張潔 吳 倩 王曉玲 唐 勇 吳宗濤

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽(yáng) 712046；2.陜西省安康市中醫(yī)醫(yī)院，陜西安康 725000

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）占卒中24%[1]，屬中醫(yī)“中風(fēng)”范疇，急性期治法以熄風(fēng)、化痰、活血為主，目前臨床中尚無(wú)證據(jù)表明活血化瘀藥會(huì)其增加出血風(fēng)險(xiǎn)[2]。出血性中風(fēng)1 號(hào)方有平肝熄風(fēng)、涼血化瘀功效，有研究表明，該方對(duì)ICH 患者有腦保護(hù)作用，但機(jī)制尚不明確[3-5]。本研究探討該方對(duì)ICH 模型大鼠腦組織的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 84 只雄性SD 大鼠，體重（220±20）g，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（川）2020-030，合格證號(hào)：0043162。本研究經(jīng)過(guò)陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 藥物 出血性中風(fēng)1 號(hào)方配方顆粒（水牛角15 g、鉤藤10 g、牛膝10 g、生大黃6 g、梔子10 g，廣東一方制藥有限公司，批號(hào)：9116533、9120933、9100363、90713 91、9110873）。腦血疏口服液（山東沃華醫(yī)藥科技股份有限公司，批號(hào)：20070059）。

1.1.3 主要試劑與儀器 膠原酶Ⅶ（sigma，批號(hào)：C824248）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6 試劑盒，核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65 抗體（武漢博士德，批號(hào)：EK0526、EK0412、A00284-1）；磷酸化NF-κB（phos phorylated NF-κB，p-NF-κB）p65 抗體（Affinity，批號(hào)：AF2006）。腦立體定位儀（成都泰盟科技有限公司，DW-2000），微量進(jìn)樣器（上海高鴿工貿(mào)有限公司，批號(hào)：HY20082702）。

1.2 研究方法

1.2.1 分組及給藥 84 只大鼠中隨機(jī)選取24 只，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為空白組和假手術(shù)組，每組12 只。剩余60 只采用膠原酶Ⅶ注射誘導(dǎo)ICH 模型，造模成功后采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為模型組、腦血疏組（2.08 ml/kg）及出血性中風(fēng)1 號(hào)方低、中、高劑量組（3.2、6.4、12.8 g/kg）?？瞻捉M、假手術(shù)組、模型組灌胃等量生理鹽水，其余組灌胃對(duì)應(yīng)劑量藥物，1 次/d，連續(xù)7 d。

1.2.2 模型制備 參照文獻(xiàn)[6-7]復(fù)制ICH 模型：5%水合氯醛（6 ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，以前囟向后0.2 mm，向右3.0 mm，垂直下移5.5 mm 為注射點(diǎn)，微量進(jìn)樣器取1.5 μl 膠原酶Ⅶ注入右尾狀核區(qū)。以Longa 評(píng)分1～3 分且取材觀察到腦血腫為造模成功標(biāo)準(zhǔn)[8]。Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[8]：無(wú)肢體活動(dòng)不利記為0 分，左側(cè)肢體不能完全伸展記為1 分，向左側(cè)轉(zhuǎn)圈記為2 分，向左側(cè)傾倒記為3 分，不能自發(fā)行走記為4 分?？瞻捉M不處理，假手術(shù)組注射等量生理鹽水。

1.2.3 標(biāo)本采集 末次給藥后麻醉，每組取3 只心臟灌注后取腦用于蘇木精-伊紅染色；3 只取右腦檢測(cè)腦含水量；6 只取腦血腫周圍組織，-80℃冰箱保存。

1.2.4 蘇木精-伊紅染色觀察病理學(xué)變化 依次脫水、包埋、切片，蘇木精-伊紅染色，中性樹脂封片，鏡下觀察，采集圖像。

1.2.5 干濕重法測(cè)定腦含水量變化 取右腦，濾紙吸干水分后稱重記為濕重，然后置于80℃烤箱中干燥24 h稱重記為干重，腦含水量=（濕重-干重）/濕重×100%[9]。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)TNF-α、IL-6 取腦組織，按酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒說(shuō)明操作，檢測(cè)光密度（optical density，OD）值（450 nm 處），計(jì)算TNF-α、IL-6 濃度。

1.2.7 Western blot 檢測(cè)NF-κB 蛋白表達(dá) 每組取4 只的腦組織提取蛋白，SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，封閉，加入一抗p-NF-κB p65（1∶800）、NF-κB p65（1∶1500）、β-actin（1∶10 000，內(nèi)參），4℃孵育過(guò)夜，加入二抗（1∶10 000）室溫孵育，顯色，Image J 處理圖像，檢測(cè)灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 七組腦組織病理學(xué)結(jié)果

空白組、假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)完整，模型組有大量紅細(xì)胞及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，排列紊亂，水腫嚴(yán)重，出血性中風(fēng)1 號(hào)方低、中、高劑量組均有少量紅細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

圖1 七組腦組織病理學(xué)結(jié)果（蘇木精-伊紅染色，400×）

2.2 七組腦含水量比較

空白組、假手術(shù)組腦含水量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。模型組腦含水量高于空白組，出血性中風(fēng)1 號(hào)方中、高劑量組腦含水量低于模型組和出血性中風(fēng)1 號(hào)方低劑量組（P ＜0.05）。出血性中風(fēng)1 號(hào)方低劑量組、模型組腦含水量比較，出血性中風(fēng)1 號(hào)方中、高劑量組腦含水量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 七組腦含水量比較（%，）

表1 七組腦含水量比較（%，）

注 與空白組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與出血性中風(fēng)1 號(hào)方低劑量組比較，cP ＜0.05

2.3 七組腦組織TNF-α、IL-6 水平比較

空白組、假手術(shù)組TNF-α、IL-6 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。模型組TNF-α、IL-6 高于空白組，出血性中風(fēng)1 號(hào)方中、高劑量組TNF-α、IL-6 低于模型組和出血性中風(fēng)1 號(hào)方低劑量組（P ＜0.05）。出血性中風(fēng)1 號(hào)方低劑量組、模型組TNF-α、IL-6 比較，出血性中風(fēng)1 號(hào)方中、高劑量組TNF-α、IL-6 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 七組腦組織TNF-α、IL-6 水平比較（pg/ml，）

表2 七組腦組織TNF-α、IL-6 水平比較（pg/ml，）

注 與空白組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與出血性中風(fēng)1 號(hào)方低劑量組比較，cP ＜0.05。TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-6：白細(xì)胞介素-6

2.4 七組腦組織NF-κB p65 及p-NF-κB p65 水平比較

各組NF-κB p65 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）?？瞻捉M、假手術(shù)組p-NF-κB p65 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。模型組p-NF-κB p65 高于空白組，出血性中風(fēng)1 號(hào)方中、高劑量組p-NF-κB p65 低于模型組和出血性中風(fēng)1 號(hào)方低劑量組（P ＜0.05）。出血性中風(fēng)1 號(hào)方低劑量組、模型組p-NF-κB p65 比較，出血性中風(fēng)1 號(hào)方中、高劑量組p-NF-κB p65 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)圖2、表3。

圖2 七組腦組織NF-κB p65 及p-NF-κB p65 蛋白條帶圖

表3 七組腦組織NF-κB p65 及p-NF-κB p65 水平比較（）

表3 七組腦組織NF-κB p65 及p-NF-κB p65 水平比較（）

注 與空白組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與出血性中風(fēng)1 號(hào)方低劑量組比較，cP ＜0.05。NF-κB：核因子-κB；p-NF-κB：磷酸化核因子-κB

3 討論

ICH 是神經(jīng)科急危重癥，治療以清除血腫，脫水降顱壓及處理并發(fā)癥為主[10]。ICH 急性期以瘀血阻竅、風(fēng)痰火熾證最常見(jiàn)，約占12.45%[11]。對(duì)ICH 患者予以活血化瘀治療能促進(jìn)血腫吸收，改善神經(jīng)功能缺損，降低致殘率[12-13]。研究表明，瘀熱病機(jī)主要由炎癥引發(fā)[14]。出血性中風(fēng)1 號(hào)方中水牛角涼血止血為君藥；鉤藤熄風(fēng)，大黃涼血逐瘀，合為臣藥；佐以牛膝引火下行，梔子清熱，共奏熄風(fēng)清熱化瘀功效。有研究表明，該方治療ICH 的靶點(diǎn)集中在抑制炎癥和細(xì)胞凋亡[15]。

腦水腫是ICH 常見(jiàn)繼發(fā)病理改變，嚴(yán)重影響ICH進(jìn)展及預(yù)后[16-17]。本研究顯示，出血性中風(fēng)1 號(hào)方中、高劑量組腦含水量低于模型組，提示該方能減輕腦水腫，與既往研究一致[18-19]。研究表明，NF-κB p65 表達(dá)及TNF-α、IL-6 水平與ICH 病情及預(yù)后呈正相關(guān)[20-23]。NF-κB 是由p65、p52、p50、RelB、c-Rel 組成的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族，以同源或異源二聚體形式存在，參與調(diào)控炎癥、凋亡等過(guò)程[24-25]。正常情況下，NF-κB 與其抑制蛋白結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)中，處于非活化狀態(tài)。ICH 血腫作為致炎物質(zhì)激活小膠質(zhì)細(xì)胞，引發(fā)NF-κB 抑制蛋白激酶被激活導(dǎo)致NF-κB 被釋放，后者與DNA 上的κB 位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)TNF-α、IL-6 等炎癥因子表達(dá)，加重繼發(fā)性腦損傷[24,26-27]。本研究結(jié)果顯示，出血性中風(fēng)1 號(hào)方中、高劑量組抑制p-NF-κB p65 表達(dá)，降低TNF-α、IL-6 水平，提示該方可下調(diào)TNF-α、IL-6 等炎癥因子的釋放，進(jìn)而抑制ICH 的炎癥損傷。

綜上所述，中、高劑量的出血性中風(fēng)1 號(hào)方對(duì)ICH 大鼠有腦保護(hù)作用，可能與抑制p-NF-κB p65、TNF-α、IL-6 表達(dá)相關(guān)。