基庚烷類化合物標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)各類二苯基庚烷在正離子模式下主要有兩種裂解途徑,C1或C7與苯環(huán)及其取代基會形成主要特征碎片,根據(jù)質(zhì)譜圖的主要碎片峰推測苯環(huán)上的取代基,比如m/z107、m/z123、m/z137、m/z153、m/z167 分別提示苯環(huán)上的取代基為1 個羥基、2 個羥基、1 個羥基和1 個甲氧基、2 個羥基和1 個甲氧基、1 個羥基和2 個甲氧基。對于線性二苯基庚烷(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類),若碳鏈上無羰基,在正離子模式下首先丟失碳鏈上的取代基,隨后主要有兩條裂解途徑,一條是C7位上的苯環(huán)丟失,然后從C7到C2依次丟失;另一條是C1位上的苯環(huán)丟失,然后從C1到C6依次丟失,但當(dāng)苯環(huán)上有2 個及以上取代基時,可能會出現(xiàn)更多的裂解途徑。若碳鏈上有羰基,由于羰基的存在,這類二苯基庚烷多為羰基左右的碳鍵發(fā)生斷裂,由此產(chǎn)生2 條主要裂解途徑,首先丟失O,然后依次丟失其他基團(tuán)。對于環(huán)狀二苯基庚烷(Ⅳ類),含氧環(huán)附近發(fā)生碳鍵裂解,產(chǎn)生2 條主要裂解途徑,此外,該類二苯基庚烷除了C1或C7與苯環(huán)及其取代基會形成主要特征碎片外,還會出現(xiàn)C1~C3與苯環(huán)及其取代基所形成的主要特征碎片,如m/z179。依據(jù)本研究總結(jié)的二苯基庚烷類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律,從姜皮、草果、益智仁中分別鑒定出14、11、10 個二苯基庚烷類成分,為姜科植物中該類化合物的快速定性分析提供了理論基礎(chǔ)。

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