曹麗瓏，裴 科*，劉 瑞，寧 燕，趙婷婷，于子涵，吳陳成，邵翔宇，張朔生，王穎莉，胡美變，蔡 皓

? 藥理與臨床 ?

基于“部位扣除”的黃芪溫?zé)嵝?yīng)導(dǎo)致“上火”反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)及機制研究

曹麗瓏1，裴 科1*，劉 瑞1，寧 燕2，趙婷婷1，于子涵1，吳陳成1，邵翔宇1，張朔生1，王穎莉1，胡美變1，蔡 皓3*

1. 山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西省現(xiàn)代中藥工程實驗室，山西 晉中 030619 2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥炮制研究中心，浙江 杭州 310053 3. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，國家教育部中藥炮制規(guī)范化及標準化工程研究中心，江蘇 南京 210023

探討黃芪溫?zé)嵝?yīng)引起“上火”反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)及機制。對黃芪水煎液中黃酮和皂苷部位進行分離，采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜對已分離部位進行成分鑒別；將SD大鼠隨機分為8組，分別給予蒸餾水及相應(yīng)藥物。以《中國藥典》規(guī)定的日服劑量的4倍進行ig給藥，連續(xù)30 d。觀察大鼠狀態(tài)，測定肛溫、攝食量、糞便量、糞便含水量和唾液量；測定炎癥因子、甲狀腺功能、腎上腺功能與能量代謝的相關(guān)指標；檢測各組肝臟中單磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，）、過氧化物酶體增殖激活受體輔助活化因子-1α（peroxisome proliferator-activated-recptor-γ coactivator-1α，）、核呼吸因子1（nuclear respiratory factor 1，）、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，）的mRNA和蛋白表達量。多糖、黃酮和皂苷部位的分離度良好，多糖質(zhì)量分數(shù)大于50%，皂苷、黃酮部位質(zhì)量分數(shù)均大于80%，共鑒別出21種黃酮類成分和6種皂苷類成分。給藥后與對照組相比，各組別大鼠體質(zhì)量無顯著差異；全成分組肛溫明顯升高（＜0.05）；全成分組、多糖組糞便含水量顯著降低（＜0.05、0.01），缺皂苷組糞便含水量顯著升高（＜0.001）；第28天唾液量多糖組、皂苷組、缺黃酮組顯著降低（＜0.001）；全成分組、多糖組、皂苷組和缺多糖組腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），多糖組白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平顯著升高（＜0.01），全成分組IL-1β水平顯著升高（＜0.05）；各組17-羥皮質(zhì)類固醇（17-hydroxycorticosteroid，17-OHCS）含量均有上調(diào)趨勢，其中全成分組、多糖組、皂苷組、缺多糖組和缺黃酮組有顯著性差異（＜0.05、0.01）；全成分組、缺皂苷組與缺黃酮組的Ca2+, Mg2+-ATP酶活力與Na+, K+-ATP酶活力升高，全成分組和多糖組琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）活力顯著增加（＜0.05、0.01）。各組對、、、的mRNA和蛋白表達水平均有上調(diào)趨勢，其中全成分組和多糖組的上調(diào)趨勢優(yōu)于其余各組。過量食用黃芪導(dǎo)致“上火”可能與多糖及皂苷部位引起的炎癥反應(yīng)、能量代謝增強有關(guān)，其機制與AMPK介導(dǎo)的PGC-1α/NFR1通路相關(guān)，其中多糖的影響較大。

黃芪；“上火”反應(yīng)；超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜；能量代謝；單磷酸腺苷活化蛋白激酶通路

“上火”是中醫(yī)學(xué)的一種俗稱，其基本病機為陰陽失調(diào)，陽勝則熱。中醫(yī)學(xué)認為“上火”是在機體受到“邪氣”侵襲后，引起機體出現(xiàn)一系列以“熱證”為表現(xiàn)的癥狀。咽喉腫痛、目赤干澀、牙齦發(fā)炎、口腔潰瘍、小便短赤、大便秘結(jié)等為“上火”的典型癥狀[1]。

黃芪為豆科植物蒙古黃芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪(Fisch.) Bge.的干燥根，其味甘，性溫，歸肺、脾經(jīng)。黃芪作為一種大宗藥材和人們經(jīng)常以各種方式食用的保健品，具有廣泛的應(yīng)用前景和藥理活性[2-3]，但長期過量食用黃芪產(chǎn)生的不良反應(yīng)少被討論。由于黃芪性溫?zé)?，過量進補黃芪可能會導(dǎo)致“上火”癥狀，且黃芪常用來構(gòu)建“上火”或?qū)崯釀游锬Ｐ蚚4]。由于“上火”缺乏客觀量化的診斷指標，因此應(yīng)用現(xiàn)代技術(shù)揭示“上火”的生物學(xué)標志及導(dǎo)致“上火”的物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要意義[5]。本研究在中醫(yī)對“上火”認識的基礎(chǔ)上，運用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)，開展對過量食用黃芪引發(fā)“上火”的機制研究，擬為黃芪保健品的開發(fā)提供參考依據(jù)。

中藥中化學(xué)成分復(fù)雜，同類的不同成分之間在體內(nèi)也可能存在相互轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，因此通過成分“敲除”的方法來進行功效的驗證難以達到理想的效果?；诖?，本研究以黃芪為例，進行了某個“部位”即某類成分的“扣除”，目的是排除“成分敲除”時結(jié)構(gòu)相近的成分在體內(nèi)轉(zhuǎn)化造成的影響，通過“部位扣除”并結(jié)合單個部位給藥進行黃芪溫?zé)嵝?yīng)引起“上火”的物質(zhì)基礎(chǔ)驗證。黃芪主要含有多糖類、皂苷類、黃酮類等成分[6]。本研究首先對黃芪水煎液進行了部位分離，運用醇沉法分離多糖。由于黃酮類成分含量相對較低，且黃酮部位和皂苷部位極性非常相近，加大了分離的難度[7]。本研究根據(jù)文獻報道的樹脂分離技術(shù)[8-9]，比較了2種方法對黃芪水煎液中黃酮類和皂苷類成分的富集和分離程度，建立了1種快速有效的部位分離方法，并且采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）對所分離的2個部位中化學(xué)成分進行鑒別。最后將分離所得各個部位ig給藥，從大鼠的一般狀態(tài)、炎癥、甲狀腺和腎上腺功能、能量代謝和單磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）通路等方面進行指標檢測，為揭示黃芪導(dǎo)致“上火”的物質(zhì)基礎(chǔ)和通路機制提供參考。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量（150±10）g，4周齡，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證編號SCXK（京）2019-0010，合格證號No.110324210103867371。環(huán)境溫度保持在（23±2）℃，相對濕度保持在40%～70%。動物實驗經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準（批準號AWE202103001）。

1.2 藥材

黃芪藥材（批號200802）購自山西維康堂中藥飲片有限公司，經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院山西省現(xiàn)代中藥工程實驗室張朔生教授鑒定為豆科植物蒙古黃芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao的干燥根。

1.3 藥品與試劑

對照品黃芪甲苷（批號ST00160120，質(zhì)量分數(shù)98%）、芒柄花苷（批號ST08800120，質(zhì)量分數(shù)98%）、芒柄花素（批號ST00260120，質(zhì)量分數(shù)98%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號ST08820120，質(zhì)量分數(shù)98%）均購自上海詩丹德標準服務(wù)技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號202108）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（批號202108）、IL-6 ELISA試劑盒（批號202108）、三碘甲腺原氨酸（triiodothyronine，T3）ELISA試劑盒（批號202108）、四碘甲狀腺原氨酸（tetraiodothyronine，T4）ELISA試劑盒（批號202108）、大鼠血清促甲狀腺素（thyroid stimulating hormone，TSH）ELISA試劑盒、大鼠血清促甲狀腺激素釋放激素（thyrotropin-releasing hormone，TRH）ELISA試劑盒（批號202108）、17-羥皮質(zhì)類固醇（17-hydroxycorticosteroid，17-OHCS）ELISA試劑盒（批號202108）均購自上海泛柯實業(yè)有限公司；超微量Na+, K+-三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶測試盒（批號20210830）、超微量Ca2+, Mg2+-ATP酶測試盒（批號20210830）、糖原測定試劑盒（批號20210827）、丙酮酸測試盒（批號20210826）、琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）試劑盒（批號20210830）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒（批號20210827）均購自南京建成生物工程研究所；AMPK抗體（批號ab32047）、磷酸化AMPK（phosphorylated AMPK，p-AMPK）抗體（批號ab133448）、過氧化物酶體增殖激活受體輔助活化因子-1α（peroxisome proliferator-activated-recptor-γ coactivator-1α，PGC-1α）抗體（批號ab188102）、核呼吸因子1（nuclear respiratory factor 1，NRF1）抗體（批號ab175932）、β-actin抗體（批號ab8227）均購自英國Abcam公司；線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）抗體（批號8076）購自美國CST公司；HRP標記的羊抗兔二抗（批號A0208）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；乙腈、甲醇均為質(zhì)譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.4 儀器

UltiMate 3000型超高效液相色譜儀和Q-Exactive型四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；SpectraMax 190型全波長酶標儀（美國Molecular Devices公司）；RIGOL Ultra-3660型紫外分光光度計（北京普源科技有限公司）；ABI-7300型qRT-PCR儀（美國ABI公司）；TG-16M型低溫冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；Mini Protean 3 Cell電泳儀、TE77XP型電轉(zhuǎn)儀（美國Bio-Rad公司）；Tanon 5200型發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；EX225D型十萬分之一電子天平［奧豪斯儀器（上海）有限公司］；HC-2518型高速離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；XW-80A型旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；KQ2200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法

2.1 部位拆分工藝研究

2.1.1 黃芪提取液的制備 稱取黃芪藥材50 g，加8倍量水煎煮，4層紗布濾過，濾渣加6倍量水煎煮，合并2次濾液。減壓濃縮至生藥質(zhì)量濃度為0.5 g/mL，用于2種方法的分離效果比較。稱取一定量黃芪藥材，按照比較所得的最優(yōu)方法進行提取分離制得各個部位，用于ig給藥。

2.1.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取黃芪甲苷、芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量于10 mL量瓶中，加質(zhì)譜級甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為0.26、0.22、0.23、0.18 mg/mL的儲備液，將各儲備液稀釋100倍后經(jīng)13 000 r/min離心15 min，取上清液，即得對照品溶液。

2.1.3 色譜條件 Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱，流動相為乙腈（A）-0.05%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～0.5 min，5% A；0.5～1.5 min，5%～15% A；1.5～4.5 min，15%～30% A；4.5～7.0 min，30%～60% A；7.0～11.0 min，60%～70% A；11.0～12.0 min，70%～100% A；12.0～13.0 min，100% A；13.0～13.5 min，100%～5% A；13.5～16.0 min，5% A；體積流量為0.3 mL/min；進樣量為1 μL；柱溫為40 ℃。

2.1.4 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），正、負離子同時采集。正離子模式下噴霧電壓3.2 kV，鞘氣流速為40 arb，輔助氣流速為5 arb，輔助氣加熱溫度350 ℃；負離子模式下噴霧電壓2.5 kV，鞘氣流速為38 arb，輔助氣流速為10 arb，輔助氣加熱溫度300 ℃。毛細管溫度320 ℃，高壓環(huán)形離子導(dǎo)入裝置電壓（S-Lens RF Level）為50。檢測模式采用全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級掃描（Full MS/dd-MS2），掃描范圍為/100～1000，一級質(zhì)量分辨率為70 000 FWHM，二級分辨率17 500 FWHM，碰撞能量為30 eV。

2.1.5 樹脂的篩選與部位的拆分 首先通過醇沉得到多糖。將提取液減壓濃縮后加入乙醇，依據(jù)參考文獻方法[10-11]及后續(xù)分離實驗中多糖、黃酮和皂苷的含量比較，最終調(diào)節(jié)乙醇體積分數(shù)至70%，于4 ℃靜置12 h，分離上清液備用，沉淀恒溫干燥后待測。比較聚酰胺樹脂結(jié)合D101樹脂法（方法1）和D101大孔樹脂結(jié)合溶劑萃取法（方法2）對成分富集和分離的效果。

（1）方法1：將上清液采用聚酰胺樹脂進行上樣，上樣后依次采用5倍和2倍柱體積的蒸餾水和5%乙醇進行洗脫，收集洗脫液備用（用于D101樹脂上樣），之后采用5倍柱體積的80%乙醇進行洗脫，收集洗脫液，濃縮干燥后得粉末，作為聚酰胺樹脂的黃酮富集部位，即黃酮部位A。將備用洗脫液濃縮后采用D101樹脂上樣，上樣后先用4倍柱體積蒸餾水進行除雜，繼以80%乙醇進行洗脫，收集洗脫液，濃縮干燥后得到皂苷部位A。

（2）方法2：將上清液經(jīng)D101大孔樹脂上樣后，依次用10倍柱體積蒸餾水洗脫糖類成分，再以5倍柱體積0.1% NaOH洗脫，繼以5倍柱體積20%乙醇除色素，最后以5倍柱體積80%乙醇洗脫，收集洗脫液，經(jīng)濃縮干燥后得粉末，作為大孔樹脂的富集部位。精密稱定100 mg該富集部位的粉末，蒸餾水溶解，按照體積比1∶5分別用醋酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液濃縮蒸干后，分別得到黃酮部位B和皂苷部位B。

2.2 黃芪各部位純度的測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱定干燥至恒定質(zhì)量的葡萄糖對照品適量，置于10 mL量瓶中，用蒸餾水溶解并稀釋至刻度，定容，得質(zhì)量濃度為0.115 mg/mL的葡萄糖對照品溶液。

精密稱定干燥至恒定質(zhì)量的黃芪甲苷對照品適量，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，定容，得質(zhì)量濃度為0.70 mg/mL的黃芪甲苷對照品溶液。

精密稱定干燥至恒定質(zhì)量的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，定容，得質(zhì)量濃度為0.14 mg/mL的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液。

2.2.2 標準曲線的制備 精密量取葡萄糖對照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于刻度試管中，每管加入蒸餾水使其體積成為1 mL，滴加濃硫酸5 mL和5%苯酚溶液1 mL，充分振蕩搖勻，待冷卻至室溫后于490 nm處測定吸光度（），以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（），為縱坐標（），繪制標準曲線。

精密量取黃芪甲苷對照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別置于具塞玻璃試管中，水浴蒸干溶劑，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸溶液，搖勻，置60 ℃水浴加熱20 min，取出立即至冰水浴中冷卻，加入5 mL冰醋酸溶液。以相應(yīng)試劑空白隨行測定，在560 nm處進行測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（），為縱坐標（），繪制標準曲線。

精密量取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，置于10 mL量瓶中，以甲醇為空白，在260 nm處進行測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（），為縱坐標（），繪制標準曲線。

2.2.3 總多糖、總皂苷和總黃酮的含量測定 稱取“2.1.5”項下得到的多糖部位、黃酮部位A、皂苷部位A、黃酮部位B、皂苷部位B粉末適量，精密稱定，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度。分別按照“2.2.2”項下的方法，測定總多糖、總皂苷、總黃酮的質(zhì)量濃度，并計算含量。

含量＝濃度×稀釋倍數(shù)/稱樣量

2.2.4 總黃酮部位和總皂苷部位成分的鑒別 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫以及CNKI、PubMed等網(wǎng)站查詢國內(nèi)外文獻，根據(jù)XCalibur 4.0軟件的精確相對分子質(zhì)量、保留時間（R）、準分子離子峰及二級碎片離子信息進行鑒定，實際測得的相對分子質(zhì)量與理論相對分子質(zhì)量偏差應(yīng)小于5×10?6。

按照上述最優(yōu)方法拆分得到的黃酮部位和皂苷部位，稱各部位取粉末適量，精密稱定，置于10 mL量瓶中，用質(zhì)譜級甲醇溶解并定容，得到質(zhì)量濃度分別為2.86、2.31 mg/mL的總黃酮和總皂苷樣品儲備液，將儲備液各稀釋100倍后于13 000 r/min離心15 min，取上清液于進樣小瓶中按照“2.1.3”和“2.1.4”項下方法進行測定。

2.3 動物實驗

2.3.1 動物分組及給藥 大鼠隨機分為8組，每組12只。分別為對照組、黃芪水煎液全成分組、黃芪多糖組、黃芪皂苷組、黃芪黃酮組、缺多糖組、缺皂苷組和缺黃酮組。各組大鼠自由飲水及進食。黃芪水煎液全成分組按照《中國藥典》2020年版規(guī)定的成人日服最高劑量的4倍量進行給藥（即生藥量為120 g/70 kg）；黃芪水煎液全成分組按照“2.1.1”項中的方法提取，減壓濃縮至生藥質(zhì)量濃度為1 g/mL。按照等效劑量系數(shù)折算，給藥劑量如下：黃芪水煎液全成分組為按照黃芪生藥量計算得10.8 g/(kg·d)，黃芪多糖組為按照黃芪多糖獲得量和得率計算得1.08 g/(kg·d)，黃芪皂苷組為按照黃芪總皂苷量獲得量和得率計算得0.11 g/(kg·d)，黃芪黃酮組按照黃芪總黃酮量獲得量和得率計算得0.05 g/(kg·d)，缺多糖組（黃芪皂苷＋黃芪黃酮）給予黃芪黃酮與黃芪皂苷共0.16 g/(kg·d)，以此類推，缺皂苷組給予黃芪黃酮與黃芪多糖共1.13 g/(kg·d)，缺黃酮組給予黃芪皂苷與黃芪多糖共1.19 g/(kg·d)。各組ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對照組給予等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)30 d。

2.3.2 指標測定 給藥期間，每日觀察大鼠精神狀態(tài)、進食飲水、毛色、大便等一般狀態(tài)。定時記錄大鼠攝食量。給藥1 h后測定肛溫，記錄給藥第14天與給藥第28天的肛溫情況。給藥1 h后測定大鼠的唾液量，將已稱定質(zhì)量的干棉球放入大鼠口腔內(nèi)計時3 min后取出并稱定質(zhì)量，記錄大鼠唾液量情況，每周測定1次，連續(xù)3周（分別于第14、21、28天）。末次給藥后，更換墊料并收集糞便，記錄24 h各組大鼠的糞便量并測定糞便含水量。給藥結(jié)束后，大鼠ip 2%戊巴比妥鈉（2 mL/kg）麻醉后腹主動脈取血，3000 r/min離心10 min后，收集上清，分裝后于?80 ℃凍存。分離肝臟，分裝后于液氮速凍。按照ELISA試劑盒說明書測定血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、T3、T4、TSH、TRH和17-OHCS水平。按照試劑盒說明書測定肝組織中Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶、SDH、LDH活性以及糖原、丙酮酸含量。

2.3.3 黃芪各給藥組對大鼠肝組織、、和mRNA表達的影響 提取各組肝組織的總RNA，合成DNA并進行qRT-PCR分析。引物序列：上游引物5’-GTGGCTTATCA- TCTCATCATTG-3’，下游引物5’-ATTTGGGCTT- AGTTGTGTTG-3’，引物長度217 bp；上游引物5’-GGGCACATCTGTTCTTCC-3’，下游引物5’-TCCCGTAGTTCACTGGTC-3’，引物長度197 bp；上游引物5’-AGACGACGCAAGCATC- AGAGG-3’，下游引物5’-GCGGCAGCTTCACTGT- TAAGG-3’，引物長度124 bp；上游引物5’-GGGATTGGGCACAAGAAG-3’，下游引物5’-GCATTCAGTGGGCAGAAG-3’，引物長度127 bp；上游引物5’-CGGTCAGGTCATCACTATC-3’，下游引物5’-CAGGGCAGTAATCTCCTTC-3’，引物長度229 bp。

2.3.4 黃芪各給藥組對大鼠肝組織AMPK、PGC-1α、NRF1和TFAM蛋白表達的影響 將各組肝組織剪成細小的碎片，按20 mg組織加入150～250 μL裂解液提取蛋白，并用BCA法進行蛋白濃度測定。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉，室溫封閉1 h，分別加入AMPK、PGC-1α、NRF1、TFAM和β-actin抗體，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌3次，每次5 min；按照1∶1000稀釋HRP標記的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌后，加入ECL發(fā)光液，將其放入成像系統(tǒng)中進行掃描。

3 結(jié)果

3.1 拆分工藝研究

3.1.1 色譜條件 按“2.1.3”及“2.1.4”項下的色譜條件和質(zhì)譜條件經(jīng)UHPLC-Q-Orbitrap HRMS進行測定，對照品黃芪甲苷、芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的色譜圖見圖1，R分別為8.05、6.68、8.17、5.05 min。

3.1.2 2種方法的拆分效果比較 精密稱取“2.1.5”項下2種方法富集的部位各3 mg，對黃酮部位A、B和皂苷部位A、B中主要的黃酮類和皂苷類化合物進行尋找和鑒別，并對峰面積進行比較，對2個部位的分離程度進行可視化分析，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，方法1黃酮類成分和皂苷類成分有交叉，皂苷部位A未得到有效富集，依舊留在黃酮部位A，分離效果較差。方法2各部位相應(yīng)成分含量差異較大，黃酮和皂苷分離結(jié)果較好。因此后續(xù)純度測定，以及部位成分分析均選擇方法2所得到的黃酮部位和皂苷部位。

3.1.3 總黃酮部位和總皂苷部位的純度測定 葡萄糖、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的標準曲線的見圖3。標準曲線的回歸方程、相關(guān)系數(shù)（2）分別為＝0.082 7－0.038 6、2＝0.999 2，＝0.011 8＋0.114 6、2＝0.999 2，＝0.055 9＋0.105 3、2＝0.999 4。

經(jīng)計算得總多糖質(zhì)量濃度為7.371 0 μg/mL，質(zhì)量分數(shù)為51%；總皂苷質(zhì)量濃度為4.083 6 μg/mL，質(zhì)量分數(shù)為83%；總黃酮質(zhì)量濃度為3.985 2 μg/mL，質(zhì)量分數(shù)為81%。該提取純化工藝操作簡單、易行，大孔樹脂具有選擇性好、性能穩(wěn)定、可循環(huán)利用的優(yōu)勢，可為黃芪部位的富集純化提供依據(jù)。

3.2 成分鑒別

分離得到的黃酮部位與皂苷部位的總離子流圖見圖4。

3.2.1 黃酮類成分鑒別 通過XCalibur軟件對黃酮部位進行分析鑒別，結(jié)果見表1（F1～F21）。通過與對照品R及二級碎片對比，成分F4～F6分別被鑒定為芒柄花苷、芒柄花素和毛蕊異黃酮葡萄糖苷。以部分黃酮類化合物為代表說明化合物的裂解規(guī)律，黃酮類化合物是常見的發(fā)生Rretro-Diels-Alder（RDA裂解）的一類化合物。芒柄花苷的二級碎片檢測到有主要碎片離子峰/269、253。根據(jù)裂解規(guī)律能夠推測出，芒柄花苷失去1分子葡萄糖（/162）形成了芒柄花素（/269），苷元通過脫羥基產(chǎn)生了/253的碎片離子[14]。成分F6的二級碎片離子/270、253比母離子少15和32，推測是由母離子失去1個CH3和CH3OH形成。

表1 黃芪黃酮和皂苷的UHPLC-MS/MS分析結(jié)果

Table 1 UHPLC-MS/MS analysis of flavonoids and saponins in Astragali Radix

編號tR/min化合物m/z誤差/(×10?6)碎片離子m/z (R.A.%)分子式離子模式 理論值實際值 F113.81鼠李檸檬素-3-O-β-D-葡萄糖苷[12]463.123 5463.123 1?0.86463.123 2, 230.987 1 (12.16), 301.141 3 (100)C22H22O11[M＋H]+ F27.127,2′-二羥基-3′,4′-二甲氧基異黃烷[13-15]303.122 7303.122 90.66302.690 9, 149.023 5(4.63),123.044 3 (100)C17H18O5[M＋H]+ F35.11毛蕊異黃酮[13-15]285.075 8285.075 90.35253.144 8 (3.33), 269.080 8 (13.89), 285.075 7 (100)C16H12O5[M＋H]+ F46.67芒柄花苷#[13-15]431.133 7431.134 00.70431.134 2, 269.080 8 (100)C22H22O9[M＋H]+ F58.18芒柄花素#[13-15]269.080 8269.080 90.37253.144 8 (2.35), 213.014 6 (2.38), 269.080 8 (100)C16H12O4[M＋H]+ F65.05毛蕊異黃酮葡萄糖苷#[13-15]447.128 6447.129 00.89447.128 8, 270.052 6 (1.41), 285.075 7 (100)C22H22O10[M＋H]+ F77.12黃芪異黃烷苷[16]463.161 0463.161 00.00463.161 0, 286.085 0 (17.26), 301.108 3 (100)C23H28O10[M－H]? F85.88鼠李檸檬素[17]301.070 7301.070 4?1.00301.105 7 (5.09), 167.070 5 (100)C16H12O6[M＋H]+ F913.83afromosin[17]299.091 4299.091 81.34263.147 8 (17.56), 299.056 0 (100)C17H14O5[M＋H]+ F107.005,7-dimethoxy-4′-hydroxyflavanone[17]299.092 5299.092 50.00213.962 7 (1.45), 299.056 3 (41.46)C17H16O5[M－H]? F119.85槲皮素[16]303.049 9303.048 9?3.30303.122 7C15H10O7[M＋H]+ F127.56黃芩素[16]269.045 5269.045 70.74223.069 8 (14.05), 251.191 8 (78.64), 269.080 7 (100)C15H10O5[M－H]? F137.12鷹嘴豆牙素A[17]283.061 2283.061 30.35269.041 2 (18.39), 283.061 3 (31.91)C16H12O5[M－H]? F147.78華良姜素[17]315.086 3315.085 9?1.27315.087 8, 313.238 6 (91.72), 300.107 1 (1000)C17H14O6[M＋H]+ F1511.85山柰酚[16-17]331.045 9331.048 99.06331.048 8, 301.107 1 (100)C15H10O6[M＋HCOO]? F1615.25山柰酚-3-O-葡萄糖苷[16-17]449.107 8449.107 4?0.89449.276 0, 287.161 4 (100)C21H20O11[M＋H]+ F170.87染料木苷[14-16]433.112 9433.113 61.62433.122 9, 253.144 7 (8.02), 217.066 3 (100)C21H20O10[M＋H]+ F1812.53異鼠李素[15-17]317.065 6317.065 70.32317.065 2, 299.041 3 (0.43)C16H12O7[M－H]? F198.98異甘草素[16]257.080 8257.080 90.39257.080 6, 211.154 2 (100)C15H12O4[M＋H]+ F208.52紅車軸草素[16-17]301.070 7301.070 2?1.66301.070 6, 269.080 6 (2.82)C16H12O6[M＋H]+ F217.32美迪紫檀素[17]271.096 5271.096 81.11271.096 5, 150.885 5 (100)C16H14O4[M＋H]+ S19.01黃芪甲苷I[17]913.480 2913.482 42.41807.449 6 (0.93)C45H72O16[M＋HCOO]? S28.37黃芪甲苷II[18]871.469 7871.468 6?1.26677.499 8 (3.46)C43H70O15[M＋HCOO]? S38.04黃芪甲苷#[18-20]829.459 1829.460 31.45829.459 8, 699.435 5 (11.70), 782.568 3 (96.22)C41H68O14[M＋HCOO]? S47.34黃芪甲苷Ⅶ[18]991.511 9991.510 9?1.01991.413 2, 945.116 7 (46.78)C47H78O19[M＋HCOO]? S55.71大豆皂苷I[19]987.517 0987.519 52.53986.507 8, 204.669 7 (20.11)C48H78O18[M＋HCOO]? S614.82環(huán)黃芪醇[20]491.373 1491.373 10.00491.120 0, 143.103 0 (2.08)C30H50O5[M＋H]+

#代表通過對照品鑒定；R.A.%代表離子的相對強度

#stands for identification by reference; R.A.% stands for the relative abundance of ion

3.2.2 皂苷類成分鑒別 通過XCalibur軟件對皂苷部位進行分析鑒別，結(jié)果見表1（S1～S6）。通過與對照品R及二級碎片比較，成分S3被鑒定為黃芪甲苷。根據(jù)文獻報道[17-20]，S1～S6分別被鑒定為黃芪甲苷I、黃芪甲苷II、黃芪甲苷、黃芪甲苷Ⅶ、大豆皂苷I和環(huán)黃芪醇。

3.3 黃芪各給藥組對大鼠一般狀態(tài)的影響

3.3.1 對大鼠體質(zhì)量的影響 如表2所示，在給藥過程中，各組大鼠體質(zhì)量均逐漸升高，而與對照組相比，各組大鼠體質(zhì)量無顯著性差異。說明各給藥組對大鼠體質(zhì)量的增長影響較小。

3.3.2 對大鼠肛溫的影響 如表3所示，與對照組相比，給藥第14、28天各給藥組大鼠肛溫均有所升高，其中全成分組大鼠肛溫升高有顯著性差異（＜0.05、0.01），可以體現(xiàn)黃芪的溫?zé)嵝?yīng)，全成分組溫?zé)嵝?yīng)最強。分別“扣除”各個部位后，只有缺多糖組在第14天肛溫升高有顯著差異（＜0.05），而這種顯著性在第28天測定時又消失，其余均無顯著性差異，說明對于體溫的升高，不是某個部位的單獨作用，而是黃芪3個部位以及其余成分的綜合作用，符合中醫(yī)理論的整體觀念。

給藥第14天，與對照組相比，缺皂苷組與缺黃酮組大鼠唾液量顯著升高（＜0.01、0.001）；給藥第21天，與對照組相比，全成分組、缺多糖組與缺黃酮大鼠唾液量顯著降低（＜0.001），黃酮組與缺皂苷組大鼠唾液量顯著升高（＜0.05）。給藥第28天，與對照組相比，多糖組、皂苷組與缺黃酮組大鼠唾液量顯著降低（＜0.001）。全成分組在第21、28天唾液量均減少，可能為“上火”癥狀的體現(xiàn)。多糖組、皂苷組在第28天唾液量顯著降低，而缺多糖組、缺皂苷組唾液量并沒有降低，黃酮組唾液量沒有顯著降低，而缺黃酮組即多糖和皂苷配伍組唾液量顯著降低，說明長時間大劑量服用黃芪導(dǎo)致唾液量減少的“上火”癥狀來源于黃芪組分中的多糖部位和皂苷部位。

表2 黃芪及各組分對大鼠體質(zhì)量的影響(, n = 12)

Table 2 Effect of Astragali Radix and its fractions on body weight in rats(, n = 12)

組別劑量/(g·kg?1)體質(zhì)量/g 第1天第7天第14天第21天第28天 對照—151.58±3.90227.67±12.41271.58±15.03319.42±25.63339.25±34.56 全成分10.80153.08±5.32219.56±12.97266.73±22.70305.75±27.75332.13±28.47 多糖1.08146.58±5.62218.43±14.52272.20±16.99313.27±30.25343.00±36.40 皂苷0.11150.71±7.48226.86±14.19276.18±18.81317.50±23.12352.38±27.12 黃酮0.05148.42±4.96229.49±8.53281.13±8.82330.50±16.87356.42±17.67 缺多糖0.16150.67±6.91227.16±13.64282.50±27.84320.08±31.76352.00±33.78 缺皂苷1.13149.25±6.69222.85±15.04274.00±19.46322.08±25.20342.92±29.04 缺黃酮1.19148.00±7.66224.54±12.07269.92±19.65306.42±20.14333.33±24.17

表3 黃芪及各組分對大鼠肛溫和唾液量的影響(, n = 12)

Table 3 Effect of Astragali Radix and its fractions on rectal temperature and saliva volume in rats(, n = 12)

組別劑量/(g·kg?1)肛溫/℃唾液量/mg 第14天第28天第14天第21天第28天 對照—37.49±0.5236.93±0.457.39±5.0210.27±3.3814.42±6.48 全成分10.8037.88±0.21*37.39±0.33**7.72±6.614.25±2.51***10.28±7.13 多糖1.0837.83±0.4237.24±0.507.41±3.5120.34±20.533.18±2.05*** 皂苷0.1137.72±0.3437.07±0.406.87±5.678.41±6.375.05±3.84*** 黃酮0.0537.79±0.3336.97±0.447.36±5.1815.93±6.47*14.08±7.78 缺多糖0.1637.95±0.45*37.21±0.328.03±8.463.35±3.38***11.95±4.54 缺皂苷1.1337.81±0.4137.23±0.2522.22±7.26***15.13±4.99*12.94±3.38 缺黃酮1.1937.79±0.1937.17±0.2444.88±40.27**4.47±3.43***4.41±2.83***

與對照組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001，下表同

*< 0.05**< 0.01***< 0.001control group, same as below table

3.3.3 對大鼠攝食量、糞便量及糞便含水量的影響 如表4所示，給藥第14天，與對照組相比，多糖組大鼠攝食量顯著減少（＜0.05），黃酮組大鼠攝食量顯著升高（＜0.001）；給藥第21天，與對照組相比，缺皂苷組和缺黃酮組大鼠攝食量顯著降低（＜0.01、0.001）；給藥第28天，與對照組相比，缺黃酮組大鼠攝食量顯著減少（＜0.001）。

與對照組相比，除全成分組大鼠糞便量有所減少外，其余組別大鼠糞便量均升高，其中黃酮組具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）。對于糞便含水量而言，與對照組相比，全成分組與多糖組大鼠糞便含水量顯著降低（＜0.05、0.01），缺皂苷組大鼠糞便含水量顯著升高（＜0.001）。

聯(lián)合攝食量和糞便量可知，黃酮組糞便量顯著增加的原因可能為攝食量的增加，而全成分組以及多糖組糞便含水量顯著降低則可能為“上火”癥狀的體現(xiàn)。結(jié)合全成分組、多糖組以及缺多糖組的糞便含水量，說明對于糞便量干燥的“上火癥狀”可能主要源于多糖類組分。

3.4 黃芪各給藥組對大鼠血清炎癥因子的影響

如圖5所示，與對照組相比，全成分組、多糖組、皂苷組大鼠血清中TNF-α水平顯著升高（＜0.05、0.001），缺皂苷組大鼠血清中TNF-α水平?jīng)]有升高，而缺多糖組依然顯著性升高（＜0.01），說明黃芪全成分升高TNF-α的作用可能來自于皂苷部位、多糖部位，且皂苷部位的影響可能較大。此外，與對照組相比，全成分組血清中IL-1β水平顯著升高（＜0.05），多糖組IL-6表達水平顯著升高（＜0.01）。表明過量食用黃芪時，其多糖和皂苷可能通過升高促炎因子水平誘發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致“上火”癥狀。

表4 黃芪及各組分對大鼠攝食量、糞便量及糞便含水量的影響(, n = 12)

Table 4 Effect of Astragali Radix and its fractions on food intake, fecal output and feces moisture in rats(, n = 12)

組別劑量/(g·kg?1)攝食量/g24 h糞便量/g糞便含水量/g 第14天第21天第28天 對照—130.73±2.60117.85±0.75127.17±3.066.53±1.482.85±1.18 全成分10.80128.48±3.75108.29±33.13119.25±13.326.28±1.411.03±1.43** 多糖1.08118.33±20.03*127.17±30.41124.85±30.207.28±2.620.92±2.67* 皂苷0.11134.20±8.06127.55±26.80127.12±2.007.22±2.403.62±1.01 黃酮0.05138.33±3.11***120.08±11.86131.92±8.607.90±0.28**3.45±2.44 缺多糖0.16132.23±3.10113.28±7.51126.42±11.437.18±8.633.59±3.12 缺皂苷1.13131.83±0.8299.42±17.44**127.67±9.198.73±6.154.91±1.32*** 缺黃酮1.19128.82±1.49101.22±4.71***115.46±3.41***6.68±3.181.99±3.47

3.5 黃芪各給藥組對大鼠血清甲狀腺功能的影響

如圖6所示，與對照組相比，多糖組、皂苷組和黃酮組大鼠血清中T3水平顯著降低（＜0.05），缺黃酮組大鼠T4水平顯著升高（＜0.05），各組大鼠TRH水平無顯著差異，黃酮組大鼠TSH水平顯著降低（＜0.05）。說明黃芪的溫?zé)嵝?yīng)可能不是通過促進甲狀腺功能產(chǎn)生。

3.6 黃芪各給藥組對大鼠腎上腺功能的影響

如圖7所示，與對照組相比，全成分組、多糖組、皂苷組、缺多糖組和缺黃酮組大鼠血清中17-OHCS水平均顯著升高（＜0.05、0.01），而黃酮組沒有升高，說明黃芪溫?zé)嵝?yīng)可能還來自于多糖、皂苷部位對腎上腺功能的促進。

3.7 黃芪各給藥組對大鼠能量代謝的影響

如圖8所示，與對照組相比，全成分組、多糖組、皂苷組、缺皂苷組、缺黃酮組大鼠肝組織中Na+, K+-ATP酶活力都有升高的趨勢，其中全成分組和缺黃酮組有顯著性差異（＜0.05）。與對照組相比，全成分組、缺皂苷組、缺黃酮組Ca2+, Mg2+-ATP酶活力都有升高的趨勢，其中全成分組和缺皂苷組有顯著性差異（＜0.05、0.001）。Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶活力增加，耗能和產(chǎn)熱增加，說明全成分組可以增加機體產(chǎn)熱，而多糖與黃酮或皂苷部位配伍之后對產(chǎn)熱影響較大。

圖7 黃芪及各組分對大鼠血清中17-OHCS水平的影響(, n = 8)

丙酮酸可氧化脫羧生成乙酰輔酶A，然后進入三羧酸循環(huán)，最終完全被氧化成CO2、H2O和大量的ATP。與對照組相比，多糖組、皂苷組以及缺皂苷組、缺黃酮組丙酮酸含量有增加的趨勢，但無顯著性差異。與對照組相比，全成分組、多糖組、缺多糖組和缺黃酮組SDH活力有所升高，其中全成分組和多糖組有顯著差異（＜0.05、0.01），而黃酮組SDH活力顯著降低（＜0.05）。說明全成分組、多糖組可促進三羧酸循環(huán)加速，促進ATP的生成增加。與對照組相比，皂苷組肝組織LDH活力顯著降低（＜0.05），其余各組無顯著性差異，說明皂苷組可以降低機體無氧代謝的水平。與對照組相比，全成分組、多糖組、黃酮組、缺皂苷組以及缺黃酮組肝糖原含量都有上升的趨勢，其中缺皂苷組與缺黃酮組有顯著差異（＜0.01、0.001），說明含有多糖的配伍組會增加機體的儲能。

圖8 黃芪各給藥組對大鼠肝組織中Na+, K+-ATP酶活力、Ca2+, Mg2+-ATP酶活力、丙酮酸含量、SDH活力、LDH活力和肝糖原含量的影響(, n = 8)

3.8 黃芪各給藥組對AMPK介導(dǎo)的PGC-1α/NFR1通路的影響

如圖9所示，與對照組相比，全成分組、多糖組均可上調(diào)大鼠肝組織mRNA表達水平，其中全成分組有顯著性差異（＜0.05）；全成分組、多糖組均可顯著性增加、和mRNA表達水平（＜0.05、0.01）；此外，缺多糖組可顯著上調(diào)mRNA表達水平（＜0.05），缺皂苷組和缺黃酮組可顯著上調(diào)mRNA表達水平（＜0.01、0.001）。

如圖10所示，與對照組相比，各組均可顯著上調(diào)p-AMPK、PGC-1α和TFAM蛋白表達水平（＜0.05、0.01、0.001），各組均上調(diào)NRF1蛋白表達水平，其中全成分組、多糖組和缺多糖組有顯著性差異（＜0.05、0.01）。因此，黃芪全成分組可以促進AMPK功能活化，并作用于下游PGC-1α、NRF1等因子，從圖中可以看出多糖部位對、、NRF1和TFAM的mRNA表達水平影響較大，同時對p-AMPK、PGC-1α、NRF1和TFAM的蛋白表達水平的影響也較大。

圖9 黃芪及各組分對大鼠肝組織AMPK、PGC-1α、NRF1和TFAM mRNA表達的影響(, n = 3)

圖10 黃芪及各組分對大鼠肝組織AMPK、PGC-1α、NRF1和TFAM蛋白表達的影響(, n = 3)

4 討論

4.1 有效部位拆分工藝

在黃芪的部位拆分工藝研究中，考察了AB-8樹脂、D101樹脂、聚酰胺樹脂、溶劑萃取法的分離效果，結(jié)果表明成分交叉且得到的部位純度不高。本研究中方法A、B的相關(guān)參數(shù)包括上樣量、是否加堿洗脫、乙醇濃度、洗脫體積、洗脫體積流量等洗脫條件在預(yù)實驗階段均進行了考察和優(yōu)化，最終確定以D101樹脂結(jié)合溶劑萃取法效果較好，0.5 g/mL生藥量上樣，0.1% NaOH、20%乙醇除雜，80%乙醇收集富集部位效果最佳。此方法，簡便、易行、環(huán)保，可為黃芪部位的分離提供參考依據(jù)。在測定總黃酮的純度時，由于黃芪中大多黃酮為異黃酮，不具有亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色條件，故沒有采用經(jīng)典的以蘆丁為對照品溶液的硝酸鋁比色法。

4.2 黃芪溫?zé)嵝?yīng)引起“上火”的物質(zhì)基礎(chǔ)及機制分析

《黃帝內(nèi)經(jīng)》有載：“氣有余便是火”，而黃芪作為“補氣圣藥”，長期過量食用可能引發(fā)“上火”反應(yīng)。體溫升高、大便干燥為“上火”的癥候。對大鼠的肛溫研究結(jié)果表明，黃芪全成分組最為顯著，是黃芪溫?zé)崴幮缘捏w現(xiàn)，而體溫升高可能是多方面綜合作用的體現(xiàn)，如對腎上腺功能的作用，對炎癥因子的作用，對能量代謝的作用等，因此雖然各個部位對各個指標的作用有差異，但最終體溫的升高來源于幾個部位的綜合作用，而非單個部位的作用，因此全成分組體溫升高最為顯著。結(jié)合第28天，從各個部位對體溫升高的貢獻來看，多糖部位貢獻最大。全成分組、多糖組糞便含水量降低顯著，體現(xiàn)出大便干燥的癥狀，而缺多糖組糞便含水量有所升高，因此多糖部位對糞便干燥的“上火”癥狀影響較大，結(jié)合缺皂苷組糞便含水量顯著增高，而缺黃酮組糞便含水量降低，表明皂苷對糞便干燥的“上火”癥狀也有一定的貢獻。《尚書》有言：“火曰炎上”，“上火”常出現(xiàn)的癥狀集中在頭面部，如口舌生瘡、嗓子干痛、流鼻血等，因此對大鼠的唾液量進行研究，研究結(jié)果表明，全成分組、皂苷組、多糖組或含有多糖與皂苷的配伍組大鼠唾液量顯著降低，因此多糖部位和皂苷部位對唾液量減少的影響較大，其中多糖部位的影響大于皂苷部位。

Huang等[21]認為過量食用龍眼導(dǎo)致的“上火”與炎癥相關(guān)，因此本研究對炎癥因子進行了測定。從實驗結(jié)果可知，黃芪多糖可顯著上調(diào)TNF-α與IL-6水平，黃芪皂苷可顯著上調(diào)TNF-α水平，黃酮組的IL-6和IL-1β水平顯著降低。由此推測，長期超劑量服用黃芪引發(fā)的“上火”可能是由黃芪多糖部位或皂苷部位導(dǎo)致。黃酮部位則體現(xiàn)一定的抗炎活性，也有研究表明黃酮類成分可以通過下調(diào)IL-6、IL-1β的水平來改善炎癥反應(yīng)[22-23]。說明黃芪的“上火”反應(yīng)是各部位成分綜合的效應(yīng)，因此在機體本身有一定“陰虛陽亢”癥狀時，“上火”反應(yīng)會更加明顯。

研究表明，患有“熱證”大鼠能量代謝紊亂，尤其是與甲狀腺功能和鈉泵的活性變化相關(guān)[24]，因此對甲狀腺功能進行了測定。在對大鼠甲狀腺功能的研究中發(fā)現(xiàn)，除缺黃酮組的T4含量有一定的升高外，其余組別均無顯著性升高，這說明黃芪導(dǎo)致“上火”可能不通過甲狀腺功能軸實現(xiàn)調(diào)節(jié)。而相關(guān)研究[25-26]認為“上火”與交感腎上腺系統(tǒng)相關(guān)，17-OHCS可以反映交感神經(jīng)-腎上腺系統(tǒng)功能，腎上腺功能的亢進與其分泌呈正相關(guān)，因此本研究對血清中的17-OHCS進行了測定，結(jié)果表明，與對照組相比，全成分組、多糖組、皂苷組等17-OHCS含量顯著增加，表明以上部位對腎上腺功能有一定的促進作用。能量代謝包括能量的產(chǎn)生與消耗，在這個過程中ATP能直接反映生物體能量代謝水平的高低，是能量的“通用貨幣”，ATP酶主要存在于細胞膜與細胞器膜上，其功能是將ATP水解并釋放出能量，因此對Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶的活力進行了測定。在黃芪及各組分對Na+, K+-ATP酶活力的影響中發(fā)現(xiàn)全成分組、缺黃酮組增強顯著，全成分組、缺皂苷組Ca2+, Mg2+-ATP酶活力增強顯著，可以推測全成分組與含有多糖的配伍組可以促進大鼠ATP的分解和產(chǎn)熱。SDH是反映線粒體功能的標志酶，其活性的上調(diào)代表三羧酸循環(huán)的加速與ATP的增加[27]，LDH廣泛分布在組織中，其活力代表了肝臟的厭氧代謝水平，全成分組、多糖組對SDH具有促進作用，皂苷組對LDH有抑制作用，且多糖部位對于黃芪促進ATP增加作用的貢獻最大。肝糖原是由大量葡萄糖分子聚合而成的多糖，以糖原的形式儲存在肝臟中，它可以在需要的時候分解成葡萄糖，同時產(chǎn)生能量，多糖組、缺皂苷組和缺黃酮組的肝糖原含量較高，推測因有多糖的存在導(dǎo)致糖原儲存較多。

有專家認為，“上火”表現(xiàn)出的皮膚黏膜的紅腫熱痛、潰瘍等癥狀，與能量代謝密切相關(guān)[28-29]。AMPK能夠靈敏地感應(yīng)細胞內(nèi)二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）/ATP和單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）/ATP的比值變化，被視為“能量傳感器”和“能量代謝的總開關(guān)”。PGC-1α主要存在于含有線粒體的組織中，它可以在AMPK的調(diào)節(jié)下輔助激活NFR1與TFAM，促進線粒體的合成[30]。趙婷等[31]通過建立實熱“上火”動物模型對AMPK能量代謝方面進行研究，表明紅參引發(fā)的“上火”與AMPK等上調(diào)相關(guān)。張喜召等[4]通過建立“上火”模型研究表明對“上火”動物模型中AMPK-PGC-1α信號通路受到抑制。本研究結(jié)果表明，黃芪及各部位對AMPK介導(dǎo)的通路中的關(guān)鍵蛋白AMPK、PGC-1α、NFR1、TFAM有上調(diào)作用，各組分均可促進能量代謝，增強能量儲備（圖11）。因此黃芪引發(fā)的“上火”反應(yīng)機制可能與AMPK介導(dǎo)AMPK-PGC-1α通路相關(guān)。比較各組的作用大小發(fā)現(xiàn)，多糖組作用較強，與全成分組相當(dāng)或者高于全成分組。

綜上所述，通過“部位扣除”結(jié)合單個部位給藥，對黃芪引起的“上火”反應(yīng)從炎癥反應(yīng)、腎上腺功能、ATP酶活力、SDH活力以及AMPK介導(dǎo)的AMPK-PGC-1α通路等方面進行探討，發(fā)現(xiàn)黃芪的3類成分中多糖類成分可能對“上火”的影響較大，在黃芪相關(guān)保健品開發(fā)時，可以采用一定的方法控制黃芪多糖的含量，以達到減少“上火”反應(yīng)的目的。

圖11 基于能量代謝及AMPK通路作用示意圖

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Material basis and mechanism of “Shanghuo” response caused by warm nature ofbased on “fraction deduction”

CAO Li-long1, PEI Ke1, LIU Rui1, NING Yan2, ZHAO Ting-ting1, YU Zi-han1, WU Chen-cheng1, SHAO Xiang-yu1, ZHANG Shuo-sheng1, WANG Ying-li1, HU Mei-bian1, CAI Hao3

1. Shanxi Modern Chinese Medicine Engineering Laboratory, School of Chinese Medicine and Food Engineering, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, China 2. Chinese Medicine Processing Research Center, School of Pharmacy, Zhejiang University of Chinese Medicine, Hangzhou 310053, China 3. Engineering Research Center for Standardization and Standardization of Chinese Medicine Processing, Ministry of Education, School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

To explore the material basis and mechanism of “Shanghuo” caused by warm nature of Huangqi ()The flavonoids and saponins indecoction were isolated and identified by UHPLC-Q-Orbitrap HRMS firstly. Then SD rats were randomly divided into eight groups, administrated with distilled water and corresponding drugs, respectively. The daily dose was administered at four times dosage prescribed byfor 30 d. The state of rats was observed, rectal temperature, food intake, fecal output, feces moisture and saliva volume were measured. The related indexes including inflammatory factors, thyroid function, adrenal function and energy metabolism were determined. Finally, mRNA and protein expressions of adenosine monophosphate activated protein kinase (), peroxisome proliferator-activated-recptor-γ coactivator-1α (), nuclear respiratory factor 1 () and mitochondrial transcription factor A () in each group were detected.There was a good separation for polysaccharides, flavonoids and saponins, at the same time the purity of total polysaccharides, saponins and flavonoids was more than 50%, 80% and 80% respectively. A total of 21 flavonoids and six saponins were identified. There was no significant difference in body weight among all groups, while the rectal temperature ofgroup was significantly increased (< 0.05) by comparing to control group. The feces moisture ofand polysaccharides group were significantly decreased (< 0.05, 0.01), however polysaccharides plus flavonoids group was significantly increased (< 0.001) by comparing to control group. For saliva volume, compared with control group, polysaccharides, saponins and polysaccharides plus saponins group were significantly decreased on 28th day (< 0.001). The level of tumor necrosis factor-α (TNF-α) in, polysaccharides, saponins and saponins plus flavonoids groups were all significantly increased (< 0.05, 0.01, 0.001), while only interleukin-6 (IL-6) level in polysaccharides group was significantly increased (< 0.01), IL-1β level ingroup was increased (< 0.05) by comparing to control group. The contents of 17-hydroxycorticosteroid (17-OHCS) in all groups were increased by comparing with control group, while, polysaccharides, saponins, saponins plus flavonoids group and saponins plus polysaccharides groups had significantly difference (< 0.05, 0.01). Compared with control group, activities of Ca2+, Mg2+-ATPase and Na+, K+-ATPase in, polysaccharides plus flavonoids and polysaccharides plus saponins were increased, activity of succinate dehydrogenase (SDH) inand polysaccharides group were also significantly increased (< 0.05, 0.01). Compared with control group, mRNA and protein expressions of,,andwere upregulated in all groups, and the trends ofand polysaccharides group were better than that of other groups.“Shanghuo” induced by excessive consumption ofmay be related to the inflammatory reaction and enhanced energy metabolism caused by polysaccharides and saponins ofThe mechanism may be related to AMPK mediated PGC-1α/NFR1 pathway, and polysaccharides played a major role.

; “Shanghuo” response; UHPLC-Q-Orbitrap HRMS; energy metabolism; adenosine monophosphate activated protein kinase pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2022)14 - 4350 - 15

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.14.015

2022-01-10

國家自然科學(xué)基金面上項目（82074022）；國家自然科學(xué)基金聯(lián)合基金重點項目（U21A20410）；科技部“中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究”重點研發(fā)計劃項目子課題（2019YFC1710800）；山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目（201801D221436）；山西省教育廳科技創(chuàng)新計劃項目（2019L0720）；山西省中醫(yī)藥管理局項目（2019ZYYC016）；山西省重點研發(fā)計劃項目（201903D421018）；山西省重點研發(fā)計劃項目（201903D421018）；山西藥茶的研制和開發(fā)項目（2020PY-YC-20）

曹麗瓏（1996—），女，碩士研究生，研究方向為中藥炮制與物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: C178798032@126.com

裴 科（1986—），女，碩士生導(dǎo)師，研究方向為中藥炮制與物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: peike_pk@126.com

蔡 皓（1966—），男，副教授，研究方向為中藥炮制機制及炮制配伍。E-mail: haocai_98@njucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]