廖雨冰，汪宏譯，尹白云，蔡陽美，于天豪，王岐本

（湘南學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 郴州 423043）

高血壓（Hypertension），是血液在血管中流動(dòng)時(shí) 對(duì)血管壁造成的壓力值持續(xù)高于正常的現(xiàn)象。高血壓是心腦血管病最主要的危險(xiǎn)因素之一[1]。以體循環(huán)動(dòng)脈壓增高為主要表現(xiàn)[2]，可伴有多器官相應(yīng)并發(fā)癥狀和器質(zhì)性損傷。目前，得到廣泛認(rèn)可的高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)是收縮壓≥140 mmHg 或舒張壓≥90 mmHg。據(jù)最新數(shù)據(jù)顯示人群患病風(fēng)險(xiǎn)持續(xù)加大[3]。目前，絕大多數(shù)患者采取的是長(zhǎng)期藥物保守治療方式。薺菜（Capsella bursa-pastoris（Linn.）Medic.） 具有降血壓的功效，可用于治療血崩、高血壓等[4]，還具有多種藥理活性，如降脂降壓、消炎抗病毒、防癌抗癌等[5-6]。研究表明，薺菜中的活性成分山奈酚具有抗氧化、抗炎等作用，還可內(nèi)皮依賴性舒張血管，抑制AngⅡ?qū)е碌难苤貥?gòu)，同時(shí)通過抑制IKK/NFκB 炎癥損傷IRS-1 改善II 型糖尿病大鼠的胰島素抵抗，并可調(diào)節(jié)血脂。此外，山奈酚不僅能抑制銅離子誘導(dǎo)LDL 氧化成ox-LDL，而且還可以降低THP-1性巨噬細(xì)胞表面CD36 蛋白表達(dá)，阻止其對(duì)ox-LDL的攝取，從而預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化，可預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化，從而相對(duì)緩解高血壓癥狀，對(duì)高血壓起到一定的輔助治療作用[7-8]。中醫(yī)臨床中也常用包括薺菜在內(nèi)的中藥復(fù)方治療高血壓，由此可見薺菜在治療高血壓方面具有良好的潛力[9]，然而目前對(duì)于薺菜治療高血壓的藥理作用及試驗(yàn)研究還未成熟，薺菜發(fā)揮高血壓治療作用的分子機(jī)制尚未完全闡明。研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，為探究薺菜治療高血壓提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 薺菜活性成分及藥物靶點(diǎn)的篩選

首先篩選薺菜的化學(xué)成分，用TCMSP（https：//tcmsow/tcmsp.php）。將藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)作為首要篩選依據(jù)。設(shè)置口服生物利用度（OB） ≥30%，類藥性（DL） ≥0.18。所得到的結(jié)果作為初步篩選得到的藥物有效成分。將初步得到的藥物有效成分在Uniprot 數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/） 和String 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/） 中進(jìn)行查詢得到靶標(biāo)蛋白的基因名稱，得到了薺菜的相關(guān)基因靶點(diǎn)。

1.2 高血壓疾病靶點(diǎn)的獲取

以“hypertension”為關(guān)鍵詞，在人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫Gene Cards（https：//genecards.weizmann.Ac.il/v3/） 中搜索，獲取高血壓靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建“藥物- 活性成分- 共同靶點(diǎn)- 疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

通過韋恩圖，把高血壓的疾病靶點(diǎn)和藥物活性成分的靶點(diǎn)進(jìn)行篩選分析，將得到二者的共同靶點(diǎn)，將共同靶點(diǎn)作為薺菜治療高血壓的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI） 的構(gòu)建與分析

把已經(jīng)篩選出來的薺菜治療高血壓的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，限定篩選物種為“Homo”（人類），相互作用閾值設(shè)置為0.4，其余篩選條件保持不變，進(jìn)而得到蛋白的相互作用關(guān)系；利用Cytoscape 3.8.2 獲得薺菜治療高血壓的關(guān)鍵靶點(diǎn)的相互或用結(jié)果（PPI 網(wǎng)絡(luò)圖）。

1.5 GO 功能分析及KEGG 信號(hào)通路富集分析

使用Metascape（http：//metascape.org） 將篩選條件設(shè)置為p＜0.01，min overlap=3，min enrichment=1.5，將在此條件下篩選得到的靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG通路分析。

1.6 構(gòu)建“藥物- 活性成分- 靶點(diǎn)- 通路”之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

在Cytoscape 3.8.2 數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)入前述篩選的活性成分、靶點(diǎn)及KEGG 富集到的主要信號(hào)通路，用以構(gòu)建“藥物- 活性成分- 靶點(diǎn)- 通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 薺菜活性成分

薺菜部分活性成分的基本信息見表1。

表1 薺菜部分活性成分的基本信息

2.2 高血壓疾病靶點(diǎn)的獲取結(jié)果

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中查找共得到高血壓相關(guān)靶點(diǎn)8 873 個(gè)高血壓疾病靶點(diǎn)基因。

2.3 “藥物- 活性成分- 共同靶點(diǎn)- 疾病”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

集采活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)基因70 個(gè)。將結(jié)果進(jìn)行Venn 分析，獲得共同靶點(diǎn)65 個(gè)（圖1），與之對(duì)應(yīng)得薺菜活性成分為10 個(gè)。用Cytoscape 3.8.2 進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的處理，將結(jié)果可視化。網(wǎng)絡(luò)中共108 個(gè)節(jié)點(diǎn)，相互作用的邊160 條（圖2）。其中，度值相對(duì)較高的化合物有Kaempferid（山柰素）、Gossypetin hexamethyl ether（棉花皮素六甲醚）、Sinoacutine（清風(fēng)藤堿）、beta-carotene（β - 胡蘿卜素）、yohimbine（鹽酸育亨彬） 等。

薺菜治療高血壓（AD） 的藥物- 疾病共同靶點(diǎn)韋恩圖見圖1，薺菜治療高血壓的“藥物- 活性成分- 共同靶點(diǎn)- 疾病”網(wǎng)絡(luò)圖見圖2。

圖1 薺菜治療高血壓（AD） 的藥物- 疾病共同靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 薺菜治療高血壓的“藥物- 活性成分-共同靶點(diǎn)- 疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 靶蛋白相互作用（PPI） 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析

薺菜抗高血壓的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖見圖3。

圖3 薺菜抗高血壓的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

PPI 圖中共64 個(gè)節(jié)點(diǎn)，465 條相互作用連線。經(jīng)計(jì)算， PPI 中節(jié)點(diǎn)平均自由度為14.50。將潛在靶點(diǎn)信息按照Degree 值排名整理后分析，前8 個(gè)分別為ALB，AKT1，VEGFA，JUN，CASP3，MYC，ESR1，PTGS2。

薺菜抗高血壓的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)見表2。

表2 薺菜抗高血壓的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.5 GO 分析及KEGG 信號(hào)通路分析

共富集得到50 個(gè)條目，其中分子功能條目15 個(gè)（cellularcomponent，CC），生物過程條目17 個(gè)（biologicalprocess， BP），細(xì)胞組成條目18 個(gè)（molecularfunction，MF）。

薺菜治療高血壓的潛在作用靶點(diǎn)的GO 分析見圖4，薺菜抗高血壓的潛在作用靶點(diǎn)的KEGG 信號(hào)通路富集分析見圖5。

圖4 薺菜治療高血壓的潛在作用靶點(diǎn)的GO 分析

圖5 薺菜抗高血壓的潛在作用靶點(diǎn)的KEGG 信號(hào)通路富集分析

KEGG 信號(hào)通路分析篩選一共得到15 條通路，對(duì)之前得到的薺菜治療高血壓的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析（圖5），得到靶點(diǎn)數(shù)量前6 位的信號(hào)通路為節(jié)律過程、有機(jī)羥基化合物轉(zhuǎn)運(yùn)、丙型肝炎與肝細(xì)胞癌、單胺GPCR、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素信號(hào)通路，離子轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)?？烧J(rèn)為是薺菜治療高血壓的核心通路[10-14]。

2.6 “藥物- 活性成分- 靶點(diǎn)- 通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

薺菜治療高血壓的“藥物- 活性成分- 靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖見圖6。

圖6 薺菜治療高血壓的“藥物- 活性成分- 靶點(diǎn)- 通路”網(wǎng)絡(luò)圖

將KEGG 信號(hào)通路富集結(jié)果前6 位的通路和薺菜的有效活性成分、作用靶點(diǎn)之間結(jié)合，構(gòu)建藥物、活性成分、靶點(diǎn)、通路4 個(gè)要素之間的網(wǎng)絡(luò)圖，（圖6）。共11 種活性成分作用于上述6 種信號(hào)通路。其中，beta-carotene（β - 胡蘿卜素）、Sinoacutine（清風(fēng)藤堿）、yohimbine（鹽酸育亨彬） 共63 個(gè)靶標(biāo)發(fā)揮重要作用，其中AKT1，OPRM1，NOS2，GJA1發(fā)揮作用最為明顯，將之作為薺菜治療高血壓的關(guān)鍵靶點(diǎn)。提示薺菜主要通過節(jié)律過程、有機(jī)羥基化合物轉(zhuǎn)運(yùn)、丙型肝炎與肝細(xì)胞癌、單胺GPCR、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素信號(hào)通路、離子轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)幾條通路發(fā)揮治療高血壓的作用。

3 結(jié)論

高血壓是我國(guó)高發(fā)的典型慢性病、常見病之一。其中醫(yī)病機(jī)多與飲食、情志、遺傳等因素引起的氣血陰陽不調(diào)有關(guān)，肝風(fēng)、脾濕、腎虛各為病之標(biāo)、病之源及病之本[15]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)則認(rèn)為其發(fā)病受多種機(jī)制的相互影響，如RAAS 系統(tǒng)、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)等[16]。這些機(jī)制長(zhǎng)期惡性作用，會(huì)破壞血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致血管舒縮功能失調(diào)、外周阻力增加等問題，進(jìn)而造成血壓升高。薺菜具有和脾等功效，可用于輔助治療高血壓引起的水腫、面紅目赤等癥狀。但具體活性成分及其作用通路尚不清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)設(shè)計(jì)的學(xué)科。便于從分子角度構(gòu)建藥物-活性成分- 共同靶點(diǎn)- 疾病網(wǎng)絡(luò)圖，梳理藥物與疾病之間的作用關(guān)系，達(dá)到精準(zhǔn)治療的目的[17-18]。因此，采取此模式探討薺菜活性成分抗高血壓的潛在作用機(jī)制。

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18作為篩選條件，同時(shí)參考BBB 值進(jìn)行薺菜藥效成分篩查，得到可能有顯著降壓療效的12 種成分。其中，山柰素、棉花皮素六甲醚、清風(fēng)藤堿、β - 胡蘿卜素、鹽酸育亨彬?yàn)殛P(guān)鍵成分，鄰苯二酸酯等起協(xié)同作用（圖2）。有研究表明，山奈酚具有抗炎等作用，還可內(nèi)皮依賴性舒張血管，抑制AngⅡ?qū)е碌难苤貥?gòu)，同時(shí)通過抑制IKK/NF-κB 炎癥損傷IRS-1改善II 型糖尿病大鼠的胰島素抵抗，并可調(diào)節(jié)血脂[16]。此外，山奈酚不僅能抑制銅離子誘導(dǎo)LDL 氧化成ox-LDL，而且還可以降低THP-1 性巨噬細(xì)胞表面CD36 蛋白表達(dá)，阻止其對(duì)ox-LDL 的攝取，從而預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化，可相對(duì)緩解高血壓癥狀[19]。清風(fēng)藤堿具有明顯抗炎、免疫調(diào)節(jié)、保肝、降血壓等作用[20]。例如，胡祚俊等人[21]采用大量臨床對(duì)照試驗(yàn)證明小花清風(fēng)藤能有效治療病毒性肝炎等。邱模昌等人[22]認(rèn)為，β - 胡蘿卜素能降低高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，機(jī)制可能與增加NO 水平和促進(jìn)ROS 的降解有關(guān)。郭錦晨等人[23]認(rèn)為，β - 胡蘿卜素能降低LDL 氧化、消除自由基、預(yù)防血管損傷。此外，收集到的薺菜與高血壓共同靶點(diǎn)基因65 個(gè)，包含了多個(gè)抗炎、抗氧化、保護(hù)血管等因子，表明薺菜治療高血壓是多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的結(jié)果。

將65 個(gè)藥物- 疾病共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫中，獲取靶標(biāo)蛋白互作關(guān)系，并于Cytoscape 3.8.2 中繪制得到1 個(gè)以AKT1，VEGFA，JUN，PTGS2 等為核心靶點(diǎn)的具有26 個(gè)節(jié)點(diǎn)和155 條連線的PPI。其中，血管內(nèi)皮障礙相關(guān)基因AKT1 等通過MAPK 信號(hào)通路促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，從而加速血管生成，并與高血壓的發(fā)生密切相關(guān)[24]。VEGFA 作為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可誘導(dǎo)新生血管形成并調(diào)節(jié)血管張力[25]。JUN 是AP-1 的組分之一，而AP-1 可誘導(dǎo)IL6，IL10，TNF 等的表達(dá)，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞及炎癥細(xì)胞的增殖，使管壁向內(nèi)增厚致血壓升高[26]。AP-1 可調(diào)控高血壓心肌肥厚相關(guān)基因的早期應(yīng)答，并可在一定程度上軟化老年高血壓動(dòng)脈[24]。PTGS2在受到細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)、缺氧等刺激可迅速上調(diào)，激活血小板和內(nèi)皮細(xì)胞上的相關(guān)受體，使血管平滑肌松弛并抑制血小板聚集，以降低血壓。同時(shí)，其生成的前列腺素還能促進(jìn)細(xì)胞增殖和加速血管生成[25，27]。不僅如此，PTGS2 還與女性高血壓密切相關(guān)[28]。分子對(duì)接證明PTGS2 與山柰酚、β - 胡蘿卜素等能較好地結(jié)合且構(gòu)象穩(wěn)定，共同發(fā)揮作用，可能是薺菜治療高血壓的重要成分靶點(diǎn)所在[23]。

對(duì)潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)一步作GO 富集及KEGG 通路分析，更深入地探討薺菜的作用機(jī)制。如圖4 和圖5 顯示，薺菜可能通過參與細(xì)胞的刺激反應(yīng)、細(xì)胞通訊信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、有機(jī)物代謝過程等生物學(xué)過程，在細(xì)胞核腔、囊泡、細(xì)胞器內(nèi)膜系統(tǒng)等部位，發(fā)生蛋白質(zhì)二聚活性激活、腎上腺素能受體、G 蛋白偶聯(lián)胺受體活性激活、腎上腺素能受體活性激活、蛋白質(zhì)結(jié)合等分子反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控生物節(jié)律過程通路、有機(jī)羥基化合物轉(zhuǎn)運(yùn)通路、丙型肝炎與肝細(xì)胞癌信號(hào)通路、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素信號(hào)通路、單胺GPCR 信號(hào)通路、離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)信號(hào)通路等發(fā)揮降壓作用。有研究表明，有機(jī)羥基化合物的作用機(jī)制與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF） 有關(guān)。劉崇棟等人[29]發(fā)現(xiàn)，聚乙二醇等高分子材料可通過緩慢釋放VEGF以延長(zhǎng)其在體內(nèi)活性維持時(shí)間，從而促進(jìn)血管生成。任麗麗等人[30]認(rèn)為，10 HCPT 能抑制RASF 表達(dá)VEGF水平，從而抑制血管新生。GPCRs 可替代內(nèi)皮素- 1等血管活性物質(zhì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)者以調(diào)節(jié)血壓，且GPCRs若激活不當(dāng)可引起高血壓和血管功能障礙[31]。CRH 在一定濃度內(nèi)可降低HaCaT 細(xì)胞VEGF mRNA 和蛋白的表達(dá)[32]。離子通道對(duì)于高血壓疾病意義重大，尤其是鈣離子通道，可影響心肌收縮、血管張力等。阻滯鈣離子內(nèi)流可有效舒張血管并降低外周血管阻力，具有良好的療效[18]。

綜上所述，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)地分析了薺菜治療高血壓的作用機(jī)制，揭示了其治療高血壓潛在的活性成分及作用網(wǎng)絡(luò)，證明了薺菜主要是通過改善血管內(nèi)皮功能、促進(jìn)血管新生來達(dá)到治療目的，具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的特點(diǎn)。為進(jìn)一步探討薺菜針對(duì)高血壓的輔助治療發(fā)揮作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究提供方向，其后續(xù)尚需體內(nèi)外試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)其功效網(wǎng)絡(luò)的內(nèi)在關(guān)聯(lián)和作用靶點(diǎn)。