于曉瑾，劉采艷，張萌，王碩，袁旭，韓華

摘要：目的：對刺玫籽油進行體外抗氧化活性評價，旨在為刺玫籽油的進一步研究及刺玫果的綜合開發(fā)利用提供科學依據(jù)。方法：以刺玫果籽為原料，利用索氏提取法提取刺玫果籽油，并以刺玫果籽油的提取率為指標，在單因素分析的基礎上，選取提取溫度、粉碎目數(shù)、溶劑體積3個因素進行響應面優(yōu)化試驗。以維生素C為陽性對照，對所提取的刺玫果籽油進行體外抗氧化活性分析。結果：當溶劑體積333? mL、提取溫度82 ℃、粉碎度60目時，刺玫果籽油的提取率為18.84%。此外，刺玫果籽油清除ABTS 自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基的作用存在量效關系，且IC50值分別為29.73、34.58、40.54 μg/mL，而同濃度維生素C清除自由基的IC50值分別為26.51、49.62、26.37 μg/mL，此外，刺玫果籽油還具有一定的還原力。結論：利用響應面優(yōu)化法優(yōu)化提取工藝參數(shù)可提高刺玫籽油的提取率，刺玫籽油還具有較好的抗氧化活性，可作為一種潛在可用的天然抗氧化劑。

關鍵詞：刺玫果;種子油;索氏提取法;中心組合響應面設計 ;抗氧化活性

刺玫果（Rosa davurica）是一種藥食同源的野生漿果，主要分布于中國吉林、遼林、黑龍江省等地。刺玫籽蘊藏的油脂中包含各種維生素、類胡蘿卜素[1] （β-胡蘿卜素、番茄紅素）、植物甾醇[1]、角鯊烯、多酚及多不飽和脂肪酸（52.52%亞油酸、23.50%亞麻酸、12.39%油酸、5.88%棕櫚酸）[2]等營養(yǎng)物質[3-7]。同時，刺玫籽油也是一種極好的天然保濕油 [8-9]。此外，屈巖峰等[10]報道了往一級大豆油中添加0.2%的刺玫果籽油具有較好的抗氧化效果;高陽等[11]報道了不同溶劑的刺玫果種子萃取物具有一定的抗氧化活性。目前，提取刺玫籽油的方法主要有酶解法、超臨界CO2萃取法、超聲提取法，而利用響應面法優(yōu)化索氏提取刺玫籽油及其體外抗氧化活性分析尚無相關文獻報道。本試驗以刺玫果籽為原材料，利用索氏提取法提取刺玫籽油，并采用Central Composite Design響應面優(yōu)化法（CCD-RSM） 對工藝參數(shù)進行優(yōu)化，再以維生素C為陽性對照，利用ABTS（ABTS+·）法，DPPH（DPPH·）法，超氧陰離子自由基（O-2·）清除法及還原Fe3+作用對刺玫籽油進行體外抗氧化活性評價，旨在為刺玫籽油的進一步研究及刺玫果的綜合開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1原料

刺玫果;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），上海金穗生物科技有限公司;2，2'氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）銨鹽（ABTS），合肥巴斯夫生物科技有限公司。

1.2主要儀器設備

TGL-16LG高速離心機，湖南星科科學儀器有限公司;0SB-2100旋轉蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司;Synergy MX酶標儀，美國BIOTEK公司。

1.3方法

1.3.1刺玫籽油的提取溶劑的選擇準確稱取刺玫籽粉末20.00 g，裝入脫脂濾紙筒中，并以無水乙醇、乙酸乙酯、正己烷、石油醚為提取溶劑，利用索氏提取法在適宜的條件下進行刺玫籽油的提取，刺玫籽油提取率按式（1）計算。

y=m2m1×100% （1）

式（1）中，m1為刺玫籽粉末質量（g）;m2為刺玫果籽油質量（g）。

1.3.2單因素試驗準確稱取20.00 g刺玫籽粉末于脫脂濾紙筒中，利用索氏提取法提取刺玫果籽油，并以溶劑體積、提取溫度、粉碎目數(shù)、提取時間5個因素進行單因素設計。設定溶劑體積分別為140 、200、260、320、360 mL;提取溫度分別為70、75、80、85、90 ℃;粉碎目數(shù)分別為0、20、40、60、80目;提取時間分別為180、210、240、270、300、330 min，分析各個因素對刺玫籽油提取率的影響。

1.3.3CCD-RSM法優(yōu)化刺玫籽油提取工藝參數(shù)在單因素試驗的基礎上，選溶劑體積（X1）、提取溫度（X2）、粉碎目數(shù)（X3）作為變量，刺玫籽油提取率為響應值進行響應面優(yōu)化實驗。利用Design Expert10.0.3軟件，進行Central Composite Design（CCD）實驗方案，進行三因素三水平試驗設計，并將所得結果進行相應的統(tǒng)計學分析，確定最優(yōu)的工藝參數(shù)，試驗因素及水平見表1。

1.3.4刺玫籽油體外抗氧化活性研究

（1）刺玫籽油清除ABTS+·活性測定：將ABTS溶液與過硫酸鉀溶液等體積混合，置于黑暗條件下氧化12 h，然后加無水乙醇稀釋反應液，并在734 nm波長下調節(jié)其吸光度值為0.7左右。其次，利用無水乙醇將刺玫果籽油配制成一序列質量濃度，并以維生素C溶液作為陽性對照，在96孔板中加入100 μL的ABTS工作液及30 μL的樣品溶液，震蕩混勻，避光反應5 min，于734 nm波長處測定溶液的吸光度值A，以式（2）計算刺玫籽油清除ABTS活性[12]。

ABTS+·清除率%=（A0-A樣）A0×100%（2）

式（2）中，A樣為30 μL樣品溶液與100 μL ABTS溶液混合后的吸光度值;A0為30 μL乙醇溶液與100 μL ABTS溶液混合后的吸光度值。

（2）刺玫籽油清除DPPH·活性測定：將配置好的DPPH乙醇儲備液，加無水乙醇溶液稀釋，并在517 nm波長處調節(jié)吸光度值為0.7左右。與ABTS試驗相似，在96孔板中加入100 μL的DPPH溶液及30 μL的樣品溶液，震蕩混勻，避光反應30 min后，于517 nm波長處測定溶液的吸光度值A，以式（3）計算刺玫籽油清除DPPH·活性[11]。

DPPH·清除率（%）=（A0-A樣）A0×100%（3）

（3）刺玫籽油清除O-2·活性測定：參照文獻[13]，并稍作修改，精密量取500 μL Tris-HCl（pH 8.2）溶液于12支試管中，置于37 ℃水浴鍋內(nèi)預熱20 min。待預熱結束后，于試管中分別加入不同濃度樣品溶液，在其中的6支試管內(nèi)加入40 μL鄰苯三酚溶液（25 mmol/L），充分混勻后置于37 ℃水浴鍋內(nèi)反應5 min，加入8 mmol/L HCl終止反應。最終，移取 100 μL溶液置于325 nm波長處測光度值A，并利用式（3）計算刺玫籽油對O-2·的清除率。

O-2·清除率（%）=[A0-（A1-A2）]A0×100%（4）

式（4）中，A0為含有鄰苯三酚的空白溶液的吸光度值;A1為含有樣品溶液及鄰苯三酚的吸光度值;A2為只含樣品溶液的吸光度值。

（4）刺玫籽油還原力的測定：參照文獻[14-15]。

1.3.5數(shù)據(jù)處理每組做3個平行樣，結果以X±SD值表示，利用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析及差異性分析，P<0.05表示差異性具有統(tǒng)計學意義，并利用GraphPad Prism 8.0.1 進行圖的繪制。

2結果與討論

2.1不同溶劑對刺玫籽油提取率的影響

選取石油醚、正己烷、乙酸乙酯、無水乙醇4種溶劑分別提取刺玫籽油。由圖1可知，4種常用的提取溶劑對刺玫籽油的溶解性具有差異性，其中以石油醚為提取溶劑所獲得的刺玫籽油量最佳，為11.23%;正己烷為10.96%;無水乙醇為5.74%;乙酸乙酯最低，為2.09%。其中，石油醚沸程長，回收時溫度不易控制，而正己烷的沸程短、毒性低、且提取率與石油醚相差0.27%，故選取正己烷為刺玫籽油的提取溶劑。

2.1.1提取時間對刺玫籽油提取率的影響在水浴溫度為80 ℃、粉碎度為60目、溶劑260 mL的條件下，分析180、210、240、270、300、330 min時對提取率的影響。由圖2可知，當提取時間為180 min時提取率最低為8.96%，且伴隨溫度升高，刺玫籽油的提取率逐漸升高，240 min時刺玫籽油的提取率達到最高為12.88%;但超過240 min時刺玫籽油提取率略下降，且所得的油內(nèi)有白色乳濁液。可能是由于加熱時間過長導致溶劑的揮發(fā)及刺玫籽油中某些成分分解。此外，唐小媛等[16]研究表明，長時間的萃取會加劇油脂乳化，嚴重影響油的質量。因此綜合考慮選取240 min為最終提取時間。

2.1.2粉碎度對刺玫籽油提取率的影響水浴溫度為80 ℃、溶劑體積260 mL、提取時間為240 min時，分析不同粉碎度對刺玫籽油提取率的影響。由圖3可知，不粉碎刺玫籽時，刺玫籽油提取率為4.52%，隨著粉碎目數(shù)的增大，呈上升狀態(tài)。這是由于隨著比表面積的增大，刺玫籽與溶劑接觸面積增大，促進了油的溶出;此外，由于破壞細胞結構也可使正己烷與細胞內(nèi)的油脂充分接觸[17]。當粉碎度達60目時，刺玫籽油提取率最高為13.56%，而80目時提取率為13.51%，油中存在大量雜質。這可能是長時間的研磨，導致油脂達到損失，而且刺玫籽粉末的粒徑過小時，會導致粉末堆積密度增大，從而降低了溶劑的擴散速率，致使刺玫籽油提取率減少[18]。故選取60目為后續(xù)實驗的粉碎度。

2.1.3溶劑體積對刺玫籽油提取率的影響當提取溫度為82 ℃、粉碎度為60目、提取時間為240 min的條件時，分析溶劑體積分別為140、200、260、320、380 mL對油脂提取率的影響。由圖4可知，當溶劑體積為140 mL時，刺玫籽油提取率最低為9.77%，200 mL時達到最高為13.03%，這是由于濃度差的存在，伴隨溶劑量的增大，提取率亦增加。溶劑體積為260 mL時提取率為11.34%，這可能是由于溶劑中油脂濃度達到飽和狀態(tài)，促使刺玫籽中油脂溶出的動力減少，從而導致刺玫果籽油的提取率降低。蔣新龍等[19]人的實驗結果表明，棠梨籽中油脂降低時，導致有效濃度差減小，即使增加溶劑量，對棠梨籽油的提取率的影響也較小，還會造成溶劑的浪費。因此，選取溶劑體積為320 mL用于后續(xù)的實驗。

2.1.4溫度對刺玫籽油提取率的影響當粉碎度為60目、提取時間為240 min、溶劑體積為320 mL時，分析溫度為70、75、80、85、90℃時對提取率的影響。由圖5可知，當水浴溫度為70 ℃時籽油提取率最低為2.00%，80 ℃時為13.11%，可能是由于隨著溫度的升高，加劇了刺玫籽油內(nèi)分子熱運動，促進了刺玫籽油的溶出及正己烷的滲透;當水浴溫度為85 ℃時，刺玫籽油的提取率達到最高為13.77%;而溫度為90 ℃時，籽油提取率為12.50%，油顏色較深，伴隨大量雜質，可能是由于溫度過高導致短期內(nèi)正己烷的大量蒸發(fā)，而冷凝效果不變，使得溶劑未能與原料充分接觸，降低了油脂的擴散速率。Mohammadpour等[20]研究表明，當溫度過高可導致正己烷氣化，致使液固比降低及低沸點物質的分解。因此，鑒于刺玫籽油的品質及提取率，選取溫度為85 ℃為刺玫籽油提取的最適工藝參數(shù)。

2.2響應面優(yōu)化結果分析

2.2.1建立回歸模型方程由單因素方差分析得出提取時間P>0.05，故提取時間對刺玫籽油提取率的影響較小。因此，選取料液比、溫度、粉碎目數(shù)為響應面設計因素，進行中心組合設計。利用Design8.0對表2中的數(shù)據(jù)進行回歸分析可得響應面模型方程：Y=18.08-0.062X1-0.32X2+4.81X3-0.3X1X2+0.23X1X3-0.68X2X3-0.77X12-0.34X22-6.19X32

2.2.2模型及回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗由表3可知，F(xiàn)回歸=475.09，P<0.000 1，表明該模型達到顯著性水平，其回歸方程具有統(tǒng)計學意義，模型可靠，可用來分析與預測刺玫果籽油的提取率;失擬P=0.1019>0.05，不顯著，說明該模型擬合較好，其建立的回歸方程比較準確;此外，決定系數(shù)R2與調整系數(shù)Radj2的差別不大，說明本模型擬合度較佳，可用于確定本試驗的最佳工藝[20]。其次，溶劑體積（X1）、水浴溫度（X2）、粉碎目數(shù)（X3）對刺玫籽油的提取率均有顯著性的影響; 由P值可知，各因素對刺玫籽油的提取率的影響大小為X3>X2>X1，即粉碎度>溫度>溶劑體積;X2與X3的交互作用影響極顯著，而X1與X2，X1與X3的交互作用影響顯著;模型中X2、X3、X2X3、X12、X32對Y值的都具有顯著性的影響，說明試驗因素對響應值不僅是單純的線性關系，而且都具有顯著性影響。此外，由圖6可知，X2、X3的曲線相對于X1的較為陡峭，表明水浴溫度、粉碎目數(shù)對刺玫籽油提取率的影響程度大于溶劑體積;等高線圖是

響應面在平面的投影，其形狀越趨近于橢圓且排列越緊密時，預示倆個因素的交互作用越顯著、對刺玫籽油提取率的影響越明顯[21]。X1X2的等高線圖呈圓形、排列稀疏且方差分析結果中P>0.05，故料液比、水浴溫度對刺玫籽油提取率的影響不顯著;X1X3、X2X3的等高線圖都趨近于橢圓，但X2X3的曲面較陡峭，且P<0.000 1，而X1X3的曲面較平緩，且P>0.01，故X2X3對于刺玫籽油提取率的影響較X1X3顯著，即水浴溫度與粉碎度的交互作用對于響應值的影響程度大于溶劑體積與粉碎度的交互作用。

2.2.3CCD-RSM優(yōu)化的驗證由軟件Design expert10.0.3設計的響應面實驗中可知，當提取最優(yōu)條件為：溶劑體積333.26 mL、水浴溫度82 ℃、粉碎度68.95目時，刺玫籽油的最佳提取率為19.31%;因此，在考慮實驗設備及可行性的條件下，確定溶劑體積333 mL、水浴溫度82 ℃、粉碎目數(shù)60目為最佳條件進行3次平行試驗，并求得平均值為18.84%，與理論值相差0.47%，與理論值相差較小，說明響應面實驗模型與現(xiàn)實情況的擬合度較佳，可信度及穩(wěn)定性較好。因此，基于CCD響應面法優(yōu)化獲取的工藝參數(shù)具有合理性。容晨曦等[23]利用超聲提取法對刺玫籽油的提取率為11.92%。任潔等[2]利用酶解法及低溫壓榨法的提取率分別為9.0%、4.5%。相比之下，本試驗的提取率較高。

2.3刺玫籽油體外抗氧化活性結果分析

2.3.1刺玫籽油清除ABTS+·能力根據(jù)1.2.5，以維生素C作為陽性對照，測定不同濃度刺玫籽油對ABTS+·清除活性?？寡趸瘎┛膳cABTS+·反應，使藍綠色的ABTS+·溶液褪色，從而降低其吸光度值，且清除ABTS+·的能力與吸光度值呈負相關。由圖7可知，刺玫籽油的對ABTS+·的清除率存在量效關系，當刺玫籽油的濃度為10 μg/mL時對ABTS+ ·的清除率為30.25%;50 μg/mL時，為80.89%，而10.50 μg/mL維生素C溶液的ABTS+·的清除率分別為34.91%、87.49%;此外，經(jīng)計算刺玫籽油的IC50值為29.73 μg/mL，而維生素C的IC50值為26.51 μg/mL。因此，維生素C清除ABTS+·的活性優(yōu)于刺玫籽油。唐琳琳等[23]研究發(fā)現(xiàn)，利用索氏提取法提取的紅樹酶籽油清除ABTS+·的IC50值為20.41 mg/mL。故，相對于紅樹酶籽油，刺玫籽油ABTS+·清除能力更強。

2.3.2刺玫籽油清除DPPH·能力根據(jù)1.2.5，以維生素C為陽性對照，測定不同濃度刺玫籽油對DPPH·清除活性。DPPH·與抗氧化劑的H+或者電子結合可使溶液顏色由紫色變?yōu)辄S色，從而降低吸光度值[24]。由圖8可知，當刺玫籽油濃度為10 μg/mL時，清除率為14.19%，且隨著刺玫籽油質量濃度的升高，其清除DPPH·的效果也越佳。當刺玫籽油的濃度為50 μg/mL時，DPPH·清除率為89.93%，并且IC50值為34.58 μg/mL;而同濃度的維生素C溶液自由基清除率為61.37%，IC50值為49.62 μg/mL，故刺玫籽油清除DPPH自由基的能力強于維生素C。

2.3.3刺玫籽油清除O-2·能力以維生素C作為陽性對照，測定不同濃度刺玫籽油對清除O-2·活性。O-2·為人體內(nèi)存在的活性氧之一，具有氧化作用。當其產(chǎn)生異常時，會損壞機體細胞、DNA及蛋白質，導致機體衰老、炎癥、癌癥及心血疾病等系列疾病的發(fā)生[25-27]。鄰苯三酚在Tris-HCl（pH 8.2）溶液中可發(fā)生自氧化產(chǎn)生O-2·及有色中間體，抗氧化劑可催化O-2·與氫分子的反應，且抗氧化劑中的微量元素可與中間體螯合，阻礙中間體的累積，從而降低吸光度。由圖9可知，在試驗濃度10～50 μg/mL范圍內(nèi)，刺玫籽油清除O-2·的能力隨濃度的增大而增強。其 IC50值為40.54 μg/mL，而維生素C的IC50值為26.37 μg/mL，故刺玫籽油清除O-2·能力弱于維生素C。羅偉強等[29]對絲瓜籽油的抗氧化活性實驗結果表明，其對O-2·的清除能力為IC50=0.069 mg/mL;高妮娜等[30]對奇亞籽油行體外抗氧化活性評價結果得出其清除O-2·的IC50值為4.97 mg/mL因此，刺玫籽油清除O-2·的能力優(yōu)于絲瓜籽油及奇亞籽油。

2.3.4刺玫籽油還原力測定以維生素C作為陽性對照，測定不同濃度刺玫籽油還原力。由圖10可知，10～50 μg/mL濃度范圍內(nèi)刺玫籽油還原能力隨著質量濃度的升高，逐漸增大，當濃度為50 μg/mL時，吸光度最大為0.12，而同濃度的維生素C的還原力為0.41，可能是維生素C內(nèi)酯環(huán)的烯醇式結構與羰基的共軛作用[20]，從而增強了維生素C的還原力作用。

3討論

刺玫果籽油富含生育酚、不飽和脂肪酸、多酚、植物甾醇及類胡蘿卜素，可作為優(yōu)良的食用油，但提取技術受限是其未能大規(guī)模生產(chǎn)的原因之一。屈巖峰等[10]利用CO2超臨界萃取技術提取率達97.79%;容晨曦[23]等利用超聲提取法對刺玫籽油的提取率為11.92%; 任潔等[2]利用酶解法提取率分別為9.0%。CO2超臨界萃取技術對設備要求高，超聲提取法噪音大，酶解法需要大量酶，且操作過程煩瑣。本研究采用的刺玫果籽油提取工藝得到的籽油提取率較CO2超臨界萃取技術稍低，但優(yōu)于超聲提取法及酶解法，并且操作簡單，設備要求低，噪音污染小，提取成本低，更有利于工業(yè)生產(chǎn)。由于化學合成的抗氧化劑對生物體具有潛在的毒性，近年來，尋找天然抗氧化劑成為了研究的熱點之一，尤其是富含各種抗氧化物質的植物籽油。本研究結果表明，刺玫果籽油較強的清除自由基的活性，同時具有一定的還原力，而且具有濃度依賴性。植物籽油的抗氧化活性可能與其所含的各種物質協(xié)同作用相關，而非單一成分決定。至于各物質的抗氧化作用的強弱及其活性大小與各物質結構間的聯(lián)系，有待進一步的探索。

4結論

本試驗通過對野生刺玫籽油的提取工藝及體外抗氧化活性進行研究，采用索氏提取法對刺玫籽油進行提取，基于單因素試驗的基礎上，利用 CCD-RSM優(yōu)化法對刺玫籽油的提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，獲得提取刺玫籽油的最佳工藝：溶劑體積333 mL、溫度82 ℃、粉碎度60目，此條件下，最佳的刺玫籽油提取率為18.84%，與理論值相差0.47%。該方法操作簡便、提取率高，且所得的結果可信，因此，該方法可用于刺玫籽油的提取。此外，由于抗氧化反應機制的復雜性，無法用單一的檢測方法綜合評價物質的抗氧化能力。因此，本實驗采用ABTS+·清除法、DPPH·清除法、O-2·清除法、還原力的測定法對刺玫籽油的體外抗氧化活性進行評價。刺玫籽油清除ABTS+·、O-2·、DPPH·試驗中，對自由基的清除率最高可分別達80.89%、79.64%、89.93%，尤其對DPPH自由基的清除活性最強，表明刺玫籽油具有較好的抗氧化活性。此外，在Fe3+還原試驗中，結果表明刺玫籽油具有一定的還原作用。綜上所述，基于CCD響應面法優(yōu)化提取工藝參數(shù)可提高刺玫籽油的提取率，刺玫籽油具有較強的抗氧化活性，可作為一種天然的抗氧化劑。本實驗可為刺玫籽油的深入研究奠定實驗基礎，及刺玫果的綜合開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

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Process Optimization on Soxhlet Extraction for Seed Oil from

Rosa davurica and Antioxidant Activities Analysis of Extracted Oil in Vitro

YU Xiao-jin，LIU Cai-yan，ZHANG Meng，WANG Shuo，YUAN Xu，HAN Hua

（College of Pharmacy，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

Abstract：ObjectiveThe antioxidant properties of Rosa davurica seed oil in vitro was evaluated to provide scientific basis for further studying and comprehensive development and utilization for Rosa davurica.MethodRosa davurica seed oil was extracted by Soxhlet Extraction. With extract yields as target，based on the analysis of single factors such as extraction temperature，crushing mesh number，extraction time and solvent volume. The experiment of response surface optimization was selected for extraction temperature，crushing mesh number，extraction time，solvent volume as variables，as well as the in vitro antioxidant activity of Rosa davurica? seed oil was analyzed using vitamin C as positive control.ResultThe optimum extraction conditions were projected as solvent volume 333 mL，extraction temperature 82 ℃，crushing mesh number 60 mesh，and the yield of 18.84% were obtained. Moreover，these results demonstrated that Rosa davurica seed oil had dose-effect on the scavenging rate of ABTS，DPPH，superoxide anions that the IC50 values were 29.73 μg/mL，34.58 μg/mL，40.54 μg/mL，respectively，compared to that of vitamin C group was 26.51 μg/mL，49.62 μg/mL，26.37 μg/mL，respectively. Besides，it also possessed definite reducing powering.Conclusion Response Surface Optimization Method is adopted to improve the extraction rate of Rosa davurica seed oil，the seed oil from Rosa davurica shows significant antioxidant capacity，and can be usedas a potentially available natural antioxidant.

Keywords：Rosa davurica; seed oil; soxhlet extraction; central composite response surface design; antioxidant activity