馮雙苗，張化蓮，袁有華

馬錢苷聯(lián)合靶向遷移侵襲增強(qiáng)因子1對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞遷移和凋亡的影響

馮雙苗1，張化蓮1，袁有華2*

1. 駐馬店市中心醫(yī)院 產(chǎn)科，河南 駐馬店 463000 2. 河南省人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450000

研究馬錢苷聯(lián)合靶向遷移侵襲增強(qiáng)因子1（migration and invasion enhancer 1，MIEN1）對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞遷移和凋亡的影響。采用qRT-PCR法檢測(cè)宮頸癌SiHa、Hela、CasKi細(xì)胞和正常宮頸上皮Ect1/E6E7細(xì)胞中mRNA表達(dá)。在宮頸癌SiHa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mimics上調(diào)的表達(dá)，給予馬錢苷處理，采用CCK-8法分析細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡；Transwell小室分析細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化；Western blotting法分析剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cystein-asparate protease-3，cleaved Caspase-3）和基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloprotease-2，MMP-2）蛋白表達(dá)。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)的靶基因，利用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)鑒定二者的靶向關(guān)系。在宮頸癌SiHa細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染mimics和MIEN1過表達(dá)載體，考察細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的變化。宮頸癌SiHa、Hela、CasKi細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平低于正常宮頸上皮Ect1/E6E7細(xì)胞（＜0.05），并且宮頸癌SiHa細(xì)胞中表達(dá)水平最低。上調(diào)、馬錢苷處理或二者聯(lián)合處理后的宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力均下降（＜0.05），細(xì)胞凋亡升高（＜0.05），細(xì)胞cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高（＜0.05），MMP-2蛋白表達(dá)水平降低（＜0.05），并且二者聯(lián)合處理后對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的作用更強(qiáng)。靶向促進(jìn)MIEN1表達(dá)。MIEN1過表達(dá)載體逆轉(zhuǎn)馬錢苷聯(lián)合對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的作用（＜0.05）。馬錢苷聯(lián)合靶向MIEN1能夠抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

馬錢苷；宮頸癌；miR-3619-5p；遷移侵襲增強(qiáng)因子1；凋亡；侵襲

宮頸癌是引起女性死亡的主要惡性腫瘤之一，是目前世界范圍內(nèi)的第4大癌癥，嚴(yán)重威脅著廣大女性的生命健康[1-2]。中藥以及靶向基因治療在腫瘤中的研究最為廣泛，二者有不良反應(yīng)小、安全性高等特點(diǎn)，可能是未來腫瘤治療的重要途徑。

馬錢苷是從山茱萸Sieb. et Zucc.中提取出的一種環(huán)烯醚萜類化合物，具有營養(yǎng)神經(jīng)、免疫調(diào)節(jié)、改善氧化應(yīng)激等作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，馬錢苷能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制其轉(zhuǎn)移，馬錢苷處理后的肝癌細(xì)胞凋亡水平增加，胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力降低[4-5]。

miRNA是非編碼RNA，在很多生理以及病理過程中均有調(diào)節(jié)作用，與胚胎發(fā)育、細(xì)胞生長、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等有關(guān)[6]。研究顯示，miRNA和腫瘤的關(guān)系十分密切，miRNA是未來腫瘤治療的分子靶點(diǎn)[7]。是一個(gè)在前列腺癌、甲狀腺癌等腫瘤中表達(dá)下調(diào)的調(diào)控因子，在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮抑制作用[8-9]。目前馬錢苷聯(lián)合對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚不清楚。本研究以宮頸癌SiHa細(xì)胞為研究對(duì)象，探討馬錢苷聯(lián)合在體外宮頸癌細(xì)胞惡性表型中的功能，為馬錢苷聯(lián)合治療宮頸癌提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

正常宮頸上皮Ect1/E6E7細(xì)胞（批號(hào)QCB1077）購自上海欽誠生物科技有限公司；宮頸癌SiHa（批號(hào)CL-0210）、HeLa（批號(hào)CL-0101）、CasKi（批號(hào)CL-0048）細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

mirVanan miRNA試劑盒（批號(hào)638369）、mir-X miRNA qRT-PCR SYBR試劑盒（批號(hào)638314）購自美國Clontech公司；剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cystein-asparate protease-3，cleaved Caspase-3）抗體（批號(hào)ab179517）購自美國Abcam公司；mimics、mimics control、遷移侵襲增強(qiáng)因子1（migration and invasion enhancer 1，MIEN1）過表達(dá)載體（pcDNA3.1-MIEN1）、陰性對(duì)照載體（pcDNA3.1）均由北京安必奇生物科技有限公司構(gòu)建合成；基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloprotease-2，MMP-2）抗體（批號(hào)ml085664）、MIEN1抗體（批號(hào)ml091507）購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司；馬錢苷（批號(hào)BP0884，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司。

1.3 儀器

熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；Varioskan LUX酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；C6型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；微管離心機(jī)（美國Axygen公司）；1-14K型低溫離心機(jī)（美國Sigma公司）；垂直電泳槽、電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 qRT-PCR分析宮頸癌細(xì)胞miR-3619-5p表達(dá)

分別收集處于對(duì)數(shù)生長期的宮頸癌SiHa、HeLa、CasKi細(xì)胞和正常宮頸上皮Ect1/E6E7細(xì)胞，按照試劑盒說明書提取細(xì)胞中總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。將作為的內(nèi)參。引物序列：上游引物5’-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3’，下游引物5’-GCCATCACGCCACAGTTTC-3’；上游引物5’-TTGAGGCTCTGCAGCTTAG-3’，下游引物5’-CTGTGGTGGTTTACAAAGTAATT-3’。

2.2 CCK-8檢測(cè)馬錢苷對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響

將宮頸癌SiHa細(xì)胞以3000個(gè)/孔接種到96孔板內(nèi)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，吸去培養(yǎng)基，分別加入含有馬錢苷最終質(zhì)量濃度為10、25、50、100、200 μg/mL的培養(yǎng)基，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，于振蕩儀充分混合1 min，37 ℃繼續(xù)孵育3 h。采用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔在490 nm處的吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝實(shí)驗(yàn)/對(duì)照

2.3 實(shí)驗(yàn)分組

宮頸癌SiHa細(xì)胞分成對(duì)照組、馬錢苷＋miR-NC組、miR-NC組、組和馬錢苷＋組，馬錢苷＋miR-NC組和miR-NC組均為轉(zhuǎn)染mimics control后的細(xì)胞，組和馬錢苷＋組均為轉(zhuǎn)染mimics后的細(xì)胞，馬錢苷＋miR-NC組和馬錢苷＋組細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)加入最終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的馬錢苷處理，對(duì)照組細(xì)胞不進(jìn)行處理。

按“2.1”項(xiàng)下方法檢測(cè)對(duì)照組、miR-NC組和組細(xì)胞mRNA表達(dá)。

2.4 CCK-8檢測(cè)馬錢苷聯(lián)合miR-3619-5p對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響

對(duì)照組、馬錢苷＋miR-NC組、miR-NC組、組和馬錢苷＋miR-3619-5p組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，按照“2.2”項(xiàng)下方法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)分析馬錢苷聯(lián)合miR-3619-5p對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響

對(duì)照組、馬錢苷＋miR-NC組、miR-NC組、組和馬錢苷＋miR-3619-5p組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，以PBS溶液洗滌，加入0.25%胰蛋白酶消化后，離心，收集細(xì)胞沉淀。以PBS溶液將細(xì)胞潤洗3次，加入500 μL的Binding Buffer溶液（細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL），加入5 μL Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min；加入5 μL碘化丙啶（PI），室溫避光孵育10 min，立即采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。

2.6 Transwell小室分析馬錢苷聯(lián)合miR-3619-5p對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

2.6.1 遷移實(shí)驗(yàn) 對(duì)照組、馬錢苷＋miR-NC組、miR-NC組、組和馬錢苷＋組細(xì)胞分別用無血清的細(xì)胞培養(yǎng)基懸?。?xì)胞密度為1×106個(gè)/mL），吸取200 μL各組細(xì)胞加入到Transwell小室的上室中，同時(shí)吸取500 μL含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基加入到小室的下室內(nèi)，于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室，用棉簽小心地把上室底膜中的細(xì)胞擦除，以4%多聚甲醛固定上室底膜內(nèi)的細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫染色，加入PBS溶液洗滌2次。將小室放在顯微鏡下并隨機(jī)選擇5個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)穿膜的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算平均值，為細(xì)胞遷移數(shù)目。

2.6.2 侵襲實(shí)驗(yàn) 按1∶9比例將基質(zhì)膠和D-hanks液混合，吸取20 μL上述溶液加入到Transwell小室的上室內(nèi)，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，待基質(zhì)膠凝固后，吸除殘留的液體。按“2.6.1”項(xiàng)下方法處理并計(jì)算細(xì)胞侵襲數(shù)目。

2.7 Western blotting檢測(cè)馬錢苷聯(lián)合miR-3619-5p對(duì)宮頸癌細(xì)胞cleaved Caspase-3和MMP-2蛋白表達(dá)的影響

對(duì)照組、馬錢苷＋miR-NC組、miR-NC組、組和馬錢苷＋組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，加入RIPA裂解液，于冰上裂解20 min，4 ℃、12 000×離心10 min，吸取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。蛋白樣品經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%牛血清白蛋白溶液，室溫封閉2 h。分別加入相應(yīng)抗體，4 ℃孵育過夜；加入二抗，室溫孵育2 h。加入ECL發(fā)光液顯影，采用Image J軟件分析條帶灰度值。

2.8 miR-3619-5p與MIEN1靶向關(guān)系預(yù)測(cè)和鑒定

利用生物信息學(xué)軟件Targetscan分析可能的靶基因，根據(jù)熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對(duì)靶向關(guān)系進(jìn)行鑒定。將含有MIEN1的3’-UTR端結(jié)合位點(diǎn)的WT熒光素酶報(bào)告載體和含有突變后的MIEN1的3’-UTR端結(jié)合位點(diǎn)的MUT熒光素酶報(bào)告載體分別和mimics、mimics control共轉(zhuǎn)染到宮頸癌SiHa細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h后，利用熒光素酶活性測(cè)定試劑盒對(duì)細(xì)胞熒光素酶活性進(jìn)行檢測(cè)分析。WT和MUT均由武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司構(gòu)建。收集對(duì)照組、miR-NC組、miR-3619-5p組細(xì)胞，利用Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞MIEN1蛋白表達(dá)。

2.9 MIEN1過表達(dá)載體的逆轉(zhuǎn)作用檢測(cè)

宮頸癌SiHa細(xì)胞分別共轉(zhuǎn)染mimics與陰性對(duì)照載體、mimics與MIEN1過表達(dá)載體，然后用含有100 μg/mL的馬錢苷處理24 h，記為馬錢苷＋＋Vector組和馬錢苷＋＋MIEN1組。按“2.4”項(xiàng)下方法檢測(cè)細(xì)胞存活率，按“2.5”項(xiàng)下方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡槍口，按“2.6”項(xiàng)下方法檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，按“2.7”項(xiàng)下方法檢測(cè)細(xì)胞cleaved Caspase-3、MMP-2和MIEN1蛋白表達(dá)情況。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 miR-3619-5p在宮頸癌細(xì)胞中相對(duì)低表達(dá)

如表1所示，宮頸癌SiHa、Hela、CasKi細(xì)胞mRNA表達(dá)水平明顯低于正常宮頸上皮Ect1/E6E7細(xì)胞（＜0.05），并且宮頸癌SiHa細(xì)胞中表達(dá)水平最低。

3.2 馬錢苷抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖

如表2所示，與對(duì)照組比較，馬錢苷（25、50、100、200 μg/mL）組SiHa細(xì)胞存活率顯著降低（＜0.05），100 μg/mL的馬錢苷處理后的細(xì)胞存活率接近50%，因此選擇100 μg/mL馬錢苷進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.3 miR-3619-5p mimics上調(diào)宮頸癌SiHa細(xì)胞中miR-3619-5p mRNA表達(dá)

如表3所示，組SiHa細(xì)胞mRNA表達(dá)水平顯著高于miR-NC組（＜0.05）。表明mimics上調(diào)宮頸癌SiHa細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平。

表1 宮頸癌SiHa、Hela、CasKi細(xì)胞和正常宮頸上皮Ect1/E6E7細(xì)胞中miR-3619-5pmRNA表達(dá)(, n = 9)

Table 1 miR-3619-5p mRNA expression in cervical cancer SiHa, Hela, CasKi cells and normal cervical epithelial Ect1/E6E7 cells(, n = 9)

細(xì)胞miR-3619-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量 Ect1/E6E71.00±0.11 SiHa0.35±0.04* Hela0.46±0.05* CasKi0.68±0.07*

與Ect1/E6E7組比較：*＜0.05

*< 0.05Ect1/E6E7 group

表2 馬錢苷對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖的影響(, n = 9)

Table 2 Effect of loganin on proliferation of cervical cancer SiHa cells(, n = 9)

組別質(zhì)量濃度/(μg·mL?1)存活率/% 對(duì)照—100.00±12.02 馬錢苷1093.25±8.15 2586.32±5.16* 5075.49±6.33* 10052.01±6.14* 20040.21±4.78*

與對(duì)照組比較：*＜0.05

*< 0.05control group

表3 miR-3619-5p mimics轉(zhuǎn)染后的宮頸癌SiHa細(xì)胞中miR-3619-5pmRNA表達(dá)(, n = 9)

Table 3 miR-3619-5p mRNA expression in cervical cancer SiHa cells transfected with miR-3619-5p mimics(, n = 9)

組別miR-3619-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量 對(duì)照1.00±0.11 miR-NC0.98±0.09 miR-3619-5p2.65±0.23*

與miR-NC組比較：*＜0.05

*< 0.05miR-NC group

3.4 馬錢苷聯(lián)合miR-3619-5p對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和cleaved Caspase-3和MMP-2蛋白表達(dá)的影響

如圖1、2和表4所示，與miR-NC組比較，組、馬錢苷＋miR-NC組和馬錢苷＋組宮頸癌SiHa細(xì)胞存活率顯著降低（＜0.05），細(xì)胞凋亡率升高（＜0.05），細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目增多（＜0.05），cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高（＜0.05），MMP-2蛋白表達(dá)水平下降（＜0.05）；與組和馬錢苷＋miR-NC組比較，馬錢苷＋組宮頸癌SiHa細(xì)胞存活率降低（＜0.05），細(xì)胞凋亡率升高（＜0.05），細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目增多（＜0.05），cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高（＜0.05），MMP-2蛋白表達(dá)水平下降（＜0.05）。

圖1 馬錢苷聯(lián)合miR-3619-5p對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡 (A)、遷移及侵襲 (B) 的影響

圖2 馬錢苷聯(lián)合miR-3619-5p對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞cleaved Caspase-3和MMP-2蛋白表達(dá)的影響

表4 馬錢苷聯(lián)合miR-3619-5p對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞存活率、凋亡率、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目及cleaved Caspase-3和MMP-2蛋白表達(dá)的影響(, n = 9)

Table 4 Effect of loganin combined with miR-3619-5p on survival rate, apoptosis rate, invasion number, migration number and cleaved Caspase-3 and MMP-2 protein expressions in cervical cancer SiHa cells(, n = 9)

組別劑量/(μg·mL?1)存活率/%凋亡率/%侵襲數(shù)目遷移數(shù)目cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量MMP-2蛋白表達(dá)量 對(duì)照—100.00±9.964.11±0.3093.96±9.94136.84±12.450.32±0.030.90±0.10 miR-NC—99.51±9.784.26±0.4396.23±8.76134.36±12.080.31±0.040.89±0.07 miR-3619-5p—63.23±5.58*19.68±1.74*69.20±5.14*100.16±10.53*0.45±0.05*0.65±0.06* 馬錢苷＋miR-NC10053.41±5.26*21.56±2.50*60.42±4.36*90.32±8.77*0.63±0.07*0.47±0.04* 馬錢苷＋miR-3619-5p10032.05±2.95*#&29.36±2.75*#&42.74±4.45*#&63.23±5.70*#&0.88±0.08*#&0.38±0.03*#&

與miR-NC組比較：*＜0.05；與組比較：#＜0.05；與馬錢苷＋miR-NC組比較：&＜0.05

*< 0.05miR-NC group;#< 0.05group;&< 0.05loganin + miR-NC group

3.5 miR-3619-5p靶向促進(jìn)MIEN1表達(dá)

生物信息學(xué)軟件分析和MIEN1的3’-UTR端結(jié)合位點(diǎn)見圖3；WT和mimics共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光素酶活性降低（表5）。如圖4和表6所示，組SiHa細(xì)胞MIEN1蛋白表達(dá)水平顯著低于miR-NC組（＜0.05）。

圖3 miR-3619-5p靶向調(diào)控MIEN1

表5 各組熒光素酶活性(, n = 9)

Table 5 Luciferase activity in each group (, n = 9)

組別WTMUT miR-NC1.00±0.081.00±0.09 miR-3619-5p0.43±0.05*0.98±0.13

與miR-NC組比較：*＜0.05

*< 0.05miR-NC group

圖4 Western blotting檢測(cè)MIEN1蛋白表達(dá)

表6 miR-3619-5p mimcis轉(zhuǎn)染后的宮頸癌SiHa細(xì)胞中MIEN1蛋白表達(dá)水平(, n = 9)

Table 6 MIEN1 protein expression level in cervical cancer SiHa cells transfected with miR-3619-5p mimcis (, n = 9)

組別MIEN1蛋白相對(duì)表達(dá)量 對(duì)照0.96±0.10 miR-NC0.95±0.11 miR-3619-5p0.53±0.04*

與miR-NC組比較：*＜0.05

*< 0.05miR-NC group

3.6 上調(diào)MIEN1對(duì)馬錢苷聯(lián)合miR-3619-5p調(diào)控宮頸癌SiHa細(xì)胞細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和cleaved Caspase-3、MMP-2和MIEN1蛋白表達(dá)的影響

如圖5和表7所示，與馬錢苷＋＋Vector組比較，馬錢苷＋＋MIEN1組SiHa細(xì)胞存活率明顯升高（＜0.05），細(xì)胞凋亡率降低（＜0.05），細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)目增加（＜0.05），細(xì)胞MMP-2、MIEN1蛋白表達(dá)水平升高（＜0.05），cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低（＜0.05）。

圖5 MIEN1對(duì)馬錢苷聯(lián)合miR-3619-5p影響宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡 (A)、遷移 (B)、侵襲 (C) 及cleaved Caspase-3、MMP-2和MIEN1蛋白表達(dá) (D) 的作用

表7 MIEN1過表達(dá)載體、mimics轉(zhuǎn)染后經(jīng)馬錢苷處理的宮頸癌SiHa細(xì)胞存活率、凋亡率、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目及cleaved Caspase-3、MMP-2和MIEN1蛋白表達(dá)水平(,= 9)

Table 7 Survival rate, apoptosis rate, invasion number, migration number and cleaved Caspase-3, MMP-2 and MIEN1 protein expression levels in cervical cancer SiHa cells transfected with MIEN1 overexpression vector andmimics and treated with loganin(,= 9)

組別劑量/(μg·mL?1)存活率/%凋亡率/%侵襲數(shù)目遷移數(shù)目cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量MMP-2蛋白表達(dá)量MIEN1蛋白表達(dá)量 馬錢苷＋miR-3619-5p100100.00±10.2527.86±2.1743.65±3.2660.95±6.320.89±0.090.36±0.040.45±0.04 馬錢苷＋miR-3619-5p＋MIEN1100169.32±14.15*14.02±1.36*68.62±5.17*88.77±6.38*0.40±0.05*0.76±0.06*0.99±0.12*

與馬錢苷＋組比較：*＜0.05

*< 0.05loganin +group

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)，馬錢苷對(duì)糖尿病、帕金森病等多種疾病均有改善作用[10-11]；馬錢苷能夠激活肝癌細(xì)胞中的凋亡通路[4]；馬錢苷抑制胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力[5]；馬錢苷可以降低結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力[12]。本研究結(jié)果顯示，馬錢苷能夠抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示馬錢苷具有抑制宮頸癌的作用。

細(xì)胞的遷移、侵襲以及凋亡發(fā)生是一個(gè)多基因、多步驟的復(fù)雜調(diào)控過程。腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲過程中，需要先將細(xì)胞外基質(zhì)降解[13]。MMPs是存在于人體組織中的基質(zhì)降解酶，包含多個(gè)成員，能夠?qū)⒓?xì)胞外基質(zhì)中的不同組分降解[14]。MMP-2是MMPs成員之一，其表達(dá)改變和腫瘤的轉(zhuǎn)移能力有關(guān)，MMP-2表達(dá)水平越高，細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)[15]。Caspase是細(xì)胞凋亡進(jìn)展中的凋亡相關(guān)蛋白家族，其蛋白成員只有被剪切后形成活化的Caspase才能激活細(xì)胞凋亡[16]。Caspase-3是位于Caspase凋亡反應(yīng)中的下游因子，在細(xì)胞凋亡中有執(zhí)行作用，Caspase-3活化形成cleaved Caspase-3，從而不可逆地激活細(xì)胞凋亡[17]。結(jié)果顯示，馬錢苷上調(diào)cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)，下調(diào)MMP-2蛋白表達(dá)，提示馬錢苷促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并抑制細(xì)胞侵襲、遷移，這與細(xì)胞凋亡、侵襲和遷移檢測(cè)結(jié)果一致。

宮頸癌的發(fā)生和其他腫瘤一樣，均受到基因的調(diào)節(jié)作用，這些基因通過復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)最終影響了腫瘤進(jìn)程[18]。研究顯示，miRNA作為一種沒有開放閱讀框的小分子RNA，具有十分廣泛的作用，在細(xì)胞生長、衰老、代謝等生理進(jìn)展中發(fā)揮功能[19]。miRNA在腫瘤中的作用引起人們的廣泛關(guān)注，腫瘤組織有著與正常組織不同的miRNA表達(dá)譜，差異表達(dá)的miRNA可能是腫瘤治療的靶點(diǎn)[20]。研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多種腫瘤中發(fā)揮抑制作用，其在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，可能是一個(gè)腫瘤抑制因子[8,21-22]。結(jié)果顯示，在宮頸癌細(xì)胞中低表達(dá)，并且上調(diào)可以降低宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，激活細(xì)胞凋亡途徑，提示在宮頸癌進(jìn)展中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，和馬錢苷聯(lián)合處理后的宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力進(jìn)一步被抑制，細(xì)胞凋亡水平更高，提示和馬錢苷聯(lián)合可能是未來宮頸癌治療的潛在途徑。

miRNA發(fā)揮作用和調(diào)控下游靶基因的表達(dá)有關(guān)，其能夠和靶mRNA的3’-UTR端互補(bǔ)結(jié)合，降低下游靶蛋白的表達(dá)[23]。miRNA能夠和多個(gè)靶基因作用，一個(gè)靶基因可以同時(shí)受到很多miRNA的靶向調(diào)節(jié)作用，因此，miRNA通過這個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)影響生理和病理進(jìn)程[24]。研究顯示，靶向促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞中MIEN1的表達(dá)。MIEN1是和腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的調(diào)節(jié)因子，已知MIEN1在宮頸癌中高表達(dá)，并且下調(diào)MIEN1抑制宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)MIEN1能夠逆轉(zhuǎn)馬錢苷聯(lián)合對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的作用，提示馬錢苷聯(lián)合靶向MIEN1影響宮頸癌生物學(xué)行為。

綜上，馬錢苷聯(lián)合具有抑制宮頸癌進(jìn)展的作用，其可以在體外抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲、增殖、遷移，激活細(xì)胞凋亡途徑，作用機(jī)制與靶向調(diào)控MIEN1有關(guān)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of loganin combined withtargeting MIEN1 on migration and apoptosis of cervical cancer SiHa cells

FENG Shuang-miao1, ZHANG Hua-lian1, YUAN You-hua2

1. Department of Production, Zhumadian Central Hospital, Zhumadian 463000, China 2. Department of Laboratory Medicine, Henan Provincial People’s Hospital, Zhengzhou 450000, China

To investigate the effect of loganin combined withtargeting migration and invasion enhancer 1 (MIEN1) on migration and apoptosis of cervical cancer SiHa cells.mRNA expression in cervical cancer SiHa, Hela, CasKi cells and normal cervical epithelial Ect1/E6E7 cells were detected by qRT-PCR. Cervical cancer SiHa cells were transfected withmimics to up-regulate the expression ofand treated with loganine. Cell proliferation was analyzed by CCK-8 method; Cell apoptosis was analyzed by flow cytometry; Migration and invasion abilities of cells were analyzed by Transwell chamber; Cleaved cystein-asparate protease-3 (cleaved Caspase-3) and matrix metalloprotease-2 (MMP-2) protein expressions were detected by Western blotting. Bioinformatics software was used to predict the target genes of, and luciferase reporter system was used to identify the targeting relationship between the two. Cervical cancer SiHa cells were co-transfected withmimics and MIEN1 overexpression vector to investigate the changes in cell proliferation, apoptosis, migration and invasion.mRNA expression level in cervical cancer SiHa, Hela and CasKi cells was lower than that in normal cervical epithelial Ect1/E6E7 cells (< 0.05), and miR-3619-5p expression level in cervical cancer SiHa cells was the lowest. After up-regulation of, given loganin or a combination of two treatments, cells proliferation, migration and invasion abilities were decreased (< 0.05), cell apoptosis was increased (< 0.05), cleaved Caspase-3 protein expression was increased (< 0.05), and MMP-2 protein expression was decreased (< 0.05). And combined treatment of two had a stronger effect on cells proliferation, apoptosis, invasion and migration.targeted MIEN1 expression. MIEN1 overexpression vector reversed the effects of loganin combined withon proliferation, apoptosis, migration and invasion of cervical cancer SiHa cells (< 0.05).Loganin combined withtargeting MIEN1 can inhibit the proliferation, migration and invasion of cervical cancer SiHa cells, and promote cell apoptosis.

loganin; cervical cancer; miR-3619-5p; migration and invasion enhancement factor 1; apoptosis; invasion

R285.5

A

0253 - 2670(2022)14 - 4409 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.14.020

2022-01-21

馮雙苗，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)閶D科腫瘤。E-mail: fsmiao0607@163.com

袁有華，本科，副主任技師，研究方向?yàn)槟[瘤細(xì)胞凋亡。E-mail: yuanyouhua1968@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]