郭振清 李紅強(qiáng) 隋愛霞 郭曉強(qiáng)

（1）河北科技師范學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，秦皇島 066004；2）河北省人民醫(yī)院腫瘤科，石家莊 050051；3）河北體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)系，石家莊 050041）

氧是地球上最重要的元素之一，在地殼含量最高（48.6%）；氧對(duì)生命而言更是至關(guān)重要，人體元素組成中65%為氧，高等生物主要依賴營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的氧化供能。生命在演變過程中形成一個(gè)完善的氧感知和低氧適應(yīng)系統(tǒng)，以適應(yīng)不同環(huán)境下氧含量變化［1］。由于在闡明這個(gè)系統(tǒng)過程中的奠定性貢獻(xiàn)，三位科學(xué)家分享了2019年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)［2?3］。

1 低氧信號(hào)通路

低氧信號(hào)通路核心分子為低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia?inducible factor，HIF），它由兩種亞基組成，分別為HIF?α 亞基和HIF?β 亞基，其中HIF?α亞基蛋白穩(wěn)定性受氧濃度的嚴(yán)格調(diào)控，而HIF?β亞基則與氧含量無關(guān)。氧含量正常時(shí)，HIF?α亞基被脯氨酰羥化酶（prolyl hydroxylase domain，PHD）催化發(fā)生羥基化，進(jìn)而被包含VHL（von Hippel?Lindau）因子在內(nèi)的泛素連接酶E3 實(shí)現(xiàn)泛素化修飾，最終被蛋白酶體降解；低氧狀況下，PHD 酶活性降低，HIF?α無法被羥基化和泛素化修飾，從而在細(xì)胞內(nèi)聚集，隨后進(jìn)入細(xì)胞核與HIF?β形成異二聚體， 通過與低氧應(yīng)答元件（hypoxia?responsive element，HRE）結(jié)合而激活靶基因表達(dá)［4?5］，以增加低氧脅迫下細(xì)胞適應(yīng)性（圖1）。

低氧信號(hào)通路的闡明拓展和深化了對(duì)許多生理和病理過程的理解和認(rèn)識(shí)。適當(dāng)?shù)脱踹m應(yīng)對(duì)氧化損傷和炎癥侵害如冠狀動(dòng)脈疾病、外周動(dòng)脈疾病、傷口愈合、器官移植排斥以及結(jié)腸炎等均具有保護(hù)作用；低氧信號(hào)異常則往往造成疾病發(fā)生，如過弱可造成貧血等疾病，而過強(qiáng)則是癌細(xì)胞典型特征之一，有利于癌組織血管生成和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝取等。

低氧信號(hào)通路關(guān)鍵分子還成為疾病治療重要靶點(diǎn)，如PHD抑制劑羅沙司他（Roxadustat）已被批準(zhǔn)應(yīng)用于腎性貧血臨床治療。然而，靶向HIF激活途徑的藥物卻尚未投入使用。

Fig.1 Oxygen sensing pathway［1］圖1 氧感知通路［1］

2 HIF-2α與腎癌發(fā)生

人類共存在3 種HIF?α 亞基，分別為HIF?1α、HIF?2α 和HIF?3α。HIF?1α 最早于1995年由諾貝爾獎(jiǎng)獲得者西門扎（Gregg Semenza）首先發(fā)現(xiàn)［1］；HIF?2α 于1997年 由4 個(gè) 研 究 小 組 藤 井 佳 昭（Yoshiaki Fujii?Kuriyama）、里紹（Werner Risau）、布拉德菲爾德（Christopher Bradfield）和麥克奈特（Steven McKnight） 幾 乎 同 時(shí) 獨(dú) 立 鑒 定［6?9］；而HIF?3α 則于1998年由布拉德菲爾德小組完成克?。?0］。相對(duì)于研究較少的HIF?3α，HIF?1α和HIF?2α的生物學(xué)作用得到較全面闡述。HIF?1α 全身所有細(xì)胞均可表達(dá)，而HIF?2α 只在特定細(xì)胞表達(dá)；二者調(diào)節(jié)的靶基因具有一定重疊性，但并不完全相同，尤其在腎癌發(fā)生過程中發(fā)揮截然相反的作用。

腎癌，又名腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是一種常見泌尿系統(tǒng)腫瘤，約占成人惡性腫瘤的2%～3%，全球每年約30 萬新增病例和10 萬死亡病例［11］。腎癌典型特征之一是存在高頻VHL失活性突變，尤其是亞型腎透明細(xì)胞癌（clear cell RCC，ccRCC）有高達(dá)90%以上為此類型，VHL蛋白失活破壞HIF?α正常降解途徑，造成常氧狀態(tài)下HIF?α 出現(xiàn)大量聚集［12］，被認(rèn)為是腎癌發(fā)生主要原因。最初認(rèn)為HIF?1α 和HIF?2α 均促進(jìn)了腎癌發(fā)生，然而后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)并非如此。HIF?2α 更多發(fā)揮致癌作用，本課題組研究也表明HIF?2α 可通過影響組蛋白修飾而參與腎癌發(fā)生［13］；相反HIF?1α一定程度上還具有抑癌活性［14?15］。已有研究表明，降低HIF?2α 含量可明顯抑制腎癌發(fā)展，因此靶向HIF?2α被看作腎癌治療的重要策略［16］。

3 HIF-2α抑制劑研發(fā)

按照傳統(tǒng)抑制劑開發(fā)觀點(diǎn)，作為轉(zhuǎn)錄因子一類的HIF?2α 屬于“不可成藥（undruggable）”分子。一方面轉(zhuǎn)錄因子單獨(dú)存在缺乏典型的活性位點(diǎn)，不適宜小分子化合物結(jié)合，另一方面它們定位于細(xì)胞內(nèi)，大分子單克隆抗體進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮活性也存在巨大障礙［17］，這意味著HIF?2α 抑制劑開發(fā)需另辟蹊徑，研究人員從HIF?2α 與HIF?1β 形成復(fù)合物發(fā)揮活性這一特性入手。

HIF?2α 結(jié)構(gòu)可分4 部分：N 端為堿性螺旋?環(huán)?螺旋（basic helix?loop?helix，bHLH）結(jié)構(gòu)，主要參與和DNA上靶序列HRE結(jié)合；中間為兩個(gè)串聯(lián)的PAS （PER?ARNT?SIM） 結(jié)構(gòu)域（PAS?A 和PAS?B）［18］，主要參與異二聚體（HIF?2α 與HIF?1β復(fù)合物） 形成；隨后為氧依賴降解結(jié)構(gòu)域（oxygen?dependent degradation domain，ODD），主要為PHD 識(shí)別和修飾位點(diǎn)；C 端為反式激活結(jié)構(gòu)域（transactivation domain，TAD），主要作用為招募轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)蛋白。HIF?1β 結(jié)構(gòu)與HIF?2α 類似，但只有3 部分，缺少ODD，因此蛋白質(zhì)穩(wěn)定性不依賴氧含量（圖2a）。

2009年，美國(guó)德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心布魯克（Richard Bruick）小組發(fā)現(xiàn)HIF?2α 與HIF?1β形成復(fù)合物時(shí)PAS?B結(jié)構(gòu)域形成一個(gè)較大的疏水性袋狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可被小分子化合物占據(jù)而發(fā)揮變構(gòu)調(diào)節(jié)作用，通過改變異二聚體空間結(jié)構(gòu)而影響靶基因表達(dá)［19］。HIF?2α 這一結(jié)構(gòu)特征為研發(fā)人員帶來巨大靈感，PAS?B 袋狀結(jié)構(gòu)可看作HIF?2α 特異性抑制劑發(fā)揮活性的最佳結(jié)合位點(diǎn)。2010年，佩洛頓治療公司（Peloton Therapeutics Inc.）在德克薩斯大學(xué)生物中心校園成立，開啟HIF?2α 抑制劑研發(fā)歷程。

基于HIF?2α/HIF?1β異二聚體形成過程中PAS?B結(jié)構(gòu)域特征，研究人員采用高通量篩選技術(shù)（high?throughput screening，HTS）對(duì)涵蓋20 多萬種化合物的小分子文庫進(jìn)行全面初篩，獲得上百種潛在抑制劑；進(jìn)一步根據(jù)HIF?2α 的PAS?B 與這些抑制劑結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)而縮小候選對(duì)象范圍；最后考慮這些抑制劑的結(jié)合能力、選擇特異性以及口服吸收效果等因素而鎖定兩種化合物PT2385 和PT2977 作為抑制劑（圖2b），有時(shí)亦稱拮抗劑（antagonist）。PT2385 作為體外實(shí)驗(yàn)用抑制劑，而PT2977 作為臨床藥物使用，因?yàn)橄噍^于前者，后者藥代動(dòng)力學(xué)和體內(nèi)生物利用率更為理想［20?22］。

Fig.2 The structure and inhibitors of HIF-2α/HIF-1β［22］圖2 HIF-2α/HIF-1β復(fù)合物及其抑制劑結(jié)構(gòu)［22］

體外實(shí)驗(yàn)表明，PT2385和PT2977可高效（KD在納摩爾級(jí)）抑制HIF?2α/HIF?β異二聚體形成及與DNA 結(jié)合活性，最終實(shí)現(xiàn)抑制HIF?2α 靶基因表達(dá)的目的（圖3）。兩種抑制劑的作用效果還具有較強(qiáng)選擇性，盡管HIF?1α 和HIF?2α 蛋白序列具有高度同源性，但二者在PAS?B 結(jié)構(gòu)方面存在一定差別，因此PT2385/PT2977 只抑制HIF?2α 與HIF?1β結(jié)合并降低HIF?2α 靶基因表達(dá)，而不影響HIF?1α生理功能［20，22］。

Fig.3 Mechanism of HIF-2α inhibitor圖3 HIF-2α抑制劑作用機(jī)制(https://www.cancer.gov/news?events/cancer?currents?blog/2016/hif2?kidney?cancer)

4 PT2385或PT2977治療腎癌的臨床前研究

在兩種VHL 突變的腎癌細(xì)胞786?O 和A498 來源的異種移植小鼠腫瘤模型中，PT2385 可明顯抑制HIF?2α 靶基因如CCND1、VEGFA 和GLUT1 等表達(dá)，但不影響HIF?1α 靶基因表達(dá)，說明PT2385體內(nèi)作用的特異性；進(jìn)一步通過口服給藥方式觀察到，PT2385 可劑量依賴性引起異種移植小鼠的腫瘤快速消退（相比而言，786?O 比A498 更敏感），其效果達(dá)到甚至超過經(jīng)典的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor， TKI） 舒 尼 替 尼（Sunitinib）；隨后采用一位VHL突變且經(jīng)舒尼替尼等治療后出現(xiàn)進(jìn)展的腎癌患者來源異種移植（patient?derived xenograft，PDX）小鼠模型進(jìn)行測(cè)試，經(jīng)過4 周PT2385 治療可完全抑制腫瘤生長(zhǎng)；在副作用方面，PT2385 沒有引起可檢測(cè)到的血液動(dòng)力學(xué)或心電圖異常，明顯優(yōu)于舒尼替尼［23］。

對(duì)PT2977 的作用研究發(fā)現(xiàn)，其與PT2385 類似，在體內(nèi)特異性抑制HIF?2α 靶基因表達(dá)，但對(duì)HIF?1α 靶基因沒有作用；采用786?O 和A498 來源的異種移植小鼠腫瘤模型也證實(shí)PT2977 的體內(nèi)腫瘤抑制活性［24］。另一項(xiàng)研究對(duì)來自22位VHL突變的腎癌患者建立的小鼠體外移植物模型進(jìn)行PT2977活性測(cè)試，規(guī)定腫瘤抑制80%以上為敏感，40%～80%之間為中度敏感，而低于40%為抵抗。結(jié)果表明，45%腫瘤患者（10/22）對(duì)PT2977 敏感，23%患者（5/22）對(duì)PT2977 中度敏感，敏感和中度敏感率之和達(dá)到68%；療效比較試驗(yàn)表明，PT2977 抑制效果較舒尼替尼更為顯著；在藥物耐受性方面，PT2977也更為理想，使用PT2977治療的小鼠體重出現(xiàn)增加，而使用舒尼替尼的小鼠體重明顯減輕［25］。這些喜人結(jié)果說明HIF?2α 是腎癌治療的理想靶點(diǎn)之一［26］，從而為進(jìn)一步開展臨床實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)［27］。

5 HIF-2α抑制劑治療腎癌的臨床實(shí)驗(yàn)

2014年，佩洛頓治療公司啟動(dòng)HIF?2α 抑制劑針對(duì)晚期或轉(zhuǎn)移性腎癌患者的臨床試驗(yàn)。I期臨床實(shí)驗(yàn)對(duì)已接受至少一種靶向治療的晚期腎透明細(xì)胞癌患者進(jìn)行PT2385劑量遞增測(cè)試［28］，以從中鑒定出藥物利用度和安全性最適濃度，為進(jìn)一步開展臨床實(shí)驗(yàn)提供推薦劑量。療效方面，經(jīng)過PT2385 治療，完全緩解為2%，部分緩解為12%，疾病穩(wěn)定為52%，因此疾病控制率達(dá)到66%。臨床藥物不良事件（adverse event，AE）較為輕微，大部分為1級(jí)或2級(jí)。最常見不良反應(yīng)為貧血，占比45%，這種不良反應(yīng)被稱為靶向毒性，主要源于HIF?2α 靶基因之一為促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）［29］，因此抑制HIF?2α不可避免造成紅細(xì)胞生成受阻和貧血發(fā)生。其他常見不良反應(yīng)為外周水腫（39%）和疲勞（37%）。另一項(xiàng)使用PT2977 進(jìn)行的I期臨床實(shí)驗(yàn)也獲得類似結(jié)論，55 例晚期腎癌經(jīng)PT2977 治療后，部分緩解24%，疾病穩(wěn)定54%，疾病控制率達(dá)到78%［30］，不良反應(yīng)均為輕度，最常見也是貧血（35%）。

2019年5月，佩洛頓治療公司被默克公司收購，PT2977 更名為MK6482，商品名Belzutifan。針對(duì)MK6482已完成Ⅱ期臨床，對(duì)55例晚期腎癌患者進(jìn)行的一項(xiàng)研究表明，客觀緩解率（包括完全緩解率和部分緩解率）為24%，疾病控制率達(dá)到80%，而中位無進(jìn)展生存期（progress free survival，PFS）為11 個(gè)月［31］；另一項(xiàng)針對(duì)61 例VHL 突變腎癌患者的臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，27.9%的客觀緩解率，86.9%出現(xiàn)病灶縮小，中位無進(jìn)展生存期尚未達(dá)到，而12個(gè)月的無進(jìn)展生存期比例高達(dá)98.3%［32］。兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)觀察到不良反應(yīng)均較為輕微，主要為1級(jí)或2 級(jí)，最常見不良反應(yīng)依次為貧血、疲勞和頭暈?；谶@些結(jié)果，MK6482在2020年6月被看作VHL突變腎癌治療的突破性藥物，2021年3月被美國(guó)FDA 受理新藥申請(qǐng)并授予優(yōu)先審查，有望在下半年獲批應(yīng)用于VHL突變晚期腎癌的治療。

6 HIF-2α抑制劑耐藥

臨床前和臨床實(shí)驗(yàn)過程中，除觀察到HIF?2α抑制劑理想的治療效果外，還觀察到耐藥性問題。耐藥性既包括原發(fā)性耐藥（起始治療不敏感）和繼發(fā)性耐藥（應(yīng)用一段時(shí)間后耐藥），因此針對(duì)耐藥性問題的研究一方面有益于臨床指導(dǎo)用藥，另一方面也對(duì)開發(fā)新型HIF?2α 抑制劑或聯(lián)合用藥具有重要裨益。

體外軟瓊脂生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和異種移植小鼠腫瘤模型測(cè)試發(fā)現(xiàn)，PT2977 對(duì)一些VHL 突變腎癌細(xì)胞系（如786?O和A498）敏感，但對(duì)另一些VHL突變腎癌細(xì)胞系（如769?P 和UMRC?2 等）則缺乏作用，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)部分原發(fā)性耐藥腎癌細(xì)胞存在p53基因突變，而獲得性耐藥的786?O 也出現(xiàn)p53 突變［24］，提示p53 信號(hào)通路異?？赡苁荋IF?2α 抑制劑耐藥原因之一。

判定HIF?2α 抑制劑敏感性另一策略是生物標(biāo)志物［25］。首當(dāng)其沖標(biāo)志物是HIF?2α 蛋白含量，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PT2977 敏感性腎癌83%表達(dá)HIF?2α，而耐藥性腫瘤只有23%；其次是基因表達(dá)模式差異，如敏感性腎癌通常高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子GLI1；第三是影像學(xué)證據(jù)，敏感性腎癌通常血管更為豐富。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，絲氨酸生物合成途徑關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子磷酸甘油酸脫氫酶（phosphoglycerate dehydrogenase，PHGDH）上調(diào)可能也是HIF?2α 抑制劑抗性產(chǎn)生原因［33］。

耐藥性最根本和常見原因是HIF?2α 的關(guān)鍵氨基酸突變。應(yīng)用HIF?2α 抑制劑治療一段時(shí)間后出現(xiàn)耐藥性的腎癌腫瘤組織發(fā)現(xiàn)一個(gè)保守型突變（G323E）［25，34］，突變氨基酸恰好位于PAS?B 形成口袋結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵位置，因此突變后可破壞HIF?2α抑制劑結(jié)合，從而無法發(fā)揮藥物活性；另一項(xiàng)研究從耐藥性腎癌組織鑒定出HIF?2α 的PAS?B 結(jié)構(gòu)域另一關(guān)鍵位置點(diǎn)突變（S305M）［35］，而人為制造HIF?2α 的點(diǎn)突變（S304M）也損傷PT2977 的抑制作用［24］。

鑒于HIF?2α 抑制劑耐藥性的產(chǎn)生是一個(gè)復(fù)雜過程，因此尚需進(jìn)一步研究。

7 意義和展望

腎癌作為一種放化療不敏感的惡性腫瘤，靶向治療和免疫治療成為手術(shù)后輔助治療或無法手術(shù)的首選治療策略［36?37］。目前腎癌臨床治療常用藥物有以下幾類：貝伐單抗、酪氨酸激酶抑制劑、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian targets of rapamycin，mTOR）抑制劑和PD?1/PD?L1 抑制劑等（表1）［38?39］。盡管已有多種藥物，但實(shí)際應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)，一方面很少患者能對(duì)這些藥物完全反應(yīng)，另一方面治療一段時(shí)間后都會(huì)出現(xiàn)耐藥性而使腫瘤出現(xiàn)進(jìn)展，而對(duì)于晚期或轉(zhuǎn)移性腎癌患者，5年生存率僅為8%。顯而易見，需要研發(fā)更多、更好的腎癌治療藥物［40］。

Table 1 Commonly used clinical drugs for RCC treatment表1 腎癌臨床治療常用藥物

HIF?2α 抑制劑研發(fā)成功無疑既具有重要理論意義，又具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值［41?42］。理論上這一進(jìn)展極大改觀傳統(tǒng)觀念轉(zhuǎn)錄因子不可作為藥物研發(fā)靶點(diǎn)的現(xiàn)實(shí)，為其他類似蛋白藥物設(shè)計(jì)提供重要思路；應(yīng)用方面，HIF?2α 抑制劑有望為腎癌治療提供全新選擇，提升腎癌患者生存時(shí)間和生存質(zhì)量。目前，一方面需要積極開展HIF?2α 抑制劑臨床實(shí)驗(yàn)，以期獲得最佳治療方案，另一方面需要探索HIF?2α 抑制劑耐藥機(jī)制，為提升臨床治療效果提供重要支持。