馬建文，顧錫亭，王 珊，陳轉(zhuǎn)香，張博勇，李玲俐

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712100）

元寶楓Acer truncatum（2n=2x=26）屬槭樹(shù)科Aceraceae 槭屬Acer植物，是我國(guó)特有且綜合效益較高的木本油料樹(shù)種，主要分布于我國(guó)東北和華北等地區(qū)的27 個(gè)省、區(qū)、市，分布區(qū)域廣、海拔差異大[1]。由于其翅果外形與我國(guó)古代的金元寶極其相似，故常被稱為“元寶槭”或“元寶楓”。發(fā)展元寶楓可獲得良好的生態(tài)效益與社會(huì)效益。元寶楓秋葉具有獨(dú)特的園林觀賞價(jià)值，而且由于元寶楓具有VA 菌根，是抗旱、耐寒、耐貧瘠、改善生態(tài)環(huán)境的理想造林樹(shù)種[2]。元寶楓是良好的木本油料樹(shù)種，其種仁含油率45%～48%，其種子油食用后無(wú)不良反應(yīng)。元寶楓葉中含多種活性物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)保健成分[3]；種皮中含60%的凝縮類單寧，是皮革工業(yè)和紡織印染工業(yè)的優(yōu)質(zhì)原料[4]。另外，元寶楓種仁含27%的蛋白質(zhì)，是理想的蛋白質(zhì)資源[5]，且其油酸、亞油酸、維生素E 含量豐富。最重要的是元寶楓種仁中含有5%～6%的神經(jīng)酸[6]，神經(jīng)酸是大腦神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育所需重要物質(zhì)，而我國(guó)常規(guī)食用植物油中不含神經(jīng)酸[7]，因此近年來(lái)元寶楓種子油得到了相關(guān)學(xué)者和企業(yè)的青睞。

神經(jīng)酸（NA，C24:1，ω-9，順15-二十四碳烯酸）是一種超長(zhǎng)鏈單不飽和脂肪酸（C22 ～C26）[8]，最早從鯊魚(yú)大腦內(nèi)分離出來(lái)，故又稱鯊魚(yú)酸，能促進(jìn)受損腦神經(jīng)纖維的修復(fù)和再生[9]，是大腦發(fā)育必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在大腦發(fā)育和維持以及神經(jīng)細(xì)胞的生物合成和改善中起著至關(guān)重要的作用。但人體自身較難合成神經(jīng)酸，只能靠體外攝取。嬰兒通過(guò)吸收母乳中的神經(jīng)酸協(xié)助神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[10-11]。神經(jīng)酸水平的降低與發(fā)生精神類疾病的高風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[12-13]，補(bǔ)充神經(jīng)酸是有效治療幾種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，如脫髓鞘疾病[13-15]。由于鯊魚(yú)等動(dòng)物體內(nèi)神經(jīng)酸的獲取成本高、資源少，并且化學(xué)合成神經(jīng)酸產(chǎn)率低、副產(chǎn)物多，難以大量生產(chǎn)[16]，所以，植物神經(jīng)酸是神經(jīng)酸的重要來(lái)源。據(jù)報(bào)道，富含神經(jīng)酸的植物主要有蒜頭果Malania oleifera、銀 扇 草Lunaria annua、海 檀 木Ximenia caffra、元寶楓、琉璃苣Borago officinalis、大麻Cannabis sativa、旱金蓮Tropaeolum majus、美麗旱金蓮T.speciosum、 文 冠 果Xanthoceras sorbifolium等，考慮到植物的適生性以及種子的含油率和含神經(jīng)酸率等因素，在實(shí)際應(yīng)用中，銀扇草和元寶楓被認(rèn)為是生態(tài)位種，其他植物有待進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)[17-18]?，F(xiàn)階段，主要任務(wù)是選育出高含油率、高神經(jīng)酸含量的品種?；蛐揎検谴笠?guī)模生產(chǎn)神經(jīng)酸以及選育高神經(jīng)酸含量品種的一個(gè)良好途徑[18]。通過(guò)研究元寶楓種子油中神經(jīng)酸生物合成的相關(guān)基因或基因互作，找到影響神經(jīng)酸生物合成的遺傳因素是提高神經(jīng)酸生物合成效率的有效策略。

超長(zhǎng)鏈脂肪酸（VLCFAs）的生物合成包括在植物質(zhì)體中從頭合成脂肪酸（FA）和在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜利用4 種酶（KCS、KCR、HCD 和ECR）以油酸（C18:1）開(kāi)始的脂肪酸碳鏈延伸（FAE）2 個(gè)階段[19]。VLCFAs 包括多種植物脂類，如種子油、表皮蠟、鞘膜脂、角質(zhì)以及花粉外表脂類。KCS（β-羥脂酰-CoA 合酶）作為脂肪酸碳鏈延長(zhǎng)反應(yīng)中第1 個(gè)參與反應(yīng)的限速酶，決定FAs 的延伸以及VLCFAs 的數(shù)量和類型。在模式植物擬南芥中，AtKCS1 和AtKCS17 催化C20:0、C20:1、C22:0、C24:0 和C26:0 等5 種VLCFAs 的 伸 長(zhǎng)，而AtKCS18 催 化 合 成C20:0、C20:1、C22:0、C22:1、C24:0 、C24:1 和C26:0，其種子特異性表達(dá)催化籽油中C20:0 和C22:1 的合成；AtKCS2和AtKCS20 催 化 合 成C22:0、C24:0 和C26:0；AtKCS5 和AtKCS6 參 與 合 成C24 ～C28[20-21]。在文冠果中，KCS基因在種胚發(fā)育早期調(diào)控神經(jīng)酸的合成[22]。在蒜頭果中，MoKCS1在果實(shí)膨大期表達(dá)量最高，而此階段也是神經(jīng)酸累積期，表明MoKCS1與蒜頭果神經(jīng)酸合成密切相關(guān)[23]。在甘藍(lán)型油菜中，武玉花[24]發(fā)現(xiàn)僅BnKCS1基因在酵母異源表達(dá)后能產(chǎn)生微量的超長(zhǎng)鏈脂肪酸，且多數(shù)KCS基因存在功能重疊；Xue 等[25]發(fā)現(xiàn)6 個(gè)KCS基因可能是病原菌應(yīng)答基因。在元寶楓的相關(guān)研究中，Ma 等[26]在種子發(fā)育期發(fā)現(xiàn)了3個(gè)與神經(jīng)酸積累密切相關(guān)的KCS基因，同時(shí)發(fā)現(xiàn)MYB 和bZIP 轉(zhuǎn)錄因子也參與神經(jīng)酸調(diào)控，具體機(jī)制仍在研究中。KCS 高度的底物特異性決定了VLCFAs 的最終鏈長(zhǎng)，其表達(dá)量和活性也決定了合成產(chǎn)物的量[18]。從蒜頭果中分離出的MoKCS11基因?qū)20:1 具有底物偏好，但對(duì)芥酸無(wú)底物偏好，因此出現(xiàn)基因已表達(dá)但并無(wú)神經(jīng)酸積累的結(jié)果[27]。另外，在植物中，KCS的表達(dá)決定了VLCFAs 是否在特定細(xì)胞中合成，而其他3 種酶（KCR、ECR、HCD）在植物中無(wú)處不在，無(wú)速率限制[28]。由此可見(jiàn)，KCS基因的表達(dá)以及嚴(yán)格的底物特異性和組織特異性與神經(jīng)酸的生物合成有著直接且密切的聯(lián)系。

本研究中，利用元寶楓轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用生物信息學(xué)分析軟件，鑒定了元寶楓VLCFAs 生物合成的KCS 蛋白，研究了KCS基因在元寶楓根、莖、葉、花4 個(gè)器官中以及授粉后4 個(gè)發(fā)育階段種子中的表達(dá)量，旨在為后續(xù)的KCS基因調(diào)節(jié)神經(jīng)酸生物合成研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料采集和處理

元寶楓樣株種植于陜西省咸陽(yáng)市楊凌區(qū)西北農(nóng)林科技大學(xué)北校區(qū)（108°04′E，34°17′N，海拔520 m），樹(shù)齡約60 a，樹(shù)高約13.5 m，胸徑約25 cm，為長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良、結(jié)實(shí)量大的優(yōu)良單株。2019—2020年的7—11 月，采集其根、莖、葉、花和發(fā)育中的種子（授粉后100、130、160、190 d），每種樣取3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，在液氮中速凍后置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA 提取和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

采用改良的CTAB 法提取元寶楓根、莖、葉、花及發(fā)育各時(shí)期種子的總RNA[29]。依據(jù)mRNAseq 樣品制備試劑盒（Illumina 公司，美國(guó)）構(gòu)建mRNA-seq 文庫(kù)。用Illumina HiSeqTM 2000 測(cè)序法測(cè)定mRNA-seq 基因組文庫(kù)的序列。

1.2.2AceKCS基因家族鑒定

在pfrm 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pfam.xfam.org/）分別輸入PF08392（FAE1/Type Ⅲ polyketide synthaselike protein）、PF08541（3-Oxoacyl-[acyl-carrier protein (ACP)] synthase Ⅲ C terminal）和PF00109（acetyl-CoA C-acetyltransferase）Pfam 號(hào) 下 載 隱馬可夫模型。用于元寶楓KCS基因家族鑒定的蛋白質(zhì)、核苷酸序列文件及基因注釋文件來(lái)自陜西佰艾基因信息科技有限公司。使用Hmmsearch 程序包搜索元寶楓蛋白序列中含以上蛋白保守結(jié)構(gòu)域的蛋白，將得到的基因利用Tbtools、Clustalw、Hmmerbuild、Hmmersearch 等軟件（設(shè)置E值為10-5），篩選出元寶楓KCS基因家族成員。

1.2.3AceKCS基因染色體定位及串聯(lián)重復(fù)基因的Ka/Ks

使用Tbtools V1.0971軟件的Gene location visualize from GFF 程序以及元寶楓基因組注釋文件，得到元寶楓KCS基因在染色體上的分布圖譜。檢測(cè)KCS基因在不同染色體上的出現(xiàn)頻率。在本研究中，KCS基因簇的分配參考用于蒺藜苜蓿Medicago truncatulaNBS 基因家族分析的標(biāo)準(zhǔn)[30]。如果2 個(gè)相鄰的KCS基因在染色體上相隔不超過(guò)250 kb，那么這2 個(gè)基因被認(rèn)為是該簇的基因成員?；谶@個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)基因組中串聯(lián)排列的KCS基因被識(shí)別。然后對(duì)串聯(lián)重復(fù)基因，使用Tbtools 軟件分別計(jì)算每條染色體上串聯(lián)重復(fù)基因的Ka/Ks。

1.2.4AceKCS基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建及順式作用元件預(yù)測(cè)

使用鑒定AceKCS基因家族的方法來(lái)鑒定蒜頭果、文冠果KCS基因家族成員，蒜頭果、文冠果基因組序列從GigaDB（http://gigadb.org/dataset/view/id/100549/File_page/2）數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。甘藍(lán)型油菜KCS基因家族直接使用Xue 等[25]鑒定的58 個(gè)成員。擬南芥KCS基因組數(shù)據(jù)從TAIR 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.arabidopsis.org/）獲 取。使 用Editplus 軟 件將元寶楓等5 個(gè)物種的蛋白質(zhì)序列合并成1 個(gè)Fasta 文件，利用本地muscle 3.8.31 程序?qū)? 個(gè)物種KCS 蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)，將比對(duì)后的文件導(dǎo)入MEGA 7.0[31]進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建。首先使用Muscle 工具進(jìn)行序列比對(duì)，采用最大似然法Maximum Likelihood 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，設(shè)置Bootstrap 為1 000，選擇mtREV 模型，然后利用ITOL（https://itol.embl.de/tree）在線網(wǎng)站進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的美化。

利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測(cè)所有AceKCS基因上游2 000 bp 堿基范圍內(nèi)的順式作用元件。

1.2.5AceKCS基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及保守基序Motif 分析

使用TBtoolsv1.0983 軟件中的Gene structure View 程序，提交元寶楓基因組的發(fā)育樹(shù)文件以及NCBI-CDD 保守域結(jié)果文件，生成基因結(jié)構(gòu)及保守域圖譜。使用MultipleEm-for-Motif-Elicitation（MEME）在線程序（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）上傳元寶楓KCS 蛋白質(zhì)序列文件，得到Motif 圖譜。

1.2.6AceKCS基因編碼蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

使用在線網(wǎng)站（https://swissmodel.expasy.org）預(yù)測(cè)AceKCS基因編碼蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，使用Plant-PLoc server 在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位。

1.2.7AceKCS基因家族成員RNA-seq 分析

采用RT-qPCR 技術(shù)檢測(cè)AceKCS在元寶楓各組織器官中的表達(dá)，根據(jù)目標(biāo)基因的開(kāi)放閱讀框列出RT-qPCR 反應(yīng)的特異性引物。使用SYBR Green試劑盒，在StepOnePlus 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)（ABI）中進(jìn)行實(shí)時(shí)qPCR 反應(yīng)。采用actin house keeping 基因作為內(nèi)部對(duì)照，并對(duì)樣品重復(fù)測(cè)定3 次，通過(guò)計(jì)算每個(gè)基因的RNA 相對(duì)表達(dá)量及歸一化量[32]，得到元寶楓不同組織和不同發(fā)育階段種仁RNA-seq數(shù)據(jù)的FPKM 值，將所有樣本表達(dá)量數(shù)據(jù)以10 為底數(shù)取對(duì)數(shù)，然后使用R 包的pheatmap 生成相應(yīng)的表達(dá)水平熱圖。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 軟件分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。使用R 語(yǔ)言和Origin 2021 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AceKCS 基因家族成員的鑒定及染色體定位

通過(guò)采用生物信息技術(shù)共鑒定到35 個(gè)AceKCS基因家族成員。根據(jù)每個(gè)成員在染色體上的位置，依次命名為AceKC1～AceKC35。使用EXPASY 在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)35 個(gè)AceKCS 蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 AceKCS基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)Table 1 The AceKCS gene encodes the physicochemical properties of proteins

續(xù)表1Continuation of Table1

由表1 可知，AceKCS 蛋白氨基酸數(shù)量在600以內(nèi)，其中最長(zhǎng)的KCS 蛋白質(zhì)為AceKCS30，其氨基酸數(shù)量為571，最短的為AceKCS21，其氨基酸數(shù)量為156。預(yù)測(cè)的相對(duì)分子質(zhì)量為17.62 ～61.85 kDa，其中AceKCS21 的相對(duì)分子質(zhì)量最低，AceKCS9 的相對(duì)分子質(zhì)量最高。等電點(diǎn)為5.91 ～9.60，其中AceKCS26 的等電點(diǎn)最低，AceKCS2 的等電點(diǎn)最高。大多數(shù)AceKCS蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)小于40，較穩(wěn)定，有13 個(gè)AceKCS 蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)等于或大于40，較不穩(wěn) 定， 包 括AceKCS4、AceKCS7、AceKCS8、AceKCS9、AceKCS10、AceKCS12、AceKCS21、AceKCS23、AceKCS25、AceKCS28、AceKCS30、AceKCS31、AceKCS33。另外，AceKCS 蛋白大多具親水性，少數(shù)具疏水性。

AceKCS基因染色體定位結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可見(jiàn)，35 個(gè)AceKCS基因分布于Chr1、Chr2、Chr3、Chr4、Chr5、Chr6、Chr7、Chr8、Chr9、Chr10、Chr12、Chr13 等12 條染色體上。Chr7 染色體上AceKCS基因分布最多，有14 個(gè)，占基因家族成員數(shù)量的40%，共有5 個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因，包括AceKCS1～AceKCS3、AceKCS5～AceKCS6、AceKCS10～AceKCS18、AceKCS19～AceKCS20、AceKCS21～AceKCS23。

圖1 AceKCS基因的染色體定位Fig. 1 Chromosome mapping of AceKCS gene

對(duì)串聯(lián)重復(fù)基因進(jìn)行進(jìn)化分析，其中有10 對(duì)串聯(lián)重復(fù)基因的Ka/Ks大于0.250 且小于1.000，見(jiàn)表2。由表2 可知，AceKCS22和AceKCS23串聯(lián)基因的Ka/Ks為0.943，接近1.000。

表2 AceKCS基因的串聯(lián)重復(fù)基因及其Ka/KsTable 2 The tandem repeats of the AceKCS gene and Ka/Ks

2.2 AceKCS 基因家族成員的系統(tǒng)發(fā)育地位

用于構(gòu)建物種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的5 個(gè)物種的KCS基因共有152 個(gè)，其中元寶楓有35 個(gè)，擬南芥有21 個(gè)，蒜頭果有21 個(gè)，文冠果有17 個(gè)，甘藍(lán)型油菜有58 個(gè)。根據(jù)Joubès 等[20]對(duì)擬南芥KCS基因家族研究結(jié)果，古老的復(fù)制最終產(chǎn)生了8 個(gè)不同的亞組。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析，將152 個(gè)KCS基因分成α、β、γ、η、θ、ζ、δ、ε共8 個(gè)亞組，如圖2 所示。由圖2 可見(jiàn)，AceKCS基因家族成員在β亞組中無(wú)分布，其主要集中在ε亞組（AceKCS10、AceKCS11、AceKCS13～AceKCS18、AceKCS29、AceKCS32）、η亞組（AceKCS2、AceKCS4、AceKCS6、AceKCS9、AceKCS20、AceKCS22、AceKCS23、AceKCS26、AceKCS27、AceKCS30、AceKCS34）、θ亞組（AceKCS1、AceKCS3、AceKCS5、AceKCS12、AceKCS19、AceKCS21、AceKCS33、AceKCS35），且蒜頭果、文冠果、甘藍(lán)型油菜的KCS基因家族成員在亞組中的分布規(guī)律與元寶楓基本一致。

圖2 5個(gè)物種KCS家族基因成員的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree of gene members of the KCS family in five species

2.3 AceKCS 基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件預(yù)測(cè)

可以通過(guò)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件來(lái)預(yù)測(cè)基因的潛在功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控。AceKCS基因中的順式作用元件可分為以下4 類：光響應(yīng)元件、植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)元件、激素響應(yīng)元件及脅迫響應(yīng)元件。AceKCS基因中與植物生長(zhǎng)發(fā)育、激素響應(yīng)及脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式元件如圖3 所示。由圖3 可見(jiàn)：與植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的順式作用元件共有11 個(gè)，包括CCAAT-box、GCN4_motif、HDZip 1、as-1、CAT-box、AAGAA-motif、O2-site、CCGTCC-box、AT-rich element 等，與胚乳特異基因表達(dá)、植物細(xì)胞增殖分化、玉米醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)等有關(guān)；與激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件較多，包括MBSI、CGTCA-motif、TGACG-motif、TGAelement、GARE-motif、AuxRR-core、ABRE、ABRE3a、ABRE4、P-box、TGA-element、ERE 等，與類黃酮、茉莉酸甲酯、水楊酸、乙烯、生長(zhǎng)素、赤霉素、脫落酸等的合成有關(guān)；與脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件有11 個(gè)，包括WUN-motif、ARE、LTR、W box、MBS、GC-motif、MYB、STRE、MYC、WRE3 等，其中MYB 和MYC 數(shù)量最多，其與干旱誘導(dǎo)、低溫響應(yīng)、厭氧誘導(dǎo)及防御反應(yīng)等非生物脅迫有關(guān)。

圖3 AceKCS基因家族成員啟動(dòng)子區(qū)（2000bp）順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果Fig. 3 Cis-acting element prediction of AceKCS gene family in promoter region (2 000 bp)

2.4 AceKCS 基因內(nèi)含子-外顯子、保守域及序列Motif 分析

AceKCS基因主要由CDS（編碼區(qū)）和UTR（非翻譯區(qū)）組成，有14 個(gè)基因僅有CDS 而無(wú)UTR。AceKCS基因家族的基因結(jié)構(gòu)如圖4 所示。利用NCBI 的Batch-CDD 批量搜索AceKCS基因的保守域，根據(jù)每個(gè)保守域的功能描述，可將所有保守域歸納為6 類，分別為3-酮脂酰輔酶a 合成酶（3-ketoacyl-CoA synthase）、MDR、FAE1_CUT1_RppA、Ribosomal_L18_L5e、ACP_syn_ Ⅲ_C、乙酰輔酶C- 乙酰轉(zhuǎn)移酶（acetyl-CoA C-acetyltransferase）。 其 中，F(xiàn)AE1_CUT1_RppA、ACP_syn_ Ⅲ_C、3-ketoacyl-CoA synthase和acetyl-CoA C-acetyltransferase 是KCS基因家族典型的保守域，具有較高的保守性，MDR 屬于中鏈脫氫酶家族，Ribosomal_L18_L5e 是一種核糖體蛋白。此外，將所有基因保守域及Motif 進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)AceKCS1與AceKCS3，AceKCS15與AceKCS17，AceKCS16與AceKCS18，AceKCS10、AceKCS29與AceKCS32的保守域、Motif 出現(xiàn)的位置及長(zhǎng)度具有高度相似性（圖5）。

圖4 AceKCS基因家族保守結(jié)構(gòu)域（左）和基因結(jié)構(gòu)（右）Fig. 4 Conservative structure domain (left) and structure (right) of AceKCS gene family

圖5 AceKCS編碼蛋白質(zhì)Motif分析結(jié)果Fig. 5 Motif analysis of the AceKCS protein

2.5 AceKCS 基因亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

AceKCS基因家族表達(dá)主要集中在質(zhì)膜、葉綠體（圖6），其次在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中表達(dá)，另外在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體、液泡膜以及胞外有少量表達(dá)，在細(xì)胞骨架表達(dá)的僅有AceKCS5；在過(guò)氧化物酶體中表達(dá)的僅有AceKCS1和AceKCS12；α、γ、δ、e、ζ亞組AceKCS基因在質(zhì)膜高表達(dá)，AceKCS33、AceKCS34和AceKCS35在葉綠體高表達(dá)。

圖6 AceKCS基因亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果Fig. 6 Subcellular localization prediction of KCS gene family in A. truncatum

2.6 AceKCS 基因的時(shí)空表達(dá)

為了解AceKCS基因在元寶楓神經(jīng)酸生物合成過(guò)程中的生物學(xué)功能，研究了AceKCS基因在根、莖、葉、花和4 個(gè)不同發(fā)育階段（授粉后100、130、160、190 d）種子中的時(shí)空表達(dá)模式。

剔除掉表達(dá)量為0 的基因，其余基因的表達(dá)模式如圖7 所示。由圖7 可見(jiàn)，有2 個(gè)基因（AceKCS15、AceKCS17）在根、莖、葉、花中表達(dá)量均為0，但在種子中特異性高表達(dá)。

圖7 AceKCS基因在不同組織器官中的表達(dá)Fig. 7 KCS gene expression in roots, steams, leaves flowers and four stages of seeds development in Chinese maple

AceKCS15、AceKCS17在授粉后100、130、160、190 d 4 個(gè)時(shí)期的種子中表達(dá)量的變化趨勢(shì)一致，均為授粉后100 d 時(shí)表達(dá)量最高，之后逐漸降低，如圖8 所示。

圖8 AceKCS15和AceKCS17在不同發(fā)育階段種子中的表達(dá)量Fig. 8 Expression levels of AceKCS15, AceKCS17 in seeds at different development stages

AceKCS15和AceKCS17均位于ε亞組，且具有相同的基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域以及Motif，蛋白質(zhì)3D 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示兩者蛋白結(jié)構(gòu)非常相似，如圖9 所示。

圖9 AceKCS15和AceKCS17編碼蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig. 9 Three-dimensional structure prediction of AceKCS15 and AceKCS17 proteins

此 外， 結(jié) 果 顯 示AceKCS25、AceKCS26、AceKCS27、AceKCS30、AceKCS31、AceKCS35在所有組織中均有表達(dá)且表達(dá)量較高。還有一些基因在所有組織中均有表達(dá)，但在莖、葉、花中表達(dá)量較高，如AceKCS1、AceKCS3、AceKCS6、AceKCS7、AceKCS24。

3 結(jié)論與討論

從元寶楓全基因組中鑒定出35 個(gè)AceKCSs，為便于功能分析，將其分為7 個(gè)亞組，各亞組均含有特異的保守結(jié)構(gòu)域，可能具有不同的超長(zhǎng)鏈脂肪酸延伸特性。AceKCS15和AceKCS17在種子中特異性高表達(dá)且表達(dá)模式一致，推測(cè)其可能是神經(jīng)酸生物合成的關(guān)鍵基因，在神經(jīng)酸生物合成中發(fā)揮著重要作用。

中國(guó)是世界上油料生產(chǎn)大國(guó)，也是第一消費(fèi)大國(guó)。一直以來(lái)，我國(guó)食用植物油資源短缺，60%依賴進(jìn)口[33]，食用油已成為對(duì)外依存度較高的大宗農(nóng)產(chǎn)品，僅次于糧食。由于木本油料物種的高種實(shí)含油率、較強(qiáng)的適應(yīng)性及木本植物油含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，發(fā)展優(yōu)質(zhì)木本油料樹(shù)種是解決我國(guó)糧油安全的有效措施[34]，大力發(fā)展木本食用油產(chǎn)業(yè)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[35-36]。近年來(lái)，隨著帕金森病等神經(jīng)退行性疾病嚴(yán)重影響人們的健康和生活，加之有限的神經(jīng)酸植物資源，以及含神經(jīng)酸植物油的毒性和病理性試驗(yàn)的局限性，元寶楓種仁油神經(jīng)酸分子合成機(jī)制研究成為了熱點(diǎn)[37-42]。

脂肪酸合酶（FAE）是超長(zhǎng)鏈單不飽和脂肪酸生物合成的關(guān)鍵酶，在植物中有2 種類型，即FAE（fatty acid elongase） 和ELO（fatty acid elongation），ELO 型酶多存在于動(dòng)物細(xì)胞中，在植物中較為少見(jiàn)[43]。本研究中也未發(fā)現(xiàn)ELO 型KCS。大量研究結(jié)果已證明FAE/KCS 是一種限速酶，調(diào)節(jié)特定KCS 蛋白的表達(dá)會(huì)影響超長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成。Guo 等[21]和Huai 等[43]也已證實(shí)神經(jīng)酸的生物合成是由KCS 決定的，而不是KCR、HCD 和ECR。在高含量神經(jīng)酸植物資源中大量KCS基因的功能及其影響神經(jīng)酸產(chǎn)生的機(jī)制需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

目前，有關(guān)許多植物中FAE/KCS 基因家族的鑒定和分析已有報(bào)道，如擬南芥[20,44]、甘藍(lán)型油菜[25]、蒜頭果[27]、文冠果[45]、元寶楓[26]等。本研究組前期對(duì)36 個(gè)基因型的元寶楓種質(zhì)種仁進(jìn)行了脂肪酸成分分析，鑒定到高神經(jīng)酸含量和低神經(jīng)酸含量的種質(zhì)，對(duì)鑒定種質(zhì)的表型、脂肪酸含量和神經(jīng)酸含量進(jìn)行了分析，并對(duì)其進(jìn)行了基因組分析和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，初步揭示了AceKCS基因的表達(dá)量與種仁神經(jīng)酸含量正相關(guān)[39,46]。在此基礎(chǔ)上，本研究中進(jìn)一步對(duì)元寶楓KCS基因家族成員進(jìn)行了鑒定與功能分析。由于蒜頭果、文冠果也是我國(guó)特有的含神經(jīng)酸的植物[45]，且關(guān)于其KCS基因家族已有研究報(bào)道，有關(guān)擬南芥、油菜中KCS基因家族的研究比較成熟，因此，本研究中參考蒜頭果、文冠果、擬南芥和甘藍(lán)型油菜4 個(gè)物種的KCS基因相關(guān)研究結(jié)果來(lái)分析元寶楓KCS基因功能。元寶楓KCS基因家族成員被分為7 個(gè)亞組，分別為α、γ、δ、ε、ζ、η和θ，在β亞組中 無(wú)AceKCS、XsKCS、MoKCS，僅 有BnKCS和AtKCS。根據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道，BnKCS22與AtKCS18（FAE1）是直系親屬，在擬南芥中AtKCS18主要負(fù)責(zé)種子油中芥酸的合成[25]，因此推測(cè)β亞組的KCS基因僅負(fù)責(zé)長(zhǎng)鏈脂肪酸合成，而超長(zhǎng)鏈脂肪酸如神經(jīng)酸的合成需要含有ε、η和θ亞組KCS蛋白結(jié)構(gòu)域的基因才能進(jìn)行，ε、η和θ亞組中每個(gè)KCS 蛋白在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)域方面與其他亞組KCS 蛋白有顯著區(qū)別[20]。此外，在蒜頭果中，通過(guò)同源克隆方法從發(fā)育種子中分離出的KCS同源物MoKCS11，在擬南芥種子中特異性表達(dá)，導(dǎo)致約5%的神經(jīng)酸積累[27]，因此推測(cè)神經(jīng)酸生物合成關(guān)鍵KCS基因在ε、η和θ等3 個(gè)亞組中。AceKCS15和AceKCS17在發(fā)育的種仁中特異性高表達(dá)，表明其可能是神經(jīng)酸合成的重要基因。Ma 等[26]通過(guò)對(duì)6 個(gè)發(fā)育階段（授粉后70、85、100、115、145 和180 d）種子中的脂肪酸進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在授粉85 d 后芥酸（C22:1）和神經(jīng)酸（C24:1）開(kāi)始積累，在授粉115 d 后神經(jīng)酸含量基本不變。通過(guò)基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)多數(shù)KCS基因在種子發(fā)育早期表達(dá)量高，之后逐漸降低，而KCS_Atru.Chr.4.2308、KCS_Atru.Chr.4.2307、KCS_Atru.Chr.4.2311基因的表達(dá)量在授粉后70 d時(shí)無(wú)表達(dá)或低表達(dá)，在授粉85 d 后表達(dá)量逐漸升高。將這3 個(gè)基因與AceKCS15和AceKCS17基因進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)KCS_Atru.Chr.4.2307基因與AceKCS15的比對(duì)得分為100%，KCS_Atru.Chr.4.2308和KCS_Atru.Chr.4.2311與AceKCS17同源性較高，進(jìn)一步表明AceKCS15和AceKCS17是神經(jīng)酸生物合成的關(guān)鍵基因。

KCS基因通過(guò)復(fù)制已經(jīng)形成一個(gè)龐大的基因家族，在經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的進(jìn)化后積累了許多突變，導(dǎo)致基因功能的分化和更新，產(chǎn)生了特異性[21]。本研究結(jié)果表明，元寶楓KCS基因家族成員分布于12 條染色體上，共有5 個(gè)串聯(lián)重復(fù)事件，其中Chr7 上有3 個(gè)串聯(lián)重復(fù)事件，表明重復(fù)序列是元寶楓基因組的重要組成部分，也是其基因組進(jìn)化的基礎(chǔ)。對(duì)串聯(lián)重復(fù)基因進(jìn)行進(jìn)化分析，找到21 個(gè)串聯(lián)基因?qū)?，其中?0 個(gè)串聯(lián)基因?qū)Φ腒a/Ks大于0.25 而小于1.00，其余均小于0.25，說(shuō)明KCS基因在進(jìn)化過(guò)程中受到了強(qiáng)烈的純化選擇[47-48]。Guo 等[21]通過(guò)鑒定26 種植物的475 個(gè)KCS基因家族成員并分析KCS基因進(jìn)化史也證明了這一觀點(diǎn)。另外，AceKCS22和AceKCS23這2 個(gè)基因的Ka/Ks為0.943，已接近1.000，表明KCS基因在片段重復(fù)的過(guò)程中不斷進(jìn)化。

特異性啟動(dòng)子是KCS基因在油料植物中過(guò)表達(dá)后提高神經(jīng)酸含量的關(guān)鍵途徑[43]。在啟動(dòng)子和內(nèi)含子區(qū)域存在的順式元件模式?jīng)Q定了基因表達(dá)的水平[49]。本研究中通過(guò)KCS基因啟動(dòng)子分析，發(fā)現(xiàn)在基因啟動(dòng)子區(qū)有許多光響應(yīng)元件、植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)元件、植物激素響應(yīng)元件和植物脅迫響應(yīng)元件。植物激素響應(yīng)元件中數(shù)量較多的有與茉莉酸甲酯MeJA 合成有關(guān)的CGTCA-motif、TGACG-motif，與水楊酸SA 合成有關(guān)的TCA、TCA-element，與赤霉素GA 合成有關(guān)的P box，與脫落酸ABA 合成有關(guān)的ABRE、ABRE3a、ABRE4。據(jù)報(bào)道，植物激素作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫[50]。生物膜是植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫的主要屏障，而脂肪酸是構(gòu)成生物膜的必要成分，且膜中不飽和脂肪酸的比例與植物耐低溫等非生物脅迫的能力密切相關(guān)。例如：在植物受到非生物脅迫時(shí)，脂肪酸脫氫酶FAD 催化亞麻酸形成，并使其轉(zhuǎn)變?yōu)檐岳蛩?，從而提高植物抗冷性[51]；另外，水楊酸可以誘導(dǎo)FAD 基因的表達(dá)以維持細(xì)胞膜脂肪酸不飽和度，提高細(xì)胞膜在低溫下的穩(wěn)定性[52]。脅迫響應(yīng)元件較多的有MYB、MYC、APE、LTR。表明與植物激素及抗旱相關(guān)途徑可能通過(guò)直接或間接結(jié)合這些順式作用元件來(lái)調(diào)節(jié)AceKCS轉(zhuǎn)錄物。MYB 轉(zhuǎn)錄因子參與表皮生長(zhǎng)物的積累[53]，且其與bZIP 轉(zhuǎn)錄因子在超長(zhǎng)鏈單不飽和脂肪酸的生物合成中發(fā)揮著重要作用[26]。MYC 是bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)亞家族，在植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控、種子生產(chǎn)、蛋白質(zhì)積累以及次生代謝物積累等方面發(fā)揮著重要作用[54]。本研究結(jié)果表明，元寶楓KCS基因的表達(dá)及超長(zhǎng)鏈脂肪酸的積累是在植物受到非生物脅迫時(shí)由許多脅迫響應(yīng)元件及激素響應(yīng)元件共同調(diào)控，神經(jīng)酸是該通路中的一種產(chǎn)物，挖掘關(guān)鍵KCS基因是研究神經(jīng)酸的累積規(guī)律及變化機(jī)制的基礎(chǔ)。本研究中未對(duì)元寶楓關(guān)鍵KCS基因功能進(jìn)行驗(yàn)證，后續(xù)將通過(guò)關(guān)聯(lián)性分析及異源表達(dá)等驗(yàn)證神經(jīng)酸累積關(guān)鍵KCS基因功能。