王鳳麗 陳佳林 何程智 羅施中

（北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京軟物質(zhì)科學(xué)與工程高精尖創(chuàng)新中心，北京 100029）

T 細(xì)胞作為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中很關(guān)鍵的一部分，在病毒感染、癌癥以及自身的免疫中有著舉足輕重的地位［1］。T細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)主要由T細(xì)胞受體（TCR）首先辨識結(jié)合抗原肽的抗原呈遞細(xì)胞（APC）形成MHC 復(fù)合物（pMHC），接著TCR 經(jīng)過與之非共價結(jié)合的CD3 共受體將抗原信號傳遞到CD3ζ 亞基的胞內(nèi)免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM），之后通過啟動下游的T 細(xì)胞內(nèi)級聯(lián)免疫信號通路等生理過程來殺死病原感染細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞［2］。TCR?CD3 復(fù)合物主要包括由二硫鍵共價連接的TCRαβ 聯(lián)合，包括γ、δ、ε 和ζ 亞基非共價結(jié)合的3個CD3信號傳導(dǎo)二聚體［3?4］。TCR?CD3復(fù)合物各亞基在配體的辨識、信號傳導(dǎo)等過程中都有著不可取代的重要作用。由于TCRα、TCRβ 并沒有胞內(nèi)信號傳遞區(qū)域序列，因此普遍認(rèn)為TCRαβ主要通過與CD3 的胞外區(qū)、跨膜區(qū)的相互作用，將信號傳遞給CD3 的胞內(nèi)區(qū)完成下游生理過程［5?6］。

Call 等［7］發(fā)現(xiàn)每一個CD3 二聚體與TCR 的組裝都需要一個堿性殘基和兩個酸性殘基的作用界面。最近有研究再一次證實了TCR?CD3 復(fù)合物由二硫鍵相連的αβ 異二聚體與γε、δε'和ζζ'三個非共價連接的CD3信號傳遞共受體以αβ∶δε'∶γε∶ζζ'=1∶1∶1∶1的占比組成［8］（附件圖S1）。然而在該結(jié)構(gòu)解析之前，針對TCR?CD3 復(fù)合物的研究多是以其胞外區(qū)為主，而且是單獨的二聚體、三聚體的研究，甚至脫離了細(xì)胞膜環(huán)境［2，9?12］。

大多數(shù)為研究蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)相互作用而設(shè)計的技術(shù)都是針對可溶性蛋白質(zhì)開發(fā)的，對膜蛋白中疏水的跨膜部分結(jié)構(gòu)和功能研究仍缺乏有效的方法。由于計算機(jī)科學(xué)的飛速發(fā)展，分子動力學(xué)模擬逐漸成為研究膜蛋白結(jié)構(gòu)和組裝的一種重要手段。在2008年就有研究團(tuán)隊通過粗粒化模擬（CGMD）的方法模擬了最具代表性的跨膜蛋白二聚體GPA，其野生型模擬結(jié)果與核磁共振（NMR）結(jié)構(gòu)一致［13］。除此以外，分子動力學(xué)模擬在糖蛋白Ibβ［14］、PSGL?1［15］、DAP12?NKG2C［16］等跨膜蛋白的研究上已經(jīng)取得重要的進(jìn)展。

目前針對TCR?CD3 復(fù)合物亞基間相互作用的研究多是單獨胞外區(qū)［12］的研究，且只涉及到二聚［10］、三聚［9，11］等，并不全面。同時由于實驗條件的限制，多數(shù)研究都脫離了細(xì)胞膜環(huán)境，然而已知細(xì)胞膜環(huán)境對于膜蛋白的信號傳遞這類生理活動是至關(guān)重要的［17］。盡管解析出了TCR?CD3八聚體復(fù)合物較為完整的晶體結(jié)構(gòu)［8］，但對于其自組裝機(jī)制尚未完全清楚。從研究的目的來看，目前的傳統(tǒng)實驗是很難在原子級別上對生物大分子的行為進(jìn)行納秒微秒尺度的實時觀測和分析，而分子動力學(xué)模擬恰好可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)實驗研究的這一缺點。傳統(tǒng)實驗和新興理論模擬技術(shù)能夠做到相輔相成、互相佐證，從而可以多方面、多角度、深層次地研究生物體內(nèi)生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的性質(zhì)。由于模擬體系的限制，難以通過模擬來達(dá)到分析TCR?CD3 復(fù)合物全長的組裝，且跨膜蛋白的跨膜區(qū)受到難分離等特點的限制，導(dǎo)致難以通過傳統(tǒng)實驗技術(shù)分析，使得相應(yīng)的研究較少。因此本文主要利用CGMD對TCR?CD3 跨膜區(qū)進(jìn)行自組裝的模擬，隨后通過拉伸動力學(xué)模擬（SMD）來分析全長序列亞基間跨膜區(qū)、胞外區(qū)的結(jié)合特點，最后通過分別去除δε'、γε、ζζ'二聚體的跨膜區(qū)六聚體的全原子模擬（AAMD），分析各二聚體對其余六聚體的影響。結(jié)合以上模擬和分析，探討TCR?CD3 復(fù)合物的自組裝機(jī)制。

1 模擬方法

傳統(tǒng)的實驗技術(shù)手段耗時、成本高，且多數(shù)得到宏觀、靜態(tài)的結(jié)果，難以分析原子級別的細(xì)節(jié)。相比之下，分子動力學(xué)模擬可以研究分析生物體內(nèi)動態(tài)、原子級別的生物過程，這也是與實驗手段相比最具有優(yōu)勢的一點。

1.1 粗?；M（CGMD）

在本研究中所有模擬均是在GROMACS?2018.3［18］平臺進(jìn)行，CGMD 力場選用Martini22 力場［19］。CD3 二聚體的特異性不是由其跨膜區(qū)介導(dǎo)而是由胞外區(qū)介導(dǎo)［20］，因此在模擬過程中，將每一個二聚單體間主鏈原子約束在其原先距離1 nm范圍內(nèi)，這樣就維持了由于胞外區(qū)影響的跨膜區(qū)二聚整體構(gòu)象，但又不是將其像位置限制一樣將其固定［21］。

在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB 中下載TCR?CD3 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)文件（PDB ID 6JXR），之后在Pymol下僅保存附件表S1中跨膜區(qū)部分。以αβ與δε'的組裝為例，為了研究各二聚體相互之間的作用，先將αβ 與δε'放置在距離5 nm 的位置，添加DPPC 雙分子層膜之后進(jìn)行溶劑化，并加入抗衡離子Na+、Cl-使體系保持電中性。通過最陡下降法能量最小化保證體系的原子之間距離不會過近，結(jié)構(gòu)正常，之后進(jìn)行限制平衡使脂質(zhì)更好地堆積在蛋白質(zhì)附近。非鍵合Lennard?Jonesxia 相互作用截斷值為1.2 nm，使用粒子網(wǎng)格Ewald（PME）方案處理靜電。V?rescale （323.15 K） 和parrinello?rahman （1.0 bar、4.5×10?5bar?1）用于耦合，壓力和溫度耦合的時間常數(shù)分別為5 ps和1 ps，所有模擬均在時間步長為2 fs的周期性邊界條件進(jìn)行。足夠的平衡以后，進(jìn)行最終3 μs的模擬。

1.2 拉伸動力學(xué)模擬（SMD）

SMD 最初是由Schulten 小組提出的，建模者從單分子力譜學(xué)中獲得了這個靈感［22］。與普通MD 不同的是，在對蛋白質(zhì)大分子體系進(jìn)行SMD模擬時，會人為地對蛋白質(zhì)分子中的某個或某幾個原子施加一個假想的外力，或者對其位置進(jìn)行固定［23?24］。通 過CHARMM?GUI［25?26］（http://www.charmm?gui.org/） 網(wǎng)站建立SMD 的體系，選用CHARMM36全原子力場［27］，模擬PDB ID 6JXR中所包含的全部序列，即：胞外區(qū)、跨膜區(qū)及部分胞內(nèi)區(qū)。同樣選用DPPC 雙分子層膜、TIP3 水模型、添加抗衡離子。由于在GROMACS 中受周期性邊界的影響，要對蛋白質(zhì)進(jìn)行拉伸，盒子大小必須大于拉伸距離的兩倍。經(jīng)過多次嘗試，拉伸距離在小于15 nm左右就能將其完全拉開，因此設(shè)置體系大小為30 nm×15 nm×17 nm。同時還需注意的是，蛋白質(zhì)一開始放置的位置應(yīng)該保證αβ 跨膜區(qū)的質(zhì)心到被拉伸的二聚體跨膜區(qū)質(zhì)心的矢量方向在x正方向。在完成能量最小化和平衡操作之后（與CGMD相似），需要對TCRαβ進(jìn)行固定，之后分別拉伸δε'、γε、ζζ'跨膜區(qū)的質(zhì)心，使其沿著x正方向以1 m/s的速度恒速拉伸15 nm。

1.3 全原子模擬（AAMD）

AAMD 雖然計算量巨大，但是能夠精細(xì)模擬體系間相互作用。 所有的AAMD 均采用CHARMM36力場［27］，全原子的體系建立同樣通過CHARMM?GUI 網(wǎng)站來完成。根據(jù)CGMD 中TCR?CD3 復(fù)合物跨膜區(qū)序列，保留分別去掉δε'、γε、ζζ'二聚的六聚體，調(diào)整好正確的取向后，將其提交到CHARMM?GUI 網(wǎng) 站，設(shè) 置x、y 方 向長 度為12 nm，z 方向根據(jù)體系大小自動適配，大約在9 nm。膜仍舊采用DPPC雙層膜，溶劑采用經(jīng)典的TIP3三點水模型，抗衡離子為Na+、Cl-。全部步驟完成后下載整個輸入輸出文件， 之后于GROMACS 平臺做能量最小化、平衡，該步驟與CGMD 相似，之后設(shè)置最終產(chǎn)品模擬時長為200 ns。

2 結(jié)果與討論

2.1 CGMD 模擬TCR-CD3 復(fù)合物跨膜區(qū)的自組裝

通過CGMD 模擬TCR?CD3 復(fù)合物跨膜區(qū)的自組裝，首先將αβ與δε'放置在相距5 nm的位置，經(jīng)過3 μs 的模擬，αβ 與δε'形成四聚體（圖1a）。αβ與δε'形成的四聚體，主要表現(xiàn)為兩種類型：a.α出現(xiàn)在αβ與δε'作用的界面上（圖1b右）；b.β出現(xiàn)在αβ 與δε'作用界面上（圖1b 左），且在模擬的14 個樣本中，出現(xiàn)的比例為1∶1（附件圖S2）。已知，δε'的兩個酸性殘基（天冬氨酸）應(yīng)該是與α的堿性殘基（賴氨酸）相互作用的［7?8］，因此本文對兩種結(jié)合模式進(jìn)行了相互作用能的比較。α在作用界面上的模式相互作用力值更低，表示該種結(jié)合模式更具優(yōu)勢（圖1c）。這一模擬也說明了TCR?CD3復(fù)合物亞基間的特異性作用不是僅由跨膜區(qū)介導(dǎo)的，在胞外區(qū)可能存在更強(qiáng)的特異性作用，使δε'與α作用而非β。隨后分析了αβδε'四聚體的構(gòu)象（圖1d），與晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID 6JXR） 中一致。αK258與δD111ε'D137通過側(cè)鏈接觸穩(wěn)定了αβδε'四聚體，同時還存在α I250XXXI254、ε'V130XXXV134形成V、I 的相互作用，αF252、L255、F262、δI107、L118、ε'T141等殘基參與進(jìn)一步穩(wěn)定構(gòu)象的作用（圖1e）。

Fig.1 Coarse-grained simulation of the assembly of αβ and δε'(a) Schematic diagram of the system under VMD: the gray ball represents the DPPC phospholipid head, the off?white stick shape represents the phospholipid tail,the off?white small balls at both ends of the phospholipid are water molecules,α is represented by a blue spiral,β is represented by an orange spiral,and a purple spiral is represented δ,the yellow spiral represents ε'.(b)The distance between key residues.On the left is a schematic diagram of β at the binding interface;on the right is a schematic diagram of α at the binding interface.(c)The interaction energy of the two tetramer conformations.(d)αβδε'Tetramer conformation.(e)Enter?spiral contact matrix calculated using a cutoff value of 1nm.

對αβ 與δε'的組裝做關(guān)鍵殘基的突變模擬發(fā)現(xiàn)（圖2），對αK258、βK288做單突變，并不影響αβ與δε'的結(jié)合；突變αK258，αβδε'就表現(xiàn)為βK288與δD111ε'D137作用；突變βK288，表現(xiàn)為αK258與δD111ε'D137作用，這也再次說明僅靠跨膜區(qū)不足以介導(dǎo)TCR?CD3 復(fù)合物亞基間的特異性相互作用。當(dāng)αK258、βK288均突變后，破壞了αβ 與δε'的相互作用。而同為堿性殘基的αR253并不參與亞基間的相互作用，但是從αR253LβK288L的雙突變模擬來看，αR253的突變卻不利于αK258與δD111ε'D137的作用，這也是在之前的研究中鮮少提到的關(guān)于α兩個堿性殘基間關(guān)系的研究。

Fig.2 Mutations in key residues of αβ in the assembly of αβδε'Three parallel samples are shown for each mutation experiment.

之后按照同樣的方法進(jìn)行了αβ 與γε、αβδε'與γε的組裝（圖3a），γε放在組裝的第一步不利于其與β的作用。而在δε'存在的前提下，γE122εD137與βK288作用更有效（圖3a、c），所形成的六聚體構(gòu)象與解析的晶體結(jié)構(gòu)一致（圖3b）。同時，βI280、L281、I284、Y292、γF118、S125、L129、εV130、V134、T141參與進(jìn)一步穩(wěn)定β 與γε 的相互作用（圖3c）。

組裝為αβδε'γε 六聚體以后，將ζζ'與之前組裝好的αβδε'γε 六聚體進(jìn)行了八聚體的模擬，ζζ'DD36并不能組裝到αR253，其出現(xiàn)的位置在六聚體附近，沒有規(guī)律，甚至是不能與六聚體形成八聚體（附件圖S3）。之后將ζζ'分別放在組裝的第一步、第二步進(jìn)行了αβ 與ζζ'、αβδε'與ζζ'的組裝，ζζ'DD36均不能像晶體結(jié)構(gòu)中那樣結(jié)合到αR253（圖4）。

Fig.4 The distance between key residues during ζζ'assemblyThree parallel samples are shown for each experiment.

至此，將僅含跨膜區(qū)的TCR?CD3 復(fù)合物組裝到αβδε'γε 六聚體，加上關(guān)鍵殘基的突變，得到TCR?CD3 復(fù)合物亞基間的特異性作用并非僅由跨膜區(qū)來介導(dǎo)，而是在其胞外區(qū)可能存在更強(qiáng)的特異性相互作用；同時還發(fā)現(xiàn)αR253的突變降低了αK258與δD111ε'D137的作用；然而在跨膜區(qū)CGMD中，ζζ'沒能和六聚體組裝成八聚體。反觀TCR?CD3 復(fù)合物八個亞基間的異同，不同于其他六聚體的是，ζζ'的胞外區(qū)較短?？赡軐τ讦苼碚f，其胞外區(qū)對于其與其他二聚體的組裝來說非常重要。在其他文獻(xiàn)中也有各亞基間胞外區(qū)的大量相互作用的描述［8，12］?；诖?，接下來將對各亞基間胞外區(qū)、跨膜區(qū)相互作用的差異進(jìn)行研究。

2.2 SMD研究TCR-CD3復(fù)合物胞外區(qū)、跨膜區(qū)的結(jié)合作用力

利用SMD 模擬TCR?CD3 復(fù)合物全長序列（PDB ID 6JXR）各亞基間的結(jié)合特點，固定復(fù)合物中心的αβ，分別拉開δε'、γε、ζζ'到完全脫離六聚體，通過比較拉開各二聚體跨膜區(qū)、胞外區(qū)的力的大小，從而分析其結(jié)合特點。

Fig.5 SMD simulations(a, c) Schematic diagram of the steered process, each monomer is represented by cartoon, and different colors represent different monomers. The color representation method is consistent with Figure 3b, and the green represents ζζ'. (b) Pull force as a function of time. (d) RMSF of each monomer.red:δε'?SMD;black:ζζ'?SMD;green:γε?SMD.

如圖5 所示，對于ζζ'?SMD 而言，在1 000 ps時對應(yīng)的力為拉開其跨膜區(qū)的力（ζζ'?Ftm≈400 KJ/mol/nm），在2 600 ps 時，其胞外區(qū)與其余六聚體之間仍有相互作用，在2 800 ps左右對應(yīng)的力為拉開其胞外區(qū)的力（ζζ'?Fextra≈680 KJ/mol/nm），在5 000 ps之后，ζζ'已完全脫離αβδε'γε六聚體；對于δε'?SMD 而言，在2 000 ps 左右對應(yīng)的力為拉開其跨膜區(qū)的力（δε'?Ftm≈1240 KJ/mol/nm），在4 300 ps 附近對應(yīng)的力為拉開其胞外區(qū)的力（δε'?Fextra≈600 KJ/mol/nm），在6 000 ps 以后，δε'就已完全脫離αβγεζζ'六聚體；對于γε?SMD 而言，在1 800 ps時對應(yīng)的力為拉開其跨膜區(qū)的力（γε?Ftm≈900 KJ/mol/nm），在3 500 ps 對應(yīng)的力為拉開其胞外區(qū)的力（γε?Fextra≈480 KJ/mol/nm），在4 000 ps以后，γε已完全脫離αβδε'ζζ'六聚體。

在SMD 模擬中發(fā)現(xiàn)，對于ζζ'而言，F(xiàn)tm＜Fextra；但對于δε'和γε而言，F(xiàn)tm＞Fextra。這說明穩(wěn)定ζζ'與αβδε'γε 六聚體的主要結(jié)構(gòu)域是ζζ'的胞外區(qū)而非跨膜區(qū)，這也就進(jìn)一步解釋了本文的跨膜區(qū)CGMD中，ζζ'不能結(jié)合到α?R，卻能形成αβδε'γε六聚體的現(xiàn)象。

2.3 AAMD分析其中一個二聚體對其余六聚體的影響

根據(jù)RMSF結(jié)果（圖5d）發(fā)現(xiàn)，δε'?SMD對其他二聚體的RMSF影響最大，且對跨膜區(qū)的影響差異最大，因此通過AAMD研究TCR?CD3復(fù)合物的跨膜區(qū)，分析去除掉其中一個二聚體對其余六聚體的影響。如圖6 所示，去除掉δε'的模擬組RMSD變化最大，去除γε 的次之，變化最小的是去除ζζ'的模擬組。這也與SMD結(jié)果相符合，即：拉開δε'跨膜區(qū)的力是3個CD3二聚體中最大的。RMSD變化越大，表示結(jié)構(gòu)越不穩(wěn)定，說明ζζ'的缺失，對αβδε'γε 六聚體的構(gòu)象幾乎沒有影響，再一次解釋了在組裝過程中ζζ'結(jié)合不上，卻不影響αβδε'γε 組裝的現(xiàn)象；δε'的缺失對αβγεζζ'的構(gòu)象影響最大，這就說明δε'對TCR?CD3復(fù)合物跨膜區(qū)構(gòu)象的穩(wěn)定起著關(guān)鍵作用。

Fig.6 Using all-atom simulation to analyze the RMSD of removing one of the dimers on the remaining hexamers

3 結(jié) 論

本文通過CGMD 的方法組裝了僅存在跨膜區(qū)的TCR?CD3復(fù)合物，αβ與δε'的組裝以及相關(guān)關(guān)鍵殘基的突變，都證明了僅由跨膜區(qū)不足以介導(dǎo)TCR?CD3 復(fù)合物亞基間的特異性相互作用，在胞外區(qū)可能存在更強(qiáng)的特異性作用，從而使得δε'更傾向于與α 發(fā)生相互作用而非β。在組裝的過程中還發(fā)現(xiàn)，γε 在δε'也存在的前提下與αβ 的結(jié)合才更有效，這一點是與實驗研究結(jié)果［7］相一致的，從側(cè)面說明，γε 的組裝發(fā)生在δε'之后。ζζ'不管在組裝的哪一步，均沒有與α產(chǎn)生有效的相互作用，加上AAMD 分析去除ζζ'后對其余亞基形成的六聚體的穩(wěn)定性影響較小，暗示著ζζ'是發(fā)生在δε'、γε 組裝之后。本文從分子動力學(xué)模擬的角度闡述了TCR?CD3 復(fù)合物組裝的順序：αβ 依此結(jié)合δε'、γε、ζζ'。至于在跨膜區(qū)CGMD 中，尚未將ζζ'與αβδε'γε 六聚體組裝成八聚體的現(xiàn)象，可以通過SMD模擬結(jié)果來解釋。在SMD模擬中表明，ζζ'與αβδε'γε 六聚體的胞外區(qū)相互作用強(qiáng)于其跨膜區(qū)作用，而在本文的組裝模擬中僅包含了跨膜區(qū)。由于模擬體系大小的限制以及跨膜單體序列太長放置膜環(huán)境中會發(fā)生疏水錯配導(dǎo)致傾斜等原因［28］，要想模擬全長蛋白質(zhì)的組裝很難，因此只能做到僅含跨膜區(qū)的組裝模擬。已經(jīng)有文獻(xiàn)［29］表明，不同于其他亞基，ζζ'能獨立于αβδε'γε 之外被單獨運(yùn)送，這似乎在暗示ζζ'組裝到αβδε'γε 六聚體上形成八聚體的過程可能需要胞外區(qū)、甚至是配體的激活等過程的參與。之后通過SMD模擬說明了ζζ'胞外區(qū)的重要性，同時輔助說明了TCR?CD3 復(fù)合物的組裝順序。最后通過AAMD表明δε'二聚體是CD3信號體中穩(wěn)定TCR?CD3復(fù)合物的核心成分。

本文不僅分析了TCR?CD3 復(fù)合物自組裝的一些機(jī)制，也提出TCR?CD3 復(fù)合物間的特異性相互作用可能由其胞外區(qū)主導(dǎo)，TCR?CD3 復(fù)合物胞外區(qū)跨膜區(qū)共同調(diào)控自組裝的現(xiàn)象響應(yīng)了跨膜蛋白在細(xì)胞內(nèi)外傳遞信號的方式，但詳細(xì)的機(jī)制尚不清楚，可能成為下一步的研究內(nèi)容。

附件 PIBB_20210134_Doc_S1.pdf 見本文網(wǎng)絡(luò)版（http://www.pibb.ac.cn或http://www.cnki.net）。