譚舒心 張淑江 章時蕃 張 慧 李國亮 劉希童 劉雨佳 孫日飛 李 菲

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

隨著植物游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，利用小孢子培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體/雙單倍體（DH）植株用于育種等科研領(lǐng)域的研究日益受到關(guān)注。十字花科蕓薹屬蔬菜在我國栽培歷史悠久，種質(zhì)資源豐富，在蔬菜生產(chǎn)中占據(jù)重要地位。多年來蕓薹屬植物游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的研究始終是科研人員關(guān)注的熱點(diǎn)之一，近幾年針對白菜培養(yǎng)體系的優(yōu)化已取得有效進(jìn)展（李菲 等，2014；伍健繽 等，2021），并有力推動了白菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)在育種等科研領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。目前，小孢子培養(yǎng)技術(shù)在加速十字花科蕓薹屬作物種質(zhì)純化、DH 群體的圖譜構(gòu)建以及重要基因定位研究中發(fā)揮了顯著優(yōu)勢（李智軍 等，2021）。但在細(xì)胞培養(yǎng)范疇，小孢子的收集受供體植株生長周期和栽培條件的極大影響，不能持續(xù)獲取優(yōu)質(zhì)、高生活力的小孢子，是阻礙小孢子培養(yǎng)技術(shù)更廣泛應(yīng)用的主要障礙。例如二年生的大白菜，在缺少人工氣候室的情況下，利用溫室、大棚等設(shè)施栽培亦可在每年3—5 月大白菜盛花期收集到適宜誘導(dǎo)胚狀體的小孢子，但是一旦進(jìn)入高溫季節(jié)，植株病害嚴(yán)重，則難以繼續(xù)收集小孢子，使相關(guān)科研工作無法按計劃推進(jìn)。因此，如何持續(xù)獲取高生活力的小孢子對推動白菜細(xì)胞工程研究的順利開展具有重要意義。

超低溫凍存技術(shù)為妥善保存白菜小孢子提供了可能。超低溫凍存是指以液氮為冷源，貯存溫度保持在-196 ℃的長期貯存生物材料的方法（Wang et al.，2011）。在超低溫條件下，生物材料活體細(xì)胞的物質(zhì)代謝幾乎完全停止，處于“活力停滯”（stagnant vitality）狀態(tài)（David，2010）。因細(xì)胞、組織及器官在低溫保存過程中遺傳特性不會發(fā)生改變，在“活力停滯”狀態(tài)下可減緩甚至停止生物材料的新陳代謝和老化過程（宋友遠(yuǎn) 等，2016），且不發(fā)生遺傳變異并維持生物材料的高活力，達(dá)到安全、有效地長期保存珍稀種質(zhì)資源的效果（Pedro et al.，2008）。

關(guān)于植物組織超低溫凍存的方法已有研究報道（何慶虎，2019），凍存對象主要涉及原生質(zhì)體、愈傷組織、體細(xì)胞胚、花粉、種子等（殷曉輝 等，1996；王子成和鄧秀新，2002；謝玉明，2003；張守梅 等，2005；余露 等，2007；Bai et al.，2011；Pio et al.，2012；Souza et al.，2018）。前人研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在-15～-5 ℃下通常會出現(xiàn)低溫冷害現(xiàn)象，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)膜、微管在進(jìn)行有絲分裂或細(xì)胞減數(shù)分裂時紡錘體發(fā)生不可逆變化，導(dǎo)致細(xì)胞無法正常分裂而死亡（Moussa et al.，2014）。在超低溫凍存中植物細(xì)胞液內(nèi)也同樣存在冷害現(xiàn)象（Harding，2004），因此在超低溫凍存中需添加必要的冷凍保護(hù)劑（孫嘉瑩 等，2019），目前廣泛應(yīng)用的冷凍保護(hù)劑主要為二甲基亞砜（DMSO）、甘油等（文彬，2011），但此類滲透性冷凍保護(hù)劑本身具有毒性，會使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，從而造成細(xì)胞的損傷，對凍存對象具有一定毒害作用（張美娜 等，2019）。

植物小孢子為單倍體的單細(xì)胞，新鮮提取的小孢子在進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時極易受培養(yǎng)環(huán)節(jié)的溫度、光照、振蕩、培養(yǎng)基成分等諸多因素干擾而使細(xì)胞停止發(fā)育，這可能是科研人員至今還未將超低溫凍存技術(shù)應(yīng)用于植物小孢子的原因。本試驗(yàn)利用超低溫凍存技術(shù)對10 份白菜材料小孢子開展凍存復(fù)蘇研究，建立白菜小孢子超低溫凍存復(fù)蘇的胚狀體誘導(dǎo)體系，以期獲得維持高生活力小孢子長期保存的有效方法，為白菜單倍體誘導(dǎo)相關(guān)試驗(yàn)的順利開展提供技術(shù)支持，推動蕓薹屬植物細(xì)胞工程研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試10 份白菜材料均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所白菜課題組提供，包括8 份結(jié)球白菜和2 份青梗菜（表1）。

表1 供試10 份白菜材料編號及基本特性

改良B5 液體培養(yǎng)基：常規(guī)B5 培養(yǎng)基中添加120 g·L蔗糖、50 g·L甘露醇，pH 值5.8，高溫滅菌后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；二甲基亞砜購于Sigma-Aldrich（貨號：D2650-100ML），參照傳統(tǒng)方法，利用無菌蒸餾水配制成濃度為2%的溶液（馬鋒旺和李嘉瑞，1989），4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供體植株栽培管理 10 份白菜材料均于2020 年12 月20 日催芽，播種于直徑為10 cm 的營養(yǎng)缽中，溫室育苗常規(guī)管理。2021 年3 月3 日，幼苗4～5 片葉時定植于本所南圃場大棚內(nèi)，每份材料定植10 株。經(jīng)過冬季短期的營養(yǎng)生長和低溫春化，植株開始花芽分化并抽薹開花，3 月底至6月初在盛花期收集提取小孢子。

1.2.2 白菜小孢子的收集 采集供體植株2～3 mm長的花蕾（此時小孢子主要處于單核靠邊期），先用75%酒精浸泡消毒30 s，再用7%次氯酸鈉溶液浸泡消毒15 min，然后無菌蒸餾水沖洗3 遍；加入改良B5 液體培養(yǎng)基，采用細(xì)胞破碎儀（TOMY MS-100R）收集提取小孢子。將40 個花蕾收集于5 mL 離心管中，細(xì)胞破碎儀3 000 r·min條件下破碎10 s，進(jìn)行小孢子的機(jī)械化提取（李菲 等，2009，2014）。

1.2.3 白菜小孢子的生活力檢測 利用醋酸洋紅染色法分別檢測10 份白菜材料新鮮小孢子的生活力，作為后期的試驗(yàn)對照。取1～2 μL 小孢子懸浮液置于載玻片上，滴1 滴醋酸洋紅染液，室溫下放置10 min，在蔡司體式顯微鏡（Axioskop 40）10×目鏡下觀察，具有生活力的小孢子呈深紅色，無生活力的小孢子呈淺紅色或無色（李慶飛 等，2020）。隨機(jī)選擇3～4 個視野進(jìn)行觀察，取平均值。

小孢子生活力=視野內(nèi)有生活力的小孢子數(shù)/視野內(nèi)全部小孢子數(shù)× 100%

1.2.4 冷凍保護(hù)劑比較試驗(yàn) 分別采用改良B5 液體培養(yǎng)基與傳統(tǒng)冷凍保護(hù)劑二甲基亞砜作為冷凍保護(hù)劑，比較并篩選適宜白菜小孢子低溫保存的冷凍保護(hù)劑。保存溫度設(shè)置6 個處理：4、-20、-40、-80℃（冰箱）和-196 ℃（液氮），以室溫為對照；每個溫度處理下再設(shè)置3 個保存時間處理：30、60、90 d。每處理3 次重復(fù)，利用醋酸洋紅染色法檢測小孢子生活力。為確保試驗(yàn)的一致性，4 ℃和室溫處理也同樣添加冷凍保護(hù)劑；試驗(yàn)采用的0.5 mL凍存管密封性好，可長期無菌保存小孢子，冷凍保護(hù)劑不會揮發(fā)。

1.2.5 白菜小孢子低溫保存試驗(yàn) 分別收集10 份白菜材料的新鮮小孢子分裝于0.5 mL 滅菌凍存管中，小孢子體積不超過凍存管的2/3。設(shè)置6 個溫度處理：4、-20、-40、-80 ℃（冰箱）和-196 ℃（液氮），以室溫為對照；每個溫度處理下再設(shè)置6 個保存時間處理：30、60、90、120、150、180 d。每處理3 次重復(fù)，利用醋酸洋紅染色法檢測小孢子生活力。

1.2.6 白菜小孢子復(fù)蘇試驗(yàn) 根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，選擇-80 ℃（冰箱）保存90 d 的小孢子為試材，篩選白菜小孢子復(fù)蘇適宜溫度及時間。小孢子為單細(xì)胞，細(xì)胞復(fù)蘇并保持高生活力的關(guān)鍵是“慢凍快融”原則。Harding（2004）研究表明，植物細(xì)胞超低溫保存后化凍溫度超過50 ℃會對細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器造成不可逆的損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，本試驗(yàn)設(shè)置的3 個復(fù)蘇溫度處理分別為：37、40、50 ℃；每個溫度處理下再設(shè)置3 個復(fù)蘇時間處理：40、50、60 s。利用恒溫水浴鍋（上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠）進(jìn)行加熱融化；每處理3 次重復(fù)，利用醋酸洋紅染色法檢測小孢子生活力。

1.2.7 懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)小孢子胚狀體 分別將10 份白菜材料的新鮮小孢子和在-80 ℃（冰箱）保存30、60、90、150、180 d 后進(jìn)行復(fù)蘇的小孢子懸浮于NLN-13 液體培養(yǎng)基（pH 值6.0，用0.22 μm 針式過濾器過濾滅菌制得，4 ℃冰箱保存）中。利用血球計數(shù)板調(diào)整小孢子懸浮液濃度為1 × 10個·mL，然后分裝于直徑為60 mm 的無菌培養(yǎng)皿中，每皿10～12 mL，采用Parafilm 封口膜封口；33 ℃培養(yǎng)箱熱激誘導(dǎo)24 h 后，轉(zhuǎn)入25 ℃暗培養(yǎng)孵育，直至獲得肉眼可見的胚狀體。采用蔡司體式顯微鏡觀察胚狀體發(fā)生情況，統(tǒng)計每皿出胚數(shù)；每處理3次重復(fù)，取平均值。

1.2.8 誘導(dǎo)小孢子胚狀體的植株再生 將超低溫保存、復(fù)蘇小孢子誘導(dǎo)獲得的胚狀體轉(zhuǎn)入B5 固體培養(yǎng)基〔6-芐氨基嘌呤（6-BA）1.5 mg·L、α-萘乙酸（NAA）0.05 mg·L、蔗糖30 g·L，pH 值5.8～6.0〕進(jìn)行組培繼代，培養(yǎng)室溫度保持24～26℃，光照強(qiáng)度1 000～1 500 lx，16 h 光照/8 h 黑暗培養(yǎng)，直至獲得具有根、莖、葉的再生植株。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 和SPSS 19.0 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素ANOVA 方差分析，選擇95%置信度作為統(tǒng)計學(xué)顯著檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同冷凍保護(hù)劑對白菜小孢子生活力的影響

如表2 所示，參試10 份白菜材料的新鮮小孢子生活力均較高，且差異不大，其中白菜4 的小孢子生活力最高，達(dá)到99.2%；白菜7 的小孢子生活力最低，為94.3%；10 份白菜材料的小孢子平均生活力為97.6%。說明小孢子生活力與白菜材料背景無相關(guān)性，且目前白菜小孢子提取技術(shù)已成熟穩(wěn)定，可確保收集的新鮮小孢子具有高生活力。

表2 10 份白菜材料新鮮小孢子的生活力檢測結(jié)果

從表3 可以看出，相同保存條件下采用改良B5 液體培養(yǎng)基為冷凍保護(hù)劑的白菜小孢子生活力明顯高于采用傳統(tǒng)冷凍保護(hù)劑二甲基亞砜為冷凍保護(hù)劑的白菜小孢子；以改良B5 液體培養(yǎng)基為冷凍保護(hù)劑，保存溫度為-196 ℃和-80 ℃，保存時間30 d 的白菜小孢子生活力分別為96.6%和95.2%，與新鮮小孢子的平均生活力97.6%相差不大；隨著保存時間的延長，白菜小孢子生活力呈下降趨勢，保存時間為90 d 時以二甲基亞砜為冷凍保護(hù)劑的白菜小孢子生活力均低于56%，已無法滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。由此，后續(xù)試驗(yàn)均以改良B5 液體培養(yǎng)基作為冷凍保護(hù)劑。

表3 不同冷凍保護(hù)劑對低溫保存白菜小孢子生活力的影響

2.2 不同保存溫度對白菜小孢子生活力的影響

不同溫度保存30 d 的白菜小孢子生活力差異明顯，利用醋酸洋紅染色法可直觀分辨（圖1）。其中-80 ℃和-196 ℃保存的小孢子生活力較高，與新鮮小孢子無明顯差異，且遠(yuǎn)高于其他低溫保存的小孢子生活力；室溫對照和4 ℃保存的小孢子數(shù)量明顯減少，大量細(xì)胞破裂，細(xì)胞液外流，失去生活力。

圖1 白菜1 小孢子不同溫度保存30 d 的顯微觀察結(jié)果（10×目鏡）

由表4、圖2 可以看出，相同保存條件下10份白菜材料間的小孢子生活力差異不大。-196 ℃和-80 ℃保存的小孢子平均生活力隨保存時間的延長下降趨勢平緩，保存30 d 的小孢子平均生活力分別為96.6%和95.2%，與新鮮小孢子平均生活力差異不明顯，保存至180 d 時小孢子平均生活力仍可保持在85%以上；其他處理?xiàng)l件下，白菜小孢子生活力隨著保存溫度的升高呈明顯下降趨勢，且隨保存時間的延長小孢子平均生活力也明顯下降。10 份白菜材料的小孢子在-40、-20 ℃保存90 d 的平均生活力為70%左右；4 ℃保存60 d 的小孢子平均生活力已降至57.4%；室溫對照保存30 d 的小孢子平均生活力僅維持在50%左右，保存至60 d的小孢子平均生活力僅為1.8%，已基本喪失生活力。綜上，白菜小孢子無法在4 ℃和室溫條件下長期保存；對于短期（30～90 d）且對生活力要求不高（80%以下）的試驗(yàn)而言，低溫保存小孢子可選擇的溫度范圍較廣，-196～-20 ℃均可；對于長期保存，且對小孢子生活力要求高（85%以上）的試驗(yàn)，則需要在-196～-80 ℃溫度下保存。鑒于-80℃（冰箱）和-196 ℃（液氮）保存下白菜小孢子的生活力差異不顯著，實(shí)際應(yīng)用中可選擇-80 ℃冰箱保存，既可避免液氮保存時需要人員定期監(jiān)控和定時填充液氮等問題，且操作也更簡便。

圖2 不同保存溫度和時間對白菜小孢子生活力的影響

表4 不同保存溫度對白菜小孢子生活力的影響

2.3 不同復(fù)蘇條件對白菜小孢子生活力的影響

-80 ℃保存90 d 的白菜小孢子經(jīng)不同條件復(fù)蘇處理后的生活力檢測結(jié)果表明（表5），白菜小孢子生活力隨復(fù)蘇溫度的升高和復(fù)蘇時間的延長呈逐漸下降趨勢，其中37 ℃恒溫水浴40 s，10 份白菜材料的小孢子生活力均在85%以上，平均生活力為87.9%，可以滿足后續(xù)小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)胚狀體的試驗(yàn)要求，即0.5 mL 凍存管分裝保存的白菜小孢子復(fù)蘇的最佳條件為37 ℃恒溫水浴40 s。

表5 -80℃保存90 d 的白菜小孢子不同復(fù)蘇處理后生活力檢測結(jié)果

2.4 凍存復(fù)蘇后小孢子的胚狀體培養(yǎng)

經(jīng)超低溫保存、復(fù)蘇后的白菜小孢子是否能誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生是建立小孢子凍存復(fù)蘇體系的關(guān)鍵。本試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，隨著超低溫保存時間的延長，懸浮培養(yǎng)的復(fù)蘇小孢子在觀察視野中可捕捉到的熱激膨大的小孢子數(shù)量和分裂的細(xì)胞團(tuán)數(shù)量呈逐漸減少的趨勢。

從表6 可以看出，白菜2 和白菜3 為易出胚材料，其提取的新鮮小孢子及-80 ℃保存30、60、90 d 復(fù)蘇后的小孢子均可誘導(dǎo)獲得胚狀體；白菜1和白菜4 的新鮮小孢子和凍存復(fù)蘇后的小孢子均不具備胚胎發(fā)生能力，可能是因?yàn)檫@2 份材料為難誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的材料；其余6 份材料的小孢子不同處理后進(jìn)行熱激誘導(dǎo)均有小孢子體積膨大現(xiàn)象，后續(xù)培養(yǎng)觀察也發(fā)現(xiàn)有分裂的細(xì)胞團(tuán)（圖3）。由此認(rèn)為，超低溫保存的白菜小孢子復(fù)蘇后可以承受高溫?zé)峒っ{迫，并可以繼續(xù)進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)；小孢子是否可誘導(dǎo)獲得胚狀體主要取決于材料本身基因型。

圖3 白菜5 小孢子-80℃保存180 d 復(fù)蘇后的熱激膨大小孢子及分裂細(xì)胞團(tuán)

表6 超低溫保存、復(fù)蘇后白菜小孢子誘導(dǎo)成胚情況

統(tǒng)計白菜2 和白菜3 的出胚數(shù)量。結(jié)果表明（表7，圖4、5），小孢子隨著超低溫保存時間的延長，誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚狀體數(shù)量不斷減少，與新鮮小孢子出胚量有顯著差異。分析原因，可能是經(jīng)過長時間超低溫保存的小孢子雖然仍保持較高生活力，但比新鮮小孢子的生活力仍有所降低（表4），且小孢子歷經(jīng)超低溫保存、復(fù)蘇處理及高溫?zé)峒ふT導(dǎo)等多次溫度的逆境脅迫后，雖仍具有啟動胚胎發(fā)生的能力，但能進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞分裂的小孢子數(shù)量也隨之降低。

表7 白菜2、白菜3 超低溫保存、復(fù)蘇后小孢子的出胚數(shù)量

圖4 白菜2 超低溫保存、復(fù)蘇后小孢子的出胚情況

圖5 白菜3 超低溫保存、復(fù)蘇后小孢子的出胚情況

2.5 超低溫保存小孢子誘導(dǎo)胚狀體的繼代培養(yǎng)

將超低溫保存、復(fù)蘇后的白菜小孢子誘導(dǎo)獲得的胚狀體接種于B5 固體培養(yǎng)基組培繼代，與新鮮小孢子誘導(dǎo)獲得的胚狀體相比，經(jīng)歷30、60、90 d超低溫保存后的小孢子誘導(dǎo)獲得的胚狀體在普通組培繼代培養(yǎng)中沒有表現(xiàn)生長發(fā)育的差異，3 個月后均成功獲得了具根、莖、葉的組培再生植株（圖6）。由此認(rèn)為，白菜小孢子經(jīng)超低溫保存、復(fù)蘇后誘導(dǎo)獲得的胚狀體同樣可實(shí)現(xiàn)正常組培苗的獲得。

圖6 超低溫保存、復(fù)蘇后白菜小孢子誘導(dǎo)胚狀體繼代培養(yǎng)獲得組培苗

3 討論與結(jié)論

隨著游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用，超低溫凍存技術(shù)可能是解決目前白菜小孢子供體植株受生長季節(jié)、生長期影響，無法長期持續(xù)獲取高生活力小孢子的有效途徑之一。

本試驗(yàn)采用改良B5 液體培養(yǎng)基作為白菜小孢子超低溫保存的冷凍保護(hù)劑，能有效克服二甲基亞砜等傳統(tǒng)冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞凍存的潛在毒害（陳曉藝 等，2021），并且小孢子經(jīng)超低溫凍存復(fù)蘇后仍可維持較高生活力和胚胎發(fā)生能力。選擇改良B5液體培養(yǎng)基是因?yàn)樵诎撞诵℃咦优囵B(yǎng)體系中B5 培養(yǎng)基必不可少，除了可以維持游離態(tài)細(xì)胞的養(yǎng)分環(huán)境，還具較高的糖濃度。有報道認(rèn)為，在冷凍保護(hù)劑中添加蔗糖能夠改變凍存組織的外液滲透壓，有助于細(xì)胞在冷凍時脫水，在解凍時可防止水分的快速進(jìn)入，降低冰晶對細(xì)胞的損傷（潘紅梅 等，2015）；另外，冷凍保護(hù)劑中添加幾種糖類混合物對細(xì)胞保護(hù)效果更好（Gómez-Fernández et al.，2012）。這可能是本試驗(yàn)利用改良B5 液體培養(yǎng)基作為冷凍保護(hù)劑使白菜小孢子生活力更高、達(dá)到良好保存效果的原因。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，白菜小孢子經(jīng)長時間低溫保存后，雖然仍可維持較高的生活力，但與新鮮小孢子相比其生活力隨低溫保存時間的延長是逐漸下降的，這與后期觀察復(fù)蘇小孢子熱激后誘導(dǎo)膨大的小孢子數(shù)量、分裂的細(xì)胞團(tuán)數(shù)量以及獲得的胚狀體數(shù)量隨低溫保存時間的延長而減少是一致的。白菜游離小孢子培養(yǎng)屬于大群體基數(shù)的細(xì)胞培養(yǎng)，在后續(xù)進(jìn)行小孢子超低溫凍存體系優(yōu)化中可通過提高復(fù)蘇后白菜游離小孢子懸浮液濃度，從而有效提高超低溫凍存復(fù)蘇小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)的胚狀體數(shù)量。

考慮到凍存體積影響化凍時長，小孢子凍存體積越大化凍時間則越長，進(jìn)而影響小孢子生活力。本試驗(yàn)選擇0.5 mL 凍存管分裝保存白菜小孢子，每管凍存小孢子稀釋后可分裝3～4 個培養(yǎng)皿，可滿足后續(xù)小孢子胚狀體誘導(dǎo)試驗(yàn)所需。在實(shí)際應(yīng)用中，小孢子凍存體積可根據(jù)不同試驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行合理調(diào)整。使用體積更小的凍存管，白菜小孢子凍存復(fù)蘇的時間縮短，在一定程度上可減少高溫化凍對小孢子的傷害，小孢子復(fù)蘇后可維持更高生活力。

小孢子是花粉的前體，前人在花粉凍存研究中發(fā)現(xiàn)，超低溫并不都有利于植物花粉的保存。如海棠花粉的最適保存溫度為4 ℃，溫度過低會導(dǎo)致細(xì)胞脫水，不利于海棠花粉貯藏（朱金儒 等，2016）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著保存溫度的升高，白菜小孢子生活力逐漸下降，但在-80 ℃和-196℃保存條件下小孢子生活力下降趨勢減緩。這與劉學(xué)良等（2018）分析低溫導(dǎo)致細(xì)胞呼吸作用減弱，可溶性糖、有機(jī)酸等物質(zhì)消耗減少的觀點(diǎn)一致。由此認(rèn)為，白菜小孢子的保存不能參照花粉保存的溫度，4、?20、?40 ℃低溫保存均無法使白菜小孢子長期保存后仍具有高生活力。

本試驗(yàn)所用的10 份材料中8 份為結(jié)球白菜，2 份為青梗菜，提取的新鮮小孢子生活力均在95%左右；在相同試驗(yàn)條件下不同白菜材料小孢子之間的生活力差異并不顯著，本凍存技術(shù)可以廣泛應(yīng)用于白菜類作物。

本試驗(yàn)首次對白菜小孢子超低溫凍存復(fù)蘇開展研究，篩選獲得了適宜白菜小孢子的超低溫凍存條件，建立了白菜小孢子超低溫凍存及復(fù)蘇后胚狀體誘導(dǎo)體系，試驗(yàn)結(jié)果可為十字花科蕓薹屬作物小孢子的長期有效保存以及相關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)研究提供技術(shù)參考。