苗金魚 何麗彩 劉 媛 王春艷 王敬然 丁秋蕾

1.石家莊市人民醫(yī)院檢驗科，河北石家莊 050000；2.河北省優(yōu)撫醫(yī)院外一科，河北石家莊 050000；3.石家莊市人民醫(yī)院腫瘤科，河北石家莊 050000

結(jié)腸癌是我國第二大癌癥，2020 年我國新確診結(jié)直腸癌患者55.5 萬例，死亡28.6 萬例，分別占我國全部癌癥的12.2%和9.5%[1]。近年來，早期結(jié)腸癌檢出率有所上升，但標準藥物治療仍存在局限，中晚期結(jié)腸癌患者生存率仍然較低[2-3]。及時判斷結(jié)腸癌患者預后對早期采取相應措施和延長生存時間意義重大。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種小RNA 分子，通過調(diào)控靶基因表達參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。近年研究報道，miR-125b、miR-18b 在結(jié)腸癌細胞中表達上調(diào)，與細胞增殖、侵襲、遷移有關(guān)[5-6]。但關(guān)于二者在外周血循環(huán)中表達與結(jié)腸癌預后的關(guān)系尚無研究報道，本研究就此進行分析，以期為結(jié)腸癌診治和預后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年1 月至2016 年8 月石家莊市人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）收治的134 例結(jié)腸癌患者為結(jié)腸癌組，其中男71 例，女63 例；年齡41～78 歲，平均（60.54±12.54）歲；腫瘤直徑：52 例≥5 cm，82 例＜5 cm；分化程度：低分化28 例，中高分化106 例；TNM分期[7]：Ⅰ～Ⅱ期87 例，Ⅲ～Ⅳ期47 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35 例。納入標準：①經(jīng)病理檢查確診為結(jié)腸癌；②初診，未接受任何抗腫瘤治療；③患者及家屬知情并簽署同意書。排除標準：①合并腸道感染性疾病、潰瘍性結(jié)腸炎等其他腸道疾病或其他部位惡性腫瘤；②免疫和血液系統(tǒng)疾病。另選取同期我院70 名體檢健康者為對照組，其中男37 名，女33 名；年齡26～78 歲，平均（60.68±11.57）歲。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 檢測方法

采集患者入院后次日清晨和對照組體檢時空腹靜脈血，3000 r/min 離心10 min（離心半徑為10 cm），分離血清于-80℃冰箱中保存待測。TRIzol 試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司，批號：2014007）提取血清總RNA，Takara 試劑盒（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，批號：20140844）轉(zhuǎn)錄合成cDNA，Narodrop 驗證cDNA 濃度及純度，使吸光度（optical density，OD）260/OD280為1.8～2.0，使用伯樂CFX96 qRT-PCR 儀和qRT-PCR 試劑盒（廣州市銳博生物科技有限公司，批號：20142522）進行擴增。miR-125b 正向引物：5’-TAAGGACAAAACGGGACTGG-3’，反向引物：5’-CCTCTTGCCACTTGCTTTTC-3’；miR-18b 正向引物：5’-CTCGCTACGCGGCAGCACA-3’，反向引物：5’-ACGCTFCACGAATTTGCGAT-3’。反應體系（20 μl）：1 μl cDNR、1 μl上游引物、2μl上游引物、10μl SYBR Green Master Mix、6 μl ddH2O；反應條件：95℃30 s（1 個循環(huán)）、95℃15 s、62℃30 s、72℃20 s（40 個循環(huán)）。以U6（正向引物：5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’，反向引物：5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’）作為內(nèi)參校正。2-ΔΔCt法計算血清miR-125b、miR-18b 相對表達量。

1.3 隨訪

以患者出院日為起點，通過門診或電話隨訪5 年，隨訪截至2021 年8 月，記錄患者生存情況。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，服從正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；K-M 法繪制不同miR-125b、miR-18b 表達結(jié)腸癌患者生存曲線，組間比較采用log-rank 檢驗；受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析血清miR-125b、miR-18b 表達對結(jié)腸癌預后不良的預測價值，曲線下面積（area under the curve，AUC）比較采用Z 檢驗。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-125b、miR-18b 表達水平比較

結(jié)腸癌組血清miR-125b、miR-18b 表達為（0.828±0.201）、（1.205±0.166），對照組為（1.442±0.305）、（0.617±0.131）。結(jié)腸癌組血清miR-125b 表達水平低于對照組，miR-18b 表達水平高于對照組（t=15.194、25.749，P ＜0.001）。

2.2 臨床病理特征與血清miR-125b、miR-18b 表達的關(guān)系

不同TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清miR-125b和miR-18b 表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。不同性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度患者血清miR-125b 和miR-18b 表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 臨床病理特征與血清miR-125b、miR-18b 表達的關(guān)系（）

表1 臨床病理特征與血清miR-125b、miR-18b 表達的關(guān)系（）

2.3 血清miR-125b、miR-18b 表達與結(jié)腸癌患者生存率的關(guān)系

隨訪3～60 個月，中位時間36.50（17.75，49.00）個月，134 例結(jié)腸癌患者死亡52 例，總生存率為61.19%（82/134）。以血清miR-125b、miR-18b 表達均值為基準分為高低表達組，miR-125b 高表達組總生存率為77.61%（52/67），中位生存期為38.00（21.00，52.00）個月；低表達組總生存率為44.78%（30/67），中位生存期為33.00（16.00，45.00）個月。miR-18b 高表達組總生存率為41.79%（28/61），中位生存期為33.00（16.50，44.50）個月；低表達組總生存率為73.97%（54/73），中位生存期為38.00（20.50，51.50）個月。K-M 曲線顯示，miR-125b 高表達組總生存率高于miR-125b 低表達組（log-rank χ2=15.601，P ＜0.001）；miR-18b 高表達組總生存率低于miR-18b 低表達組（log-rank χ2=12.047，P ＜0.001）。見圖1。

圖1 不同血清miR-125b、miR-18b 表達結(jié)腸癌患者生存曲線

2.4 血清miR-125b、miR-18b 表達對結(jié)腸癌預后不良的預測價值

ROC 曲線顯示，血清miR-125b 與miR-18b 聯(lián)合預測結(jié)腸癌預后不良的AUC 值大于miR-125b、miR-18b 單獨預測（P ＜0.05）。見表2、圖2。

圖2 血清miR-125b、miR-18b 表達預測結(jié)腸癌預后不良的ROC 曲線

表2 血清miR-125b、miR-18b 表達對結(jié)腸癌預后不良的預測價值

3 討論

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，大多患者確診時已為晚期，失去手術(shù)根治時機[8-9]。盡管近年術(shù)后化療、放療、靶向治療等手段取得一定效果，但結(jié)腸癌細胞增殖能力和耐藥性強，超過1/3 的結(jié)腸癌患者在術(shù)后會發(fā)生局部復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移性患者5 年生存率僅為10%[10]。

表觀遺傳學在腫瘤中發(fā)揮重要作用[11]。miRNA 是表觀遺傳學的重要一環(huán)，可通過降解靶基因mRNA或抑制靶基因mRNA 的蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控靶基因的表達，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12-13]。如miR-101 能靶向Zeste 同源物2 抑制結(jié)腸癌細胞遷移[14]，miR-200c能靶向程序性死亡蛋白配體1 基因抑制結(jié)腸癌細胞增殖、遷移和侵襲[15]。miR-125b 的兩個前體為miR-125b-1 和miR-125b-2，分別位于染色體11q24.1 和21q21.1。早期研究發(fā)現(xiàn)，其在多種惡性腫瘤中異常表達，如許偉先等[16]研究報道，上調(diào)胰腺癌細胞和組織中miR-125b 表達，能抑制胰腺癌細胞增殖和遷移。洪理泉等[17]研究報道，乳腺癌細胞中miR-125b 表達下調(diào)，能靶向結(jié)合ETV63’UTR 調(diào)控Hs578T 細胞，抑制乳腺癌細胞增殖和遷移。提示miR-125b 在不同腫瘤中發(fā)揮不同作用。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌患者血清miR-125b 表達降低，且與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-125b 低表達導致結(jié)腸癌惡性進展。其機制可能與miR-125b 靶向抑制髓細胞白血病基因-1（myeloid cell leukemin-1，Mcl-1）和信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and transcription activator 3，STAT3）有關(guān)。Mcl-1 是一種凋亡調(diào)控基因，能通過維持線粒體膜穩(wěn)定，抑制細胞色素C 釋放，阻止癌細胞凋亡[18]。STAT3 為細胞信號和轉(zhuǎn)錄激活的重要激活因子，能通過激活Janus 激酶/STAT 信號通路，參與細胞增殖、分化[19]。研究表明，上調(diào)miR-125b 表達能靶向抑制Mcl-1 和STAT3 表達，進而抑制結(jié)腸癌細胞增殖、侵襲及促進凋亡[5,20]。通過繪制結(jié)腸癌患者5 年生存曲線發(fā)現(xiàn)，miR-125b 高表達組5 年總生存率顯著升高，提示miR-125b 低表達與結(jié)腸癌患者預后不良有關(guān)，可能成為預后分子標志物。

miR-18b 位于染色體Xq26.2，早期研究多報道其與氧化應激的關(guān)系[21]。miR-18b 在胃癌細胞和組織中表達上調(diào)，能靶向Kruppel 樣因子6 促進胃癌細胞增殖和侵襲[22]。Yang 等[23]研究顯示，miR-18b 在肝癌細胞中表達下調(diào)，能靶向核仁紡錘體相關(guān)蛋白-1 抑制肝癌細胞增殖。說明miR-18b 也在不同腫瘤中發(fā)揮不同作用。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌患者血清miR-18b 表達升高，且與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-18b 高表達導致結(jié)腸癌惡性進展，其機制可能與miR-18b 能靶向上調(diào)細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2B（cyclin dependent kinase 2 inhibitor B，CDK2B）有關(guān)。CDK2B 是一種促癌基因，位于多種腫瘤中經(jīng)常突變和缺失的區(qū)域，促進癌細胞生長和周期進展[24-25]。研究報道，沉默miR-18b 表達能抑制CDK2B 表達，抑制結(jié)腸癌細胞增殖和遷移[6]。進一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-18b 高表達組5 年總生存率顯著降低，說明miR-18b 高表達與結(jié)腸癌患者預后不良有關(guān)，可能成為預后分子標志物。ROC 曲線結(jié)果顯示，血清miR-125b、miR-18b 均能作為結(jié)腸癌預后不良指標，且兩指標聯(lián)合預測結(jié)腸癌預后不良的AUC 較單獨預測顯著增加，提示聯(lián)合檢測血清miR-125b、miR-18b 能提升對結(jié)腸癌預后不良預測價值。

綜上所述，結(jié)腸癌患者血清miR-125b 表達降低，miR-18b 表達升高，與TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，可作為預后不良預測指標。但本研究結(jié)果還需多中心大樣本研究進一步驗證，并深入研究miR-125b、miR-18b 影響結(jié)腸癌預后的機制。