張艷海，李 玲，張大偉，魯 銳

（1.安捷倫科技（中國(guó)）有限公司，上海 200080；2.黑龍江農(nóng)墾總局總醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150088）

參附注射液（Shenfu injection，SFI）由紅參、附子（黑順片）經(jīng)現(xiàn)代工藝加工制備而成，具有益氣溫陽(yáng)、蠲化寒飲、振奮心陽(yáng)、益氣固脫等多重功效，主要用于陽(yáng)氣暴脫引起的厥脫癥，以及陽(yáng)虛（氣虛）所致的驚悸、喘咳、胃疼、泄瀉、痹癥等［1-2］。近年來(lái)，SFI被廣泛用于治療心力衰竭、休克、心律失常、膿毒癥等［3-7］復(fù)雜疾病，療效顯著。SFI 也被推薦用于新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）危重癥患者的救治，在國(guó)家、各省市出臺(tái)的23種中醫(yī)藥防治COVID-19的治療方案中有重要地位［8-9］。研究表明，人參皂苷和烏頭類(lèi)生物堿作為SFI 的兩類(lèi)有效活性成分，其抗炎作用在治療心腦血管疾病方面有重要意義［1，10］。附子中的烏頭類(lèi)生物堿（包括雙酯型生物堿及其水解產(chǎn)物單酯型生物堿）既是有效成分又是毒性成分，其中雙酯型生物堿的毒性約是單酯型生物堿的100 ～200倍。附子經(jīng)炮制后，雙酯型和單酯型生物堿的含量顯著降低［11-12］，而參附注射液在制備過(guò)程中單酯型生物堿的含量進(jìn)一步降低［13］。因此準(zhǔn)確測(cè)定兩類(lèi)生物堿的含量，不僅能保證藥物安全性和有效性，也是保證炮制工藝和生產(chǎn)工藝的重要方面。

參附注射液中人參皂苷和烏頭堿類(lèi)生物堿的分析方法主要包括液相色譜法［13-16］和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）［17］。其中烏頭堿類(lèi)生物堿成分由于含量較低，且樣品基質(zhì)復(fù)雜，測(cè)定時(shí)常采用C18離線(xiàn)固相萃?。?3］或在線(xiàn)固相萃取（online SPE）進(jìn)行富集和凈化［16-17］。但基于C18的SPE柱僅能去除樣品基質(zhì)中極性較大的水溶性成分干擾，無(wú)法去除其他極性相近的中性干擾成分，凈化效果有限。此外，采用液相色譜的人參皂苷定量方法僅涵蓋人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc 和Rd 等原人參二醇型（Protopanaxadiol）和原人參三醇型（Protopanaxatriol）［14-15］物質(zhì)。而齊墩果烷型人參皂苷如人參皂苷Ro 具有抗炎、抗氧化等作用，含量?jī)H次于Rb1，且Ro/Re含量比值可作為紅參年限的重要參考指標(biāo)［18］。LCMS法能同時(shí)對(duì)13種人參皂苷和10種烏頭堿類(lèi)生物堿進(jìn)行定量［17］，但其檢測(cè)成本較高，不適合在實(shí)際質(zhì)控等實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。本文采用柱切換液相色譜技術(shù)，選擇強(qiáng)陽(yáng)離子交換（SCX）柱作為online SPE柱，建立了6 個(gè)烏頭堿類(lèi)生物堿的在線(xiàn)固相萃取/液相色譜-紫外檢測(cè)（online SPE/LC-UV）快速分析方法；并優(yōu)化了人參皂苷含量的測(cè)定方法，同時(shí)完成了包括人參皂苷Ro在內(nèi)的9種人參皂苷的定量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1260 Infinity Ⅱ液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)安捷倫科技公司），包括：四元泵（G711B）、二元泵（G7112B）、自動(dòng)進(jìn)樣器（G7129A）、柱溫箱（G7116A）（內(nèi)置一個(gè)2位6通閥）、閥切換單元（G1170A，含一個(gè)2 位6 通閥）、二極管陣列檢測(cè)器（G7117A）× 2，軟件采用Agilent OpenLab CDS 2.5。Zorbax SB-C18（4.6 mm × 150 mm × 3.5 μm）、Poroshell EC-C18（4.6 mm × 100 mm × 2.7 μm）及其保護(hù)柱（4.6 mm×5 mm×2.7μm）、Zorbax SCX（4.6 mm×12.5 mm×5μm）（美國(guó)安捷倫科技公司）。

乙腈、甲醇（色譜級(jí)，Avantor J.T.Baker 公司）；去離子水（18.2 MΩ·cm-1，Millipore 純水機(jī)）；磷酸（HPLC 級(jí)，濃度85%，Dikma 公司）；醋酸銨（LC-MS級(jí)，5 mol/L，Sigma-Aldrich 公司）；甲酸、乙酸（LC-MS級(jí)），異丙醇、二氯甲烷（HPLC級(jí)）（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

人參皂苷Rg1（供含量測(cè)定用，純度按96.3%計(jì)），Re（供含量測(cè)定用，純度按92.7%計(jì)），Rf（供含量測(cè)定用，純度≥98%）、Rb1（供含量測(cè)定用，純度按92.9%計(jì)）、Rb2（供含量測(cè)定用，純度按93.8%計(jì)）、Rd（供含量測(cè)定用，純度按94.4%計(jì)）、Rb3（供含量測(cè)定用，純度按92.7%計(jì)）（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；Rc（純度＞98%，化學(xué)對(duì)照品）、人參皂苷Ro（純度＞98%）（成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司）；苯甲酰新烏頭原堿（BMA）、苯甲酰烏頭原堿（BAC）、苯甲酰次烏頭原堿（BHA）、新烏頭堿（MA）、次烏頭堿（HA）和烏頭堿（AC）（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；紅參粉（吉林撫松，5 年）；參附注射液（華潤(rùn)三九（雅安）藥業(yè)有限公司，批號(hào)：200704AK07、201203AK03、210303AK05）。

1.2 對(duì)照品溶液配制

取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加異丙醇-二氯甲烷（體積比1∶1）混合溶液制成每1 mL 各含0.1 mg對(duì)照品的儲(chǔ)備溶液。再分別取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加入體積分?jǐn)?shù)50%的異丙醇-水（含0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸）溶劑稀釋?zhuān)渲瞥少|(zhì)量濃度10μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

取人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Ro 對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置于10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Ro質(zhì)量濃度分別為2.60、2.58、2.20、2.74、2.60、2.40、2.60、2.66、2.35 mg/mL 的儲(chǔ)備溶液。再精密稱(chēng)取上述各對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，分別加甲醇稀釋?zhuān)瞥?.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品溶液制備方法

取參附注射液樣品適量，加水按照體積比4∶6（樣品∶水）稀釋?zhuān)瑩u勻后，上機(jī)分析。

1.4 色譜條件

烏頭堿類(lèi)生物堿的分析條件：SPE 泵的流動(dòng)相A 為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸，B 為乙腈，C 為100 mmol/L醋酸銨；SPE柱為Zorbax SCX（4.6 mm×12.5 mm×5μm），流速為1.0 mL/min；分析泵的流動(dòng)相A 為100 mmol/L 醋酸銨，流動(dòng)相B 為乙腈，分析柱為Zorbax SB-C18（4.6 mm×150 mm×3.5μm）。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣體積為200μL，柱溫為35 ℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm。Online SPE 的系統(tǒng)連接見(jiàn)圖1，閥1（V1）的切換過(guò)程：0 ～16 min，1-6；16 ～17.8 min，1-2；17.8 ～56.5 min，1-6。閥2（V2）保持在1-6。

表1 SPE泵和分析泵的梯度洗脫程序（烏頭堿類(lèi)生物堿檢測(cè)）Table 1 Gradient program of SPE and analytical pumps（aconitine-type alkaloids assay）

圖1 在線(xiàn)固相萃取和柱切換系統(tǒng)連接示意圖Fig.1 Flow scheme of online SPE and column switching system A. aconitine-type of alkaloids（烏頭堿類(lèi)生物堿）；B. ginsenosides（人參皂苷）

進(jìn)行人參皂苷分析時(shí)，流動(dòng)相A為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）磷酸，流動(dòng)相B為乙腈，采用Poroshell EC-C18（4.6 mm × 100 mm × 2.7 μm）作為分析柱。流速為1.0 mL/min，梯度洗脫過(guò)程為：0 ～5 min，10% B；5 ～6 min，10% ～19% B；6 ～10 min，19% B；10 ～24 min，19% ～24% B；24 ～45 min，24% ～36% B；45 ～48 min，36% ～95% B；48 ～50 min，95% B。柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，進(jìn)樣量5 μL。以Poroshell EC-C18（4.6 mm × 5 mm × 2.7 μm）作為保護(hù)柱；閥2（V2）切換過(guò)程：進(jìn)樣后，0 ～5 min，1-2；5 ～50 min，1-6。閥1（V1）位置保持在1-2。

2 結(jié)果與討論

2.1 Online SPE方法的建立

樣品制備是復(fù)雜樣品分析過(guò)程的重要組成部分，也是最為耗時(shí)、費(fèi)力的過(guò)程，已成為制約快速分析的主要瓶頸，而在線(xiàn)聯(lián)用樣品制備策略是發(fā)展快速分析方法的重要方向，其中基于柱切換液相色譜的在線(xiàn)online SPE技術(shù)是被廣泛應(yīng)用的一種在線(xiàn)樣品制備技術(shù)［19-20］。SPE柱是方法構(gòu)建的關(guān)鍵，主要基于目標(biāo)待測(cè)物性質(zhì)及其與SPE 的吸附相互作用進(jìn)行選擇，同時(shí)也要考慮樣品基質(zhì)的組成情況［21］。實(shí)驗(yàn)根據(jù)附子中烏頭堿類(lèi)生物堿的理化性質(zhì)，選擇強(qiáng)陽(yáng)離子交換（SCX）小柱作為online SPE柱，以選擇性富集生物堿。除附子生物堿外，基質(zhì)中還含有人參皂苷、有機(jī)酸、核苷、多糖等其他內(nèi)源基質(zhì)成分［10］，以及吐溫80等輔料。為降低上述物質(zhì)的干擾，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了SPE 洗脫除雜過(guò)程，分別采用高水相（乙腈∶0.1%磷酸= 5∶95，體積比）的“弱洗脫”和高有機(jī)相（乙腈∶0.1%磷酸= 95∶5，體積比）的“強(qiáng)洗脫”兩步凈化除雜過(guò)程，最大程度地去除非生物堿類(lèi)成分的干擾。由圖2 可知，基于硅膠載體的Zorbax SCX小柱能夠有效保留目標(biāo)待測(cè)物，同時(shí)達(dá)到了較好的凈化效果。

圖2 紅參陰性對(duì)照溶液（A）、參附注射液（B）和烏頭堿類(lèi)生物堿混合對(duì)照品（C）的色譜圖Fig.2 The chromatograms of red ginseng negative control solution（A），Shenfu injection（B）and mixed standards of aconitine-type alkaloids（C）1.benzoylmesaconine（苯甲酰新烏頭原堿），2.benzoylaconine（苯甲酰烏頭原堿），3.benzoylhypaconine（苯甲酰次烏頭原堿），4.mesaconine（新烏頭堿），5.aconine（烏頭堿），6.hypaconine（次烏頭堿）

目標(biāo)物洗脫時(shí)，采用分析泵的流動(dòng)相反向沖洗SPE 柱，并結(jié)合100 mmol/L 醋酸銨-乙腈（體積比80∶20）混合溶劑，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分析物的快速轉(zhuǎn)移?？疾炝藶躅^堿類(lèi)生物堿6 個(gè)對(duì)照品混合溶液的洗脫效果和洗脫時(shí)間，結(jié)果顯示，在16 ～17.5 min，SPE 上吸附的目標(biāo)物可被完全洗脫，因此確定轉(zhuǎn)移時(shí)間即閥1（V1）的切換時(shí)間為1.5 min。在優(yōu)化梯度條件下，6 個(gè)目標(biāo)待測(cè)生物堿分離良好（圖2C），且烏頭堿和次烏頭堿的分離度大于1.5。

2.2 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn) 按照確定的色譜條件，分別進(jìn)樣混合對(duì)照品、參附注射液樣品和紅參陰性對(duì)照溶液，其中混合對(duì)照品中苯甲酰新烏頭原堿等6種烏頭堿類(lèi)生物堿的分離色譜圖如圖2C 所示。結(jié)果顯示，各目標(biāo)待測(cè)物分離良好。參附注射液樣品中未檢測(cè)到新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿3 種雙酯型生物堿，苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿3 種單酯型生物堿無(wú)其他基質(zhì)成分干擾，其UV 吸收光譜與對(duì)照品一致，色譜峰的純度因子［22］分別為999、998 和998，表明目標(biāo)峰純度較好，基質(zhì)干擾少。以上結(jié)果說(shuō)明本方法專(zhuān)屬性較好，可對(duì)化合物進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

按照“1.4”中人參皂苷的分析條件，分別進(jìn)樣混合對(duì)照品和參附注射液樣品溶液，由圖3 可知，9種目標(biāo)人參皂苷分離良好，各目標(biāo)峰的峰純度因子均大于980，表明各峰純度較好，其他基質(zhì)成分干擾較少，方法專(zhuān)屬性良好。

圖3 人參皂苷混合對(duì)照品（A）和參附注射液樣品（B）的分離色譜圖Fig.3 The chromatograms of mixed standards of nine ginsenosides（A）and Shenfu injection（B）1-9：ginsenoside Rg1，Re，Rf，Rb1，Rc，Ro，Rb2，Rb3，Rd

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取1.0μg/mL 的生物堿混合對(duì)照品溶液，按“1.4”烏頭堿類(lèi)生物堿的分析方法連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果顯示，苯甲酰新烏頭原堿等6種目標(biāo)待測(cè)物保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，%）均小于0.10%；峰面積的RSD 小于0.70%。同時(shí)取100 μg/mL 的人參皂苷混合對(duì)照品溶液，按照“1.4”人參皂苷的分析方法連續(xù)進(jìn)樣5 次。結(jié)果顯示9 種人參皂苷保留時(shí)間的RSD 均小于0.08%；峰面積的RSD均小于2.0%。表明方法的精密度較好。

2.3 線(xiàn)性關(guān)系、檢出限與定量下限

取10μg/mL的苯甲酰新烏頭原堿等6個(gè)混合對(duì)照品溶液，以50%異丙醇（含0.1%甲酸）逐級(jí)稀釋?zhuān)瞥少|(zhì)量濃度分別為2.0、1.0、0.2、0.1、0.05、0.02μg/mL的系列對(duì)照品溶液，按照烏頭堿類(lèi)生物堿的分析條件進(jìn)樣分析，進(jìn)樣體積200μL。以目標(biāo)物的峰面積為縱坐標(biāo)（y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），考察各目標(biāo)待測(cè)物的線(xiàn)性關(guān)系。另取人參皂苷各標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液適量至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成100μg/mL的混合對(duì)照品溶液，再取混合對(duì)照品溶液適量，加甲醇逐級(jí)稀釋制成質(zhì)量濃度分別為40、20、8、4、1.6μg/mL的系列溶液，分別取混合對(duì)照品溶液和系列稀釋后溶液，按照人參皂苷的分析方法進(jìn)樣分析，進(jìn)樣體積5μL，以目標(biāo)物的峰面積為縱坐標(biāo)（y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），考察各目標(biāo)待測(cè)物的線(xiàn)性關(guān)系。結(jié)果顯示，苯甲酰新烏頭原堿等6個(gè)烏頭堿類(lèi)生物堿及9種人參皂苷的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.999，按照信噪比（S/N）為3∶1計(jì)算檢出限（LOD），得到BMA、BAC、BHA、MA、HA和AC的LOD分別為4.8、5.9、8.2、4.7、4.0、4.0 ng/mL；按照S/N=10∶1計(jì)算定量下限（LOQ），得到BMA、BAC、BHA、MA、HA和AC的LOQ分別為15.9、19.6、27.2、15.8、13.3、13.3 ng/mL。結(jié)果見(jiàn)表2。本文采用大體積進(jìn)樣結(jié)合高靈敏度UV檢測(cè)器，得到的目標(biāo)待測(cè)生物堿的檢出限顯著低于其他UHPLC-UV分析方法［13］。

表2 線(xiàn)性關(guān)系、定量下限和檢出限結(jié)果Table 2 Results of linearity relationship，LOQs and LODs

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取參附注射液樣品5 份，按照樣品溶液制備方法制備上機(jī)溶液，進(jìn)樣分析。結(jié)果參附注射液中BMA、BAC和BHA含量的RSD分別為1.3%、1.2%和0.59%，MA、AC和HA 3種雙酯型生物堿未檢出；9種人參皂苷含量的RSD在0.21%～1.6%之間。表明方法重復(fù)性較好。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取“2.6”部分中等加標(biāo)水平的參附注射液樣品溶液，分別在0、2、4、12、16、18 h 按照“1.4”烏頭堿類(lèi)生物堿的色譜條件進(jìn)樣分析，考察6 種待測(cè)物的穩(wěn)定性，結(jié)果BMA、BAC、BHA、MA、AC和HA 峰面積的RSD 分別為1.7%、0.47%、0.62%、0.29%、0.67%和0.53%，表明目標(biāo)待測(cè)生物堿在18 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好；另取參附注射液樣品溶液，按照“1.4”中確定的人參皂苷分析條件，分別在0、2、4、6、12 h進(jìn)樣分析，結(jié)果各人參皂苷測(cè)得量的RSD均小于2.0%，表明待測(cè)的9種人參皂苷在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

取參附注射液樣品12份，每份4 mL，置10 mL量瓶中，分別加入10μg/mL的BMA 等6種烏頭堿類(lèi)生物堿混合對(duì)照品溶液0.5、1.0 和1.5 mL，加水定容到刻度，搖勻；另取BMA 等混合對(duì)照品溶液相應(yīng)體積置10 mL 量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，作為隨行參照溶液。再取參附注射液樣品12 份，每份2 mL，置10 mL 量瓶中，分別加入100μg/mL 的9 種人參皂苷混合對(duì)照品溶液1.0、2.0 和3.0 mL，加水定容到刻度，搖勻；另取人參皂苷的混合對(duì)照品溶液相應(yīng)體積置10 mL 量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，作為人參皂苷的隨行參照溶液。分別按照“1.4”烏頭堿類(lèi)生物堿和人參皂苷的分析條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。由表3 結(jié)果可知，6 種烏頭堿類(lèi)生物堿的平均回收率為95.1% ～98.6%，9 種人參皂苷的平均回收率為91.7%～104%。結(jié)果表明方法的準(zhǔn)確度良好，完全滿(mǎn)足測(cè)定要求。

表3 15個(gè)目標(biāo)物的平均加標(biāo)回收率（n=2）Table 3 The average spiked recoveries for fifteen target analytes（n=2）

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

取3 批參附注射液，按照“1.3”樣品溶液制備方法和“1.4”的色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定目標(biāo)待測(cè)物的含量。結(jié)果見(jiàn)表4。樣品中未檢測(cè)到烏頭堿等3種雙酯型生物堿，其他3種單酯型生物堿的總量為2.72 ～4.03μg/mL。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=2）Table 4 Content results of samples（n=2） （μg/mL）

在人參皂苷測(cè)定中，由于樣品基質(zhì)復(fù)雜，當(dāng)采用“1.4”人參皂苷的色譜條件直接進(jìn)樣分析時(shí)，在UV 203 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，前5 min內(nèi)色譜圖中包含大量吸收較高的弱保留基質(zhì)成分（圖4A），同時(shí)多次累加進(jìn)樣還會(huì)造成色譜柱和檢測(cè)器的污染。而利用柱切換的方式能夠有效去除0 ～5 min 內(nèi)的極性差異較大的基質(zhì)成分，避免對(duì)分析柱和后端檢測(cè)器的污染，改善方法的整體耐用性（圖4B）。

圖4 直接進(jìn)樣方式（A）和柱切換方式（B）下參附注射液的分析譜圖Fig.4 Chromatograms of SFI by direct injection（A）and column switching（B）peak 1-9：ginsenoside Rg1，Re，Rf，Rb1，Rc，Ro，Rb2，Rb3，Rd

3 結(jié) 論

本文建立了在線(xiàn)固相萃取/液相色譜分析方法對(duì)參附注射液中源于附子的烏頭堿類(lèi)生物堿進(jìn)行測(cè)定。采用基于強(qiáng)陽(yáng)離子交換的SPE 柱選擇性富集生物堿類(lèi)成分，結(jié)合優(yōu)化的SPE 洗脫過(guò)程，有效去除了非生物堿類(lèi)基質(zhì)成分的干擾，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的快速分析。方法學(xué)考察結(jié)果表明本法準(zhǔn)確、可靠，可用于實(shí)際樣品中BMA、BAC、BHA3 個(gè)單酯型生物堿的定量，同時(shí)兼顧了AC、MA 和HA3 個(gè)毒性較強(qiáng)的雙酯型生物堿的限量檢測(cè)。另外本文還建立了Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd 9 種人參皂苷含量的測(cè)定方法，兼顧了紅參中含量較高的齊墩果烷型人參皂苷Ro 的定量，縮短了整體分析時(shí)間；同時(shí)，采用柱切換的方式能夠去除樣品中極性較大、保留較弱的基質(zhì)成分，有效保護(hù)色譜柱和檢測(cè)器。由于本方法較常規(guī)分析方法復(fù)雜，且online SPE 柱的批間穩(wěn)定性可能會(huì)影響方法整體的耐用性，因此后續(xù)工作將針對(duì)方法耐用性進(jìn)行系統(tǒng)、深入的考察，以促進(jìn)本法在實(shí)際樣品質(zhì)量控制中的應(yīng)用。