王 磊，郭紅玉，趙樹峰，石尚威，趙國俊

(1.山西焦煤山煤國際大平煤業(yè)有限公司，山西 長治 046200； 2.河南理工大學(xué) 能源科學(xué)與工程學(xué)院，河南 焦作 454000； 3.山西小回溝煤業(yè)有限公司，山西 太原 030400)

我國褐煤資源儲量豐富，尤其是內(nèi)蒙古自治區(qū)，占全國褐煤總儲量的77%，其次是云南省，占全國褐煤資源儲量的12.6%[1]。褐煤水分含量高、易風(fēng)化，難以洗選和儲存，目前以粉煤鍋爐燃燒為主，也有傳統(tǒng)的煉焦、氣化和液化等處理方式[2-6]。但這些方法存在利用率低、成本較高、環(huán)境污染等問題，亟需一種清潔高效利用褐煤的方法。近年來，由于煤層氣生物工程的蓬勃發(fā)展[7]，人們對微生物增產(chǎn)煤層氣概念有了更加深入的了解，并且國內(nèi)外開展了現(xiàn)場生物增產(chǎn)煤層氣的許多試驗，其中美國的Ciris Energy公司將營養(yǎng)液加入至循環(huán)水中以刺激煤層中現(xiàn)存細(xì)菌的生長，進(jìn)而對煤炭進(jìn)行降解，產(chǎn)生甲烷。2010年現(xiàn)場測試，注入營養(yǎng)液4個月后，煤層氣井甲烷產(chǎn)量迅速上升，相比注入前，產(chǎn)量提高了2～5倍[8]。我國華北油田公司，在山西晉城鄭1區(qū)塊煤層氣井鄭1-312開展試驗，煤層埋深780m，煤層溫度32℃。注入配液用煤層氣井排采水，2015年1月26日開始現(xiàn)場施工，總注入量230m3，營養(yǎng)劑關(guān)井反應(yīng)60d后煤層產(chǎn)出液菌群濃度與措施前相比較增加了2～5個數(shù)量級，煤層營養(yǎng)物質(zhì)被消耗，措施前平均日產(chǎn)氣16.81m3，措施后平均日產(chǎn)氣75.13m3，微生物措施起到了穩(wěn)產(chǎn)增氣的目的[9]。因此，微生物降解煤產(chǎn)生物甲烷，成了國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點，由于其反應(yīng)條件溫和、綠色環(huán)保、能耗低而備受關(guān)注[10-12]。

微生物降解煤產(chǎn)甲烷包括水解、產(chǎn)酸、產(chǎn)氫/產(chǎn)乙酸、產(chǎn)甲烷階段和多菌群的協(xié)同作用，而水解階段是整個過程中的限速階段[13]，預(yù)處理往往是解決限速階段的重要方法之一[14]。目前對煤進(jìn)行預(yù)處理的方法分為物理、化學(xué)和生物三大類。物理預(yù)處理主要采用物理方法(超聲波、溶脹等)，旨在促進(jìn)煤的溶解與降解過程[15，16]；化學(xué)預(yù)處理通過雙氧水、硝酸和高錳酸鉀等溶液打斷煤大分子間的化學(xué)鍵，將煤的復(fù)雜大分子結(jié)構(gòu)解聚成小分子，從而促進(jìn)煤的轉(zhuǎn)化[17，18]；生物預(yù)處理多采用細(xì)菌、放線菌、白腐菌、酵母菌等微生物對煤進(jìn)行降解處理，使煤從大分子結(jié)構(gòu)分解成小分子和酸類物質(zhì)，從而更好地被產(chǎn)甲烷菌利用，實現(xiàn)煤的高效產(chǎn)氣[19-22]。

由于生物預(yù)處理具有成本低、條件溫和、環(huán)境污染小等特點，因此本文研究不同組合微生物處理褐煤對煤制生物甲烷的影響，對煤進(jìn)行不用組合菌種的預(yù)處理，在不同組合菌種處理下研究煤的生物產(chǎn)氣特征，并通過動力學(xué)方程模擬不同組合菌預(yù)處理煤的最大甲烷產(chǎn)率和累計產(chǎn)氣潛力，以此探索提高褐煤生物產(chǎn)氣的新方法，為后續(xù)現(xiàn)場試驗提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗煤樣

本實驗煤樣采自內(nèi)蒙古西烏珠穆沁旗白音華礦的新鮮褐煤，采集之后迅速進(jìn)行密封處理，然后使用蒸餾水進(jìn)行沖洗，使用高壓滅菌鍋在121℃下處理20min進(jìn)行滅菌，再將處理后的煤樣放入60℃恒溫干燥箱中，等烘干至重量不變后將煤樣密封保存。實驗前需將煤樣破碎篩分至60～80目，采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 30732—2014和GB/T 31391—2015對煤樣進(jìn)行了工業(yè)分析和元素分析，分析結(jié)果見表1。

表1 內(nèi)蒙古白音華褐煤樣品的基本性質(zhì) %

1.2 產(chǎn)甲烷菌的富集培養(yǎng)

1)礦井水的采集。礦井水采自焦作古漢山礦新鮮的煤層水，將礦井水迅速放入容器中并使用N2進(jìn)行密封，帶回實驗室后放入冰箱內(nèi)保存，設(shè)置溫度為4℃，以備后續(xù)生物產(chǎn)氣實驗使用。

2)產(chǎn)甲烷菌群的富集培養(yǎng)。產(chǎn)甲烷菌群的培養(yǎng)基見表2。將礦井水和培養(yǎng)基的混合液pH值調(diào)為7.0，然后裝入無菌容器中，向其中充入氮氣5min，完成后迅速密封并放入恒溫培養(yǎng)箱，設(shè)置溫度為35℃，然后在厭氧環(huán)境進(jìn)行為期4d的發(fā)酵，得到產(chǎn)甲烷菌群富集液。

1.3 預(yù)處理菌種的篩選與培養(yǎng)

1.3.1 菌種的篩選

目前可降解煤的微生物有許多種，包括細(xì)菌(如假單孢菌、巨大芽孢桿菌)、放線菌(如鏈霉菌)、酵母菌、真菌(如云芝、粉狀側(cè)孢菌、假絲酵母)等，總的來說，真菌類占比較大[23-25]。為驗證不同菌種的處理效果，同時滿足經(jīng)濟(jì)性、適用性、以及無污染性等特點，實驗從細(xì)菌中選取假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)，從放線菌中選取綠孢鏈霉菌(Streptomyces viridosporus)，從真菌中選取白腐菌(Phanerochaete ch-rysosporium)作為預(yù)處理菌種。菌種源是北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司和中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種基本信息見表3。

表2 產(chǎn)甲烷菌群培養(yǎng)基

表3 菌種基本信息

各菌種培養(yǎng)基的配制：

1)CM0841培養(yǎng)基：牛肉膏10g，酵母膏5.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖5.0g，瓊脂15.0g，NaCl 5.0g，蒸餾水1L，pH=7.2。

2)0038 ISP-2培養(yǎng)基：麥芽提取物10g，葡萄糖4g，瓊脂15g，酵母提取物4g，蒸餾水1L，pH=7.3。

3)綜合馬鈴薯培養(yǎng)基：葡萄糖20g，MgSO4·7H2O 1.5g，硫胺素0.008g，KH2PO43g，瓊脂15g，20%馬鈴薯汁1L，pH=6。

1.3.2 菌種的活化與培養(yǎng)

購買菌種均為凍干管模式，存放在安瓿內(nèi)并處于密封狀態(tài)，該狀態(tài)不能直接進(jìn)行實驗，需要先對其進(jìn)行活化和富集，過程在固體斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行，在菌種活化富集完成后可進(jìn)行煤樣預(yù)處理實驗。

培養(yǎng)操作：首先使用無菌吸管吸取約0.3～0.5mL的菌種對應(yīng)液體培養(yǎng)基(不添加瓊脂)，然后滴入安瓿內(nèi)，輕輕振蕩，直至凍干菌體溶解呈現(xiàn)出懸浮狀；之后吸取安瓿瓶內(nèi)全部菌懸液，移入對應(yīng)培養(yǎng)試管中，首次活化成功后不能直接用于實驗，在培養(yǎng)箱中使其再進(jìn)行1～2次傳代以恢復(fù)活力，之后可對煤樣進(jìn)行預(yù)處理。

1.4 菌種生長階段測定

論文選擇比濁法進(jìn)行各個菌種生長階段的數(shù)據(jù)測量，該方法利用微生物懸液濃度與其渾濁度成正比的特性，使用分光光度計進(jìn)行各細(xì)菌懸液的光密度的測定，從而得到各菌液的濃度并繪制出生長曲線，如圖1所示。

圖1 菌種生長曲線

由圖1可看出，假單胞菌、綠孢鏈霉菌和白腐菌三種菌的遲緩期為1～2d；對數(shù)期在2～3d，此時是所有菌種生長速率最快的時期；在第4～5d，菌種生長曲線有所下降；在第6d進(jìn)入相對穩(wěn)定期；在第15d后，菌種死亡率增加，菌種生長進(jìn)入衰退期。為了提高菌種作用效果，選擇培養(yǎng)第2d(對數(shù)期)的菌種進(jìn)行預(yù)處理實驗。

1.5 煤樣生物預(yù)處理

實驗前將使用電磁礦石粉碎機(jī)將煤樣粉碎，并使用標(biāo)準(zhǔn)篩選取60～80目之間煤樣，置于干燥樣品袋內(nèi)保存。

在超凈工作臺進(jìn)行煤樣的預(yù)處理實驗，實驗選用篩分至60～80目的煤樣，實驗前先對煤樣進(jìn)行滅菌處理，然后再進(jìn)行干燥，之后取10g煤樣放入無菌反應(yīng)瓶中，向反應(yīng)瓶中加入經(jīng)過富集培養(yǎng)的菌液，使菌液淹沒煤樣，然后用棉塞塞住瓶口，棉塞中加入醫(yī)用棉，以防止預(yù)處理實驗中菌種被污染，并且使用棉塞能保證實驗過程中的有氧環(huán)境。不同組合菌種預(yù)處理煤樣見表4。

表4 生物預(yù)處理實驗分組

1.6 氣體組分含量測定

采用安捷倫7890 GC型氣相色譜儀進(jìn)行氣體組分測定。采用進(jìn)樣針手動進(jìn)樣，每次進(jìn)行體積為1mL，5A分子篩不銹鋼填充色譜柱，檢測溫度為100℃，載氣為氦氣，流速為30mL/min。

1.7 氣體體積測定

產(chǎn)氣量采用排水集氣法進(jìn)行測量，每3 d測量一次，氣體體積為集水瓶中排出水的體積。

2 產(chǎn)氣特征分析

2.1 生物預(yù)處理對煤制生物甲烷的影響

為了研究生物預(yù)處理對煤制生物甲烷的影響，將預(yù)處理煤樣與原煤樣進(jìn)行厭氧發(fā)酵生物產(chǎn)氣實驗，每3d測定各組煤樣產(chǎn)氣量直到無氣體生成，然后用氣相色譜儀對實驗所產(chǎn)氣體組分進(jìn)行測定。

2.1.1 不同組合菌種預(yù)處理對產(chǎn)氣量的影響

菌種預(yù)處理后煤樣累計產(chǎn)氣量如圖2所示。對照組Y-H總產(chǎn)氣量為151.50mL，其中甲烷產(chǎn)量為52.33mL，甲烷濃度為34.54%；生物預(yù)處理組J-L-H、J-B-H、L-B-H、L-J-H、B-J-H和B-L-H的總產(chǎn)氣量分別為180.50mL、187.50mL、285.50mL、196.50mL、175.50mL、278.50mL，相比于對照組Y-H分別增長了19.14%、23.76%、88.45%、29.70%、16.23%和83.83%，各生物預(yù)處理組甲烷產(chǎn)量為68.50mL、96.30mL、106.49mL、89.15mL、82.71mL和118.98mL，相比于對照組分別增加了30.90%、84.02%、103.50%、70.36%、58.05%和127.36%。綜上，煤樣經(jīng)過不同組合菌種預(yù)處理后其總產(chǎn)氣量、甲烷生成量以及甲烷濃度比原煤樣均有不同程度的提高，推測菌種在預(yù)處理過程中改變了煤的結(jié)構(gòu)，使其更易向甲烷方向轉(zhuǎn)化。

圖2 菌種預(yù)處理后煤樣累計產(chǎn)氣量

2.1.2 不同組合菌種對階段產(chǎn)氣量的影響

煤樣經(jīng)菌種預(yù)處理后的階段產(chǎn)氣量如圖3所示。由圖3可知，煤制生物氣實驗中，0～6d為產(chǎn)氣初期階段，此時各實驗組的產(chǎn)氣速率普遍較低；6～12d為快速產(chǎn)氣階段，此階段是產(chǎn)氣量的主要來源，到第12d產(chǎn)氣基本停止，累計產(chǎn)氣量基本穩(wěn)定，只有L-B-H組(綠孢鏈霉菌+白腐菌+白音華原煤)和B-L-H組(白腐菌+綠孢鏈霉菌+白音華原煤)還繼續(xù)產(chǎn)氣，但產(chǎn)氣速率大幅降低；12～21d，L-B-H組和B-L-H組產(chǎn)氣逐漸停止，到第21d，所有實驗組停止產(chǎn)氣。

圖3 煤樣經(jīng)菌種預(yù)處理后的階段產(chǎn)氣量

2.1.3 不同組合菌種預(yù)處理和產(chǎn)氣的關(guān)系

煤樣經(jīng)菌種預(yù)處理后產(chǎn)氣甲烷濃度如圖4所示，J-L-H組與J-B-H組相比，兩組產(chǎn)氣總量相近，但后者的甲烷生成量和產(chǎn)甲烷濃度更高，說明假單胞菌+白腐菌的預(yù)處理順序比假單胞菌+綠孢鏈霉菌更好；L-B-H組與L-J-H組相比，前者的總產(chǎn)氣量和甲烷生成量高于后者，但產(chǎn)甲烷濃度低于后者；B-J-H組和B-L-H組相比，后者的總產(chǎn)氣量和甲烷生成量高于前者，但產(chǎn)甲烷濃度低于前者。

圖4 煤樣經(jīng)菌種預(yù)處理后產(chǎn)氣甲烷濃度

產(chǎn)氣量較高的是L-B-H組和B-L-H組，甲烷生成量較高的也是L-B-H組和B-L-H組，但B-L-H組的甲烷濃度和甲烷生成量略高于L-B-H組；經(jīng)過對比J-L-H組和L-J-H組，發(fā)現(xiàn)L-J-H組的產(chǎn)氣量、甲烷生成量和產(chǎn)甲烷濃度都高于J-L-H組，表明綠孢鏈霉菌+假單胞菌的預(yù)處理順序產(chǎn)氣效果較好；經(jīng)過對比J-B-H組和B-J-H組，發(fā)現(xiàn)J-B-H組的產(chǎn)氣量、甲烷生成量和產(chǎn)甲烷濃度都高于B-J-H組，表明假單胞菌+白腐菌的預(yù)處理順序產(chǎn)氣效果較好。推測綠孢鏈霉菌和白腐菌對煤樣預(yù)處理產(chǎn)氣效果較好，并且加入順序?qū)Ξa(chǎn)氣總量影響不大，但先加入白腐菌比先加入綠孢鏈霉菌甲烷濃度高，J-B-H組的甲烷濃度最高，可達(dá)到51.36%，是原煤樣所產(chǎn)甲烷濃度的1.49倍。

2.2 Gompertz模型產(chǎn)氣擬合

Gompertz模型建立在特定生長率和種群密度之間的指數(shù)關(guān)系上，該模型被修改為用細(xì)菌生長期期間的指數(shù)生長率和滯后期 持續(xù)時間來描述細(xì)胞密度的函數(shù)[26]。

實驗采用改進(jìn)Gompertz方程進(jìn)行甲烷產(chǎn)生的模擬，對其產(chǎn)生的動力學(xué)作出評估。

y=ae-e[-k(x-xc)]

(1)

將實驗數(shù)據(jù)和擬合的R2值作為Gompertz方程的參數(shù)來源，見表5，擬合結(jié)果如圖5所示。

表5 Gompertz方程的參數(shù)

圖5 微生物預(yù)處理煤樣模擬累計產(chǎn)氣量

由表5和圖5可知，Gompertz方程的擬合度較高。相比于原煤樣Y-H，菌種預(yù)處理煤樣的最大產(chǎn)氣甲烷率都有不同程度的增加，J-L-H組增長29.35%，J-B-H組增長103.07%，L-B-H組增長50.77%，L-J-H組增長81.05%，B-J-H組增長64.80%，B-L-H組增長98.10%；菌種預(yù)處理煤樣的累計產(chǎn)氣潛力相比于原煤樣也有一定的增加，J-L-H組增長28.88%，J-B-H組增長86.85%，L-B-H組增長108.21%，L-J-H組增長73.19%，B-J-H組增長61.67%，B-L-H組增長132.40%。由此可知，菌種預(yù)處理對煤制生物氣的產(chǎn)生具有明顯的促進(jìn)作用，可推斷煤樣經(jīng)菌種預(yù)處理后，在生物產(chǎn)氣過程中將具有更大的最大甲烷產(chǎn)率和累計產(chǎn)氣潛力。

3 結(jié) 論

1)不同菌種兩兩組合按照不同順序進(jìn)行預(yù)處理后，褐煤的產(chǎn)氣效果提高且各不相同，改進(jìn)的Gompertz方程擬合發(fā)現(xiàn)，不同菌種預(yù)處理后的褐煤將具有更大產(chǎn)氣潛力。

2)不同類型的微生物對煤的降解機(jī)理不同，為掌握更多微生物降解轉(zhuǎn)化煤炭的機(jī)理和規(guī)律，需要對降解產(chǎn)物的組成、理化性質(zhì)等特性進(jìn)行更全面的研究。