徐亮 王杜娟 黃述斌 謝 倩 李松梅

1.安徽省池州市人民醫(yī)院病理科，安徽池州 247000；2.廣東省東莞市厚街醫(yī)院病理科，廣東東莞 523900

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率持續(xù)升高，全球范圍內(nèi)，每年新診斷病例達(dá)168 萬(wàn)例[1]。乳腺癌早期及時(shí)進(jìn)行手術(shù)治療，可有效降低患者的病死率[2]，但術(shù)后仍存在病死風(fēng)險(xiǎn)。近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)科技的發(fā)展，分子靶向治療逐漸被應(yīng)用于腫瘤治療，因此，尋找合適的分子靶向治療技術(shù)，對(duì)提高患者術(shù)后生存率具有十分重要的意義。S100 鈣結(jié)合蛋白A8（S100 calcium binding protein A8，S100A8）是低分子量鈣結(jié)合蛋白S100 的家族成員之一，具有免疫抑制及促進(jìn)炎癥因子分泌的作用[3]，S100A8 的差異表達(dá)與乳腺癌患者的遠(yuǎn)期生存率密切相關(guān)[4]。相關(guān)研究報(bào)道，miR-93參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展，其表達(dá)水平可能與癌癥患者預(yù)后有所關(guān)聯(lián)[5]。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是促進(jìn)腫瘤微血管生成的重要因子，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)過(guò)程[6]，在早期乳腺癌患者癌組織中即可檢出VEGF 高表達(dá)[7]。因此，本研究旨在探討VEGF、HsamiR-93、S100A8 在乳腺癌中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系，以期為提高乳腺癌患者術(shù)后生存率提供新的分子靶向治療思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年1 月至2018 年6 月安徽省池州市人民醫(yī)院治療并經(jīng)病理確診的77 例初發(fā)乳腺癌患者為研究對(duì)象，均為女性，發(fā)病年齡31～79 歲，平均（55.06±12.03）歲；腫瘤直徑1.2～3.3 cm，平均（2.24±0.48）cm；組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)15 例，Ⅱ級(jí)42 例，Ⅲ級(jí)20 例；TNM 分期：Ⅰ期19 例，Ⅱ期29 例，Ⅲ期19 例，Ⅳ期10 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合乳腺癌相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，經(jīng)病理學(xué)檢查確診；②患者家屬愿意配合電話(huà)隨訪(fǎng)研究，且能提供患者具體死亡時(shí)間。排除標(biāo)準(zhǔn)：入組前已接受過(guò)放化療或靶向治療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，倫理審批號(hào)為：CZ20190032。

1.2 觀(guān)察指標(biāo)

1.2.1 VEGF、Hsa-miR-93、S100A8 蛋白檢測(cè) 主要實(shí)驗(yàn)試劑：VEGF、S100A8 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：MAB-0243、MAB-0845）由邁新公司提供；MK1030 原位雜交檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：MK1030）和寡核苷酸探針稀釋液（貨號(hào)：AR0062）由武漢博士德公司提供；地高辛標(biāo)記的Hsa-miR-93 探針（貨號(hào)：ORB220703）由Biorbyt 公司提供；DAB 顯色試劑盒（貨號(hào)：GK348010）由基因科技（上海）股份有限公司提供。

所有患者手術(shù)治療后獲得病理標(biāo)本（癌組織以及距離癌組織3～5 cm 的癌旁正常組織）經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片厚4 μm。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)癌組織和癌旁正常組織中VEGF、S100A8 的表達(dá)：常規(guī)脫蠟、水化，所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)執(zhí)行，采用PBS 緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，已知抗體陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照。原位雜交方法檢測(cè)HsamiR-93 的表達(dá)：常規(guī)脫蠟，每個(gè)切片上加適量混勻的地高辛標(biāo)記的探針溶液，加蓋玻片，濕盒中42℃雜交16 h，放入適量HRP 標(biāo)記的抗地高辛抗體，37℃孵育30 min 后，加入適量DAB 顯色液進(jìn)行顯色，采用探針稀釋液替代探針作陰性對(duì)照，已知抗體陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照。切片均置于蘇木精中染色2 min，顯微鏡下放大200 倍進(jìn)行觀(guān)察。結(jié)果判定：均由病理科醫(yī)師參照Axiotis 病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[9]根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行判定：無(wú)染色或染色不明顯，陽(yáng)性細(xì)胞比例＜10%，記1 分；中等強(qiáng)度染色，陽(yáng)性細(xì)胞比例在10%～50%，記2 分；強(qiáng)染色，陽(yáng)性細(xì)胞比例＞50%，記3 分；總分=染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)×陽(yáng)性細(xì)胞比例分?jǐn)?shù)，≥3 分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.2.2 生存資料 自患者出院之日起，每1～3 個(gè)月通過(guò)電話(huà)或門(mén)診相結(jié)合的方式隨訪(fǎng)1 次，隨訪(fǎng)時(shí)間截至2021 年6 月，隨訪(fǎng)時(shí)間為6～36 個(gè)月，隨訪(fǎng)至終止時(shí)間或患者死亡，記錄患者生存情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線(xiàn)，兩組間差異比較采用log-rank 檢驗(yàn)。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織及癌旁正常組織中VEGF、Hsa-miR-93、S100A8 陽(yáng)性表達(dá)率比較

乳腺癌組織中的VEGF、Hsa-miR-93、S100A8 陽(yáng)性表達(dá)率分別為68.83%（53/77）、74.03%（57/77）、61.04%（47/77），高于癌旁正常組織中的15.58%（12/77）、14.29（11/77）、12.99（10/77）（χ2=44.749、55.722、38.131，P ＜0.05）。見(jiàn)圖1～3。

圖1 VEGF 在乳腺癌組織中的表達(dá)

2.2 臨床病理特征與癌組織中VEGF、Hsa-miR-93、S100A8 陽(yáng)性表達(dá)的關(guān)系

圖2 Hsa-miR-93 在乳腺癌組織中的表達(dá)

圖3 S100A8 在乳腺癌組織中的表達(dá)

癌組織中VEGF 陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P ＜0.05），與年齡、組織學(xué)分級(jí)、TNM 分期、腫瘤直徑無(wú)關(guān)（P ＞0.05）；癌組織中Hsa-miR-93 陽(yáng)性表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P ＜0.05），與年齡、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤直徑無(wú)關(guān)（P ＞0.05）；癌組織中S100A8 陽(yáng)性表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P ＜0.05），與年齡、腫瘤直徑無(wú)關(guān)（P ＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 臨床病理特征與癌組織中VEGF、Hsa-miR-93、S100A8 陽(yáng)性表達(dá)的關(guān)系

2.3 VEGF、Hsa-miR-93、S100A8 不同表達(dá)與患者生存率的關(guān)系

截至隨防時(shí)間，77 例乳腺癌患者存活37 例，死亡40 例。癌組織中VEGF、Hsa-miR-93、S100A8 陽(yáng)性表達(dá)患者的3 年總生存率為45.28%（24/53）、45.61%（26/57）、42.55%（20/47）；陰性表達(dá)患者的3 年總生存率為54.17%（13/24）、55.00%（11/20）、56.67%（17/30）。兩組VEGF、Hsa-miR-93、S100A8 生存曲線(xiàn)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.150、1.197、2.819，P=0.283、0.274、0.093）。VEGF、Hsa-miR-93、S100A8 陽(yáng)性表達(dá)患者中位生存期分別為22.00、20.00、17.00 個(gè)月；陰性表達(dá)患者中位生存期分別為27.25、28.60、28.53 個(gè)月。見(jiàn)圖4。

圖4 VEGF、Hsa-miR-93、S100A8 不同表達(dá)患者的生存曲線(xiàn)

3 討論

乳腺癌是乳腺上皮細(xì)胞在多種致癌因子的作用下，發(fā)生增殖失控的現(xiàn)象。乳腺癌常表現(xiàn)為乳房腫塊、乳頭溢液、腋窩淋巴結(jié)腫大等癥狀，其發(fā)病原因尚不清楚，但多數(shù)研究報(bào)道可能與遺傳因素、生育狀況、月經(jīng)初潮及絕經(jīng)年齡等多種因素有關(guān)[2,10-11]。隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，催生了許多新技術(shù)，應(yīng)用靶向技術(shù)向腫瘤區(qū)域精確遞送藥物的“靶向治療”和利用腫瘤特異的信號(hào)傳導(dǎo)或特異代謝途徑控制的“靶點(diǎn)治療”是腫瘤研究的熱點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，VEGF 在乳腺癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率為68.83%，高于癌旁正常組織，其中VEGF 的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。VEGF 是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、存活，引起血管通透性改變，控制血管新生的作用[12]；另有研究報(bào)道，VEGF 也是一種血管通透性誘導(dǎo)因子，可引起微血管滲透性增強(qiáng)，導(dǎo)致血管腫瘤，并加快腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[13]。劉巖巖等[14]的研究報(bào)道，VEGF 在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，且與病理類(lèi)型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果結(jié)合上述報(bào)道，進(jìn)一步說(shuō)明VEGF 高表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，其可能通過(guò)增加腫瘤干細(xì)胞的自我更新，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管密度的增加，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示，miR-93 在乳腺癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率為74.03%，高于癌旁正常組織，其中miR-93 的表達(dá)與病理類(lèi)型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。miRNA是一類(lèi)由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，在真核基因表達(dá)調(diào)控中有著廣泛的作用，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[15]。相關(guān)研究報(bào)道[16]，miR-93 在肝癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)。楊正勤等[17]研究報(bào)道，miR-93 在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)顯著上調(diào)，且與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果結(jié)合上述報(bào)道進(jìn)一步說(shuō)明，miR-93 可能是一種原癌基因，其可能通過(guò)調(diào)控靶基因影響細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，S100A8 在乳腺癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率為61.04%，高于癌旁正常組織，其中S100A8 的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。S100A8是嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞表達(dá)的促炎蛋白，在細(xì)胞因子的刺激下發(fā)揮重要的促炎效應(yīng)[18]；S100A8 不僅僅參與影響血液病的病情發(fā)生、發(fā)展，更是在多種實(shí)體性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，成為腫瘤預(yù)后相關(guān)研究的新熱點(diǎn)分子[19-20]。相關(guān)研究表明，S100A8在膀胱癌組織中呈高表達(dá)，且與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移的病理特征高度相關(guān)[21]；隨病理分期增高及分化程度降低，肺癌組織中S100A8 表達(dá)陽(yáng)性率增高[22]。本研究結(jié)果結(jié)合上述報(bào)道說(shuō)明，S100A8 可能會(huì)促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，可能的機(jī)制為S100A8 與機(jī)體內(nèi)酪蛋白激酶發(fā)生作用，活化細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶。相關(guān)研究報(bào)道，酪氨酸激酶具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的作用[23]。

本研究結(jié)果顯示，VEGF、Hsa-miR-93、S100A8陽(yáng)性表達(dá)乳腺癌患者生存率與陰性表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。但既往有研究表明，VEGF 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 由抑癌活性轉(zhuǎn)為促癌活性，進(jìn)而誘導(dǎo)miR-93 表達(dá)，刺激上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)癌癥復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，增加患者病死風(fēng)險(xiǎn)；S100A8 的分泌涉及多種細(xì)胞因子，包括多種白介素相關(guān)因子[24-25]。提示VEGF、miR-93、S100A8 高表達(dá)可能會(huì)影響患者預(yù)后，本研究與上述報(bào)道存在差異，可能是由于本研究病例數(shù)較少無(wú)法得出此結(jié)論，后期需進(jìn)一步采用大樣本臨床試驗(yàn)針對(duì)VEGF、miR-93、S100A8 對(duì)乳腺癌患者預(yù)后影響進(jìn)行深入研究。

綜上所述，VEGF、miR-93、S100A8 在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，且陽(yáng)性表達(dá)率均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。但VEGF、miR-93、S100A8 參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制尚不清楚，還需要進(jìn)一步采用動(dòng)物試驗(yàn)或體外細(xì)胞試驗(yàn)進(jìn)行深入研究，探索VEGF、miR-93、S100A8 作為乳腺癌治療靶點(diǎn)新方向的可能性。