賈仲昕，趙佳男，季 芳，王 雪，李 剛，王承民，秦建華

（1.河北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，河北 保定 071000；2.廣東省科學院動物研究所/廣東省動物保護與資源利用重點實驗室/廣東省野生動物保護與利用公共實驗室，廣東 廣州 510260）

【研究意義】2020 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部全面禁止除中藥外一切促生長類藥物飼料添加劑的使用，標志著我國畜牧生產(chǎn)和養(yǎng)殖業(yè)“無抗時代”的到來。而蛋白酶一方面可以提高動物對蛋白質(zhì)的消化并促進對養(yǎng)分的吸收，另一方面還可以有效減少進入后腸中的未消化蛋白數(shù)量，減少腸道菌群失衡的可能，從而保障動物腸道健康，因此蛋白酶成為抗生素促生長劑替代品的選擇之一［1-2］。目前市場上的飼用蛋白酶主要由芽孢桿菌產(chǎn)生，因此探究影響芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力的重要基因顯得尤為重要?！厩叭搜芯窟M展】芽孢桿菌產(chǎn)生的細胞外蛋白酶被認為參與細菌對營養(yǎng)物質(zhì)的獲取過程。研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）可以產(chǎn)生至少8 種獨特的胞外或細胞壁相關(guān)蛋白酶［3］，包括枯草桿菌蛋白酶AprE、中性金屬蛋白酶NprE、絲氨酸蛋白酶Epr 和Vpr、桿狀肽酶F（Bpr）、中性蛋白酶B（NprB）、細胞壁相關(guān)蛋白酶WprA 和金屬蛋白酶Mpr。Yang 等［4］研究表明，蛋白酶基因缺失的唯一表型效應是蛋白酶活性的喪失。目前，芽孢桿菌蛋白酶基因的相關(guān)報道多集中于研究蛋白酶基因的調(diào)控機制以及高產(chǎn)蛋白酶突變株的誘導。Liu 等［5］發(fā)現(xiàn)degU和spo0A以及kinA的上調(diào)部分導致B.pumilus突變株SCU11 堿性蛋白酶的高產(chǎn)量。Zhou 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）中反應調(diào)節(jié)因子Spo0A 可能直接參與aprE的轉(zhuǎn)錄與激活。Zolfaghari 等［7］通過點突變等系統(tǒng)生物學方法，使aprE基因的表達水平和枯草桿菌蛋白酶E（Subtilisin E）的穩(wěn)定性得到提高?！颈狙芯壳腥朦c】隨著測序技術(shù)的發(fā)展，細菌全基因組信息可以更加容易獲得。通過比較不同菌種的基因組信息并結(jié)合細菌的相關(guān)表型，可以深入分析造成細菌表型差異的重要基因［8］。此外，芽孢桿菌全基因組注釋信息的完善也為利用比較基因組學分析影響芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力的重要基因提供了研究基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究對15 株芽孢桿菌進行全基因組測序，通過檢測15株芽孢桿菌的產(chǎn)蛋白酶能力，利用比較基因組學，挖掘影響芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力的重要基因，分析芽孢桿菌基因組中胞外蛋白酶基因與產(chǎn)蛋白酶能力的關(guān)聯(lián)性，為產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試15 株菌株來源于廣東省科學院動物研究所，具體如下：

枯草芽孢桿菌（B.subtiliis）N1282-4at、N1108-5at、N1303-2Ay，貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）C1，蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）N435-1，高地芽孢桿菌（B.altitudinis）N435-3，巨大芽孢桿菌（B.megaterium）N447-3、B1，假真菌樣芽孢桿菌（B.pseudomycoides）N451-2，海洋芽孢桿菌（B.oceanisediminis）N497-ZHONG，阿耶波多氏芽孢桿菌（B.aryabhattai）B2，副短短芽孢桿菌（Brevibacillus parabrevis）B3，芽孢桿菌（Bacillussp.）N470-1、N447-1、A1。

培養(yǎng)基配方參照文獻［9-10］并稍作優(yōu)化。蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方（g/L）：酪蛋白10.00、KH2PO40.360、NaH2PO4·2H2O 0.360、MgSO4·7H2O 0.500、FeSO4·7H2O 0.002、CaCl2·2H2O 0.480、NaCl 5.00。篩選培養(yǎng)基配方（g/L）：酪蛋白10.0、牛肉膏粉3.0、Na2HPO42.0、NaCl 5.0、瓊脂15.0、溴麝香草酚藍0.05。MHB培養(yǎng)基配方（g/L）：酪蛋白水解物17.5、牛肉浸粉5.0、淀粉1.5。NA 培養(yǎng)基配方（g/L）：蛋白胨10、牛肉膏粉3.0、NaCl 5.0、瓊脂17.0。

1.2 芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力檢測

1.2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株初篩 取出保藏的細菌凍存液接種于NA 培養(yǎng)基上，35 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種至MHB 培養(yǎng)基中，32 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h。將菌液梯度稀釋，吸取100 μL 涂布于酪蛋白瓊脂上，35 ℃培養(yǎng)48 h。用游標卡尺測量水解圈直徑（H）和菌落直徑（C）并計算H與C 的比值H/C。

1.2.2 蛋白酶活性測定 挑取初篩時酪蛋白瓊脂上的單菌落，接種至MHB 培養(yǎng)基中，32 ℃、160 r/ min 振蕩培養(yǎng)24 h 后，將菌液按2%（V/V）接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，32 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，調(diào)整菌液濃度OD600為0.500，9 000 r/min離心15 min，上清液即為粗酶液。蛋白酶活性測定參考GB/T 23527-2009福林酚法并做適當修改。測定前先將粗酶液與酪蛋白溶液于40 ℃水浴預熱5 min。

（1）試驗組：取1 mL 粗酶液加 入1 mL 10 g/L 酪蛋白溶液，40 ℃水浴10 min。之后立即加入3 mL 0.4 mol/L 三氯乙酸溶液終止反應。靜置10 min 后12 000 r/min 離心10 min。吸取上清液1 mL，加入5.0 mL 0.4 mol/L 碳酸鈉溶液和1 mL福林試劑使用溶液，40 ℃水浴顯色20 min，用紫外分光光度計在680 nm 處測定樣品的OD680。

（2）對照組：先加三氯乙酸使蛋白酶失活再加酪蛋白，其他操作同上。

計算酶活性（X）：

式中，X 為樣品酶活性（U/mL），A 為由樣品測得的凈OD 值，查標準曲線所得相對應的酪氨酸含量，n 為酶液的稀釋倍數(shù)，10 代表反應10 min，5 代表5 mL 反應液。

酶活性定義：在40 ℃下，每分鐘內(nèi)酪蛋白被水解產(chǎn)生1 μg 酪氨酸為1 個蛋白酶活性單位（U/mL）。

1.3 芽孢桿菌全基因組測序

將15 株菌株送至北京百邁客生物科技有限公司，基于Nanopore 測序技術(shù)平臺進行全基因組測序。試驗流程［11-12］按照ONT 公司提供的標準執(zhí)行，包括樣品質(zhì)量檢測、文庫構(gòu)建、文庫質(zhì)量檢測和文庫測序等流程。利用預測得到的基因序列與COG、KEGG、Swiss-Prot、TrEMBL、Nr 等功能數(shù)據(jù)庫進行BLAST 比對，得到基因功能注釋結(jié)果。

1.4 芽孢桿菌蛋白酶基因分析

查找芽孢桿菌中主要報道的8 種特征化細胞外或細胞壁相關(guān)蛋白酶［13］（AprE、NprE、Bpr、Epr、Vp、NprB、WprA、Mpr），以及從細菌全基因組數(shù)據(jù)注釋結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的絲氨酸蛋白酶（Serine protease，AprX［14-15］）的相關(guān)基因數(shù)據(jù)，包括菌株基本信息，蛋白酶基因的種類、數(shù)量和轉(zhuǎn)錄方向，蛋白酶基因間的相對距離等。利用IBS 線上作圖工具（http://ibs.biocuckoo.org）進行 繪圖。從全基因組數(shù)據(jù)結(jié)果中獲取菌株的16S rDNA 序列，結(jié)合NCBI 數(shù)據(jù)庫中已有的數(shù)據(jù)，利用MEGA X 軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 菌株蛋白酶基因的 mRNA 水平檢測

按照菌株產(chǎn)蛋白酶的相關(guān)表型，選取菌株B.altitudinisN435-3、B.oceanisediminisN497-ZHONG、B.velezensisC1、B.subtiliisN1282-4at進行蛋白酶基因的mRNA 水平檢測。根據(jù)細菌相應蛋白酶基因序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司設計與合成菌株引物（表1）。提取上述菌株在不同培養(yǎng)基（NB 培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基）條件下的總RNA，以總RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板進行qPCR，16S rDNA為內(nèi)參基因。

表1 菌株引物Table 1 Sequences of primers for strains

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bacillus sp.A1 和B.velezensis C1 產(chǎn)蛋白酶能力較強

在選取的15 株菌株中，有6 株菌株（Bacillussp.A1、B.velezensisC1、B.altitudinisN435-3、B.subtiliisN1282-4at、B.subtiliisN1108-5at、B.subtiliisN1303-2Ay）在接種培養(yǎng) 48 h，菌株透明圈直徑與菌落直徑的比值（H/C）顯著高于其他9 株菌株。Bacillussp.A1 和B.velezensisC1的H/C 值最高，其次為B.subtiliisN1282-4at、B.subtiliisN1108-5at、B.subtiliisN1303-2Ay 和B.altitudinisN435-3（圖1）。由于H/C 值在一定程度上反映了細菌產(chǎn)蛋白酶能力［16］，因此上述6株菌株的產(chǎn)蛋白酶能力相對較強。

圖1 產(chǎn)蛋白酶菌株初篩的H/C 值Fig.1 H/C value of primary screening of protease production strains

由圖2 可知，15 株菌株中蛋白酶活性最高的2株菌株分別為Bacillussp.A1（31.40±0.40 U/mL）和B.velezensisC1（29.75±0.43 U/mL ），蛋白酶活性均達到 30 U/mL，顯著高于其他13 株菌株；其次為B.subtiliisN1282-4at、B.subtiliisN1108-5at、B.subtiliisN1303-2Ay 等3 株菌株，蛋白酶活性在7.40～8.57 U/mL 之間，三者差異不顯著；B.megateriumN447-3 和B.megateriumB1，蛋白酶活性僅為5 U/mL 左右 ；其他8 株菌株的蛋白酶活性均小于2 U/mL。菌株在不同培養(yǎng)基條件下酶活性不同，使用發(fā)酵培養(yǎng)基（底物酪蛋白為唯一氮源）后，15 株菌株的中性蛋白酶活性普遍有所提升，但菌株間蛋白酶活性的相對大小并未發(fā)生改變。

圖2 菌株在不同培養(yǎng)基條件下的蛋白酶活性檢測結(jié)果Fig.2 Detection results of protease activity of strains under different medium conditions

2.2 不同菌種攜帶不同的胞外蛋白酶相關(guān)基因組合

通過對菌株全基因組上蛋白酶相關(guān)基因的篩查與統(tǒng)計，芽孢桿菌屬細菌攜帶有8 種胞外蛋白酶相關(guān)基因，包括aprE、aprX、nprE、epr、vpr、nprB、wprA和mpr。對上述基因的種類、轉(zhuǎn)錄方向、序列長度和染色體組中相對位置進行分析，可將其分為7 種基因型（G1～G7，圖3）。3 株B.subtiliis菌株N1282-4at、N1108-5at、N1303-2Ay 屬于G1 型，特點是染色體組上攜帶有上述8 種胞外蛋白酶基因。Bacillussp.A1、B.velezensisC1 屬于G2 型，染色體組上攜帶aprX、vpr、epr、mpr。B.altitudinisN435-3 屬于G3 型，相比G1 型缺少mpr、nprB和nprE。B.oceanisediminisN497-ZHONG 屬于G4 型，染色體組上攜帶aprX、vpr、nprB。B.megateriumN447-3、B.megateriumB1、B.aryabhattaiB2 屬于G5 型，染色體組上僅攜帶wprA、vpr，但同時存在2 個vpr。G6 型可分為3 個亞型G6.1、G6.2 和G6.3，其中B.cereusN435-1 屬于G6.1 型，菌株染色體組上攜帶vpr、nprB和mpr；BacillusN447-1屬于G6.2型，相比G6.1型缺少mpr；而BacillusN470-1 則屬于G6.3 型，染色體組上僅攜帶vpr。B.pseudomycoidesN451-2 屬于G7 型，染色體組上僅攜帶nprB。菌株Brevibacillus parabrevisB3 的染色體上則沒有攜帶上述8 種基因。

圖3 芽孢桿菌屬菌株蛋白酶的基因型分類結(jié)果F ig.3 Genotype classification results of Protease in Bacillus strains

通過與NCBI 數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有芽孢桿菌屬細菌的全基因組數(shù)據(jù)（截至2021 年11 月21 日）進行比對，結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)，在NCBI 數(shù)據(jù)庫有173 株B.subtiliis具有全基因數(shù)據(jù)，其中159 株符合G1型基因分布（91.9%，159/173）；B.velezensis有97.6%（168/172）符合G2 型；B.altitudinis100%（22/22）符 合G3 型；沒 有B.oceanisediminis符合G4 型，考慮到NCBI 數(shù)據(jù)庫中僅有2 株B.oceanisediminis的全基因組數(shù)據(jù)，因此存在較大偶然性；B.megaterium有87.5%（21/24）、B.aryabhattai有100%（2/2）符 合G5 型；而B.cereus中僅有10.1%（8/79）符合G6.1 型，更多的是88.9%（70/79）符合G6.2 型，B.toyonensis100%（7/7）符 合G6.3 型；B.pseudomycoides100%（2/2）符合G7 型。

2.3 細菌蛋白酶基因分型與其進化關(guān)系存在關(guān)聯(lián)

繪制基于細菌16S rDNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），15 株菌株（紅色）可分為Bacillus和Brevibacillus兩個屬，其中14 株屬于Bacillus，1 株屬于Brevibacillus。Bacillus屬可分為3 個分支，其中G1、G2、G3 型所屬菌株的親緣關(guān)系接近為一個分支（綠色），G4、G5 型所屬菌株的親緣關(guān)系接近為一個分支（黃色），G6、G7 型所屬菌株的親緣關(guān)系接近為一個分支（藍色）。B revibacillus parabreviB3 作為一個單獨的分支出現(xiàn)，表明其與其他細菌物種的親緣關(guān)系較遠。通過與細菌的蛋白酶基因分型（圖3）進行比對可發(fā)現(xiàn)，菌株與枯草芽孢桿菌親緣關(guān)系越近，其染色體上攜帶的胞外蛋白酶基因種類越齊全。

圖4 基于細菌16S rDNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strains

2.4 芽孢桿菌蛋白酶基因分析

結(jié)合菌株的基因型分型結(jié)果（圖3）與產(chǎn)蛋白酶能力檢測結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)，mpr、epr、vpr、nprB和wprA等5 個蛋白酶基因在產(chǎn)蛋白酶能力高和產(chǎn)酶能力低的菌株中均有攜帶情況。nprE基因僅有G1 型菌株攜帶，但其產(chǎn)酶能力低于不攜帶nprE的G2型。存在aprX和aprE的G1 型和G2 型菌株，其H/C 值和蛋白酶活性也均高于其他菌株，而也攜帶aprX和aprE的G3 型和攜帶aprX的G4 型菌株雖然其蛋白酶活性較低，但在酪蛋白瓊脂上的H/C 也是高于除G1 型和G2型菌株外的其他菌株。G1～G4 型菌株的共同特征是攜帶aprX或aprE基因，因此本研究將影響菌株產(chǎn)蛋白酶能力的重要基因初步確定為aprE和aprX。

2.5 不同菌種間蛋白酶基因aprX 表達差異顯著

為了探究影響菌株產(chǎn)蛋白酶能力的重要基因是否為aprX和aprE，本研 究檢測了B.velezensisC1、B.subtiliisN1282-4at、B.altitudinisN435-3、B.oceanisediminisN497-ZHONG在不同培養(yǎng)基（NB 培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基）條件下aprX、aprE的mRNA 水平。在N B 培養(yǎng)基（圖5A，以B.subtiliisN1282-4at 作為對照），B.velezensisC1 的aprXm RNA 相對水平顯著高于其他3 株菌株，為B.subtiliisN1282-4at 的2.7倍左右；B.altitudinisN435-3 則僅為N1282-4at 的60%；而B.oceanisediminisN497-ZHONG 則無表達或相比B.subtiliisN1282-4at 表達量過小。在發(fā) 酵培養(yǎng)基（圖5C），相比NB 培養(yǎng)基，B.velezensisC1 的aprXmRNA相對水平上升為B.subtiliisN1282-4at的3.6倍左右；B.altitudinisN435-3 也有所升高，為B.subtiliisN1282-4at 的80%；而B.oceanisediminisN497-ZHONG 仍無表達或相比B.subtiliisN1282-4at 表達量過小。由圖 5B、圖5D 可見，發(fā)酵 培養(yǎng)基中B.altitudinisN435-3 的aprE相對表達水平為B.subtiliisN1282-4at 的約1.2 倍，差異顯著，其余差異均不顯著。根據(jù) 結(jié)果推測，aprX是影響芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力的重要基因。

圖5 不同培養(yǎng)基菌株aprX 和aprE 的相對表達水平Fig.5 Relative expression levels of aprX and aprE under different medium conditions

3 討論

本研究通過對15 株菌株進行全基因組測序，獲得了菌株的全基因組信息，并根據(jù)菌株染色體上攜帶的蛋白酶基因數(shù)量、種類、轉(zhuǎn)錄方向?qū)⑵浞譃? 種基因型，并進行比較基因組學分析。在15 株菌株中僅有G1 型的B.subtiliis擁有最全的8種蛋白酶基因，其他菌株都缺乏多種蛋白酶基因。通過對NCBI 數(shù)據(jù)庫中已有菌株全基因組信息的比對，發(fā)現(xiàn)不同來源的相同菌種絕大多數(shù)歸為同一基因型，可以認為在芽孢桿菌屬不同來源的相同菌種間，蛋白酶基因攜帶情況保守。

有研究指出，枯草芽孢桿菌的主要胞外蛋白酶分別是aprE編碼的枯草桿菌蛋白酶和nprE編碼的中性金屬蛋白酶［17-18］。但本研究結(jié)果顯示，僅G3 型菌株B.altitudinisN435-3 的aprEmRNA水平在發(fā)酵培養(yǎng)基條件下是G1 型菌株B.subtiliisN1282-4at 的約1.2 倍，其他情況差異不顯著。而nprE僅G1 型菌株攜帶，但缺乏nprE的G2 型菌株的產(chǎn)蛋白酶能力高于G1 型菌株。可能是因為G1 型菌株的nprE表達水平過低使NprE 的活性沒有表現(xiàn)出來，同時aprE表達水平與G2 和G3 型細菌處于同一水平，而G2 型的aprX表達水平卻顯著高于G1 型菌株所致。

芽孢桿菌屬菌株通常在指數(shù)生長期后期開始大量產(chǎn)生胞外蛋白酶，這使得細菌可以高效利用外界的營養(yǎng)物質(zhì)，從而確保其正常的生長發(fā)育［19］?？刂蒲挎邨U菌胞外蛋白酶表達的調(diào)節(jié)途徑非常復雜，如AbrB、SinR 和ScoC 等調(diào)節(jié)因子可以抑制芽孢桿菌蛋白酶基因的表達，但Spo0A 可以抑制AbrB 和SinR 的活性從而促進蛋白酶的產(chǎn)生［19］。此外，aprE和nprE還受到全局轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子CodY 的強大且直接的負反饋調(diào)節(jié)，但由于CodY同時也抑制ScoC［20］，因此CodY 除了是aprE和nprE的直接負調(diào)節(jié)因子外，還通過抑制scoC的高水平表達充當相同基因的間接正調(diào)節(jié)因子。由于CodY 和ScoC 都是aprE和nprE的強阻遏物，并且CodY 會在含有過量氨基酸的培養(yǎng)基中具有活性，但隨著氨基酸耗盡會失去活性［21］?？紤]到G1 型和G2 型菌株的進化關(guān)系接近，這或許可以解釋為何G1 型細菌的產(chǎn)蛋白酶能力低于G2型細菌。本研究在細菌生長的后期階段檢測了細菌產(chǎn)蛋白酶的能力和基因的表達，而此時營養(yǎng)物質(zhì)的消耗導致CodY 的部分失活，從而減輕了對ScoC 的抑制，使ScoC 水平升高，持續(xù)抑制aprE和nprE的表達。因此結(jié)合熒光定量PCR 結(jié)果，aprE和nprE由于CodY 的失活導致對ScoC 抑制的減弱，從而受到ScoC 的強抑制，使細菌aprE和nprE的mRNA 水平降低。因此除aprE和nprE外，aprX是影響芽孢桿菌屬細菌產(chǎn)胞外蛋白酶能力的又一重要基因。

蛋白酶是一種誘導酶，其在細菌內(nèi)部的生物合成受到多種因素誘導（如蛋白酶底物和底物類似物），同時也會受到細菌生存環(huán)境中易利用氮源（如氨基酸和銨鹽等）的阻遏［22-23］。因此，當外界環(huán)境中存在大量營養(yǎng)物質(zhì)時，細菌只會產(chǎn)生少量蛋白酶來維持必要的生理活動，只有在外界環(huán)境缺乏易利用氮源時，細菌才會大量產(chǎn)生蛋白酶，去獲取環(huán)境中其他難利用的大分子蛋白質(zhì)。這也解釋了為何細菌在發(fā)酵培養(yǎng)基（唯一氮源為酪蛋白）條件下aprX和aprE的表達水平比在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基條件下高。

4 結(jié)論

本研究對15 株芽孢桿菌進行全基因組測序獲得了菌株的全基因組信息，并根據(jù)菌株攜帶的蛋白酶基因情況進行了基因分型，通過對NCBI數(shù)據(jù)庫中已有菌株全基因組信息的比對，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌不同來源的相同菌種間蛋白酶基因攜帶情況保守。通過構(gòu)建進化樹并與基因分型結(jié)果進行比對，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬菌株與枯草芽孢桿菌親緣關(guān)系越近，攜帶的胞外蛋白酶基因種類越齊全。通過對15 株芽孢桿菌進行產(chǎn)蛋白酶能力檢測，并進行比較基因組學分析和qRT-PCR 驗證，發(fā)現(xiàn)aprX是影響芽孢桿菌屬細菌產(chǎn)蛋白酶能力的重要基因。