郭 印，戴習(xí)林

(1.上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海 201600； 2.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306； 3.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；4.水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心 上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306)

美洲鰣(Alosasapidissima)又名美洲西鯡，與中國(guó)的鰣(Tenualosareevesii)同屬鰣亞科，二者外部形態(tài)接近，美洲鰣具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]，市場(chǎng)價(jià)格較高，養(yǎng)殖面積日益擴(kuò)大[2]。鹽度是影響魚類正常生理活動(dòng)與分布的重要環(huán)境因子，對(duì)魚類的生理生化、離子細(xì)胞大小和數(shù)量等指標(biāo)有重要影響[3]。美洲鰣具有典型的溯河洄游特征[4]，對(duì)鹽度的適應(yīng)性相對(duì)較強(qiáng)，親本培育中也常利用鹽度升降處理模擬美洲鰣的洄游生境[5]，然而在鹽度的急性脅迫下美洲鰣也會(huì)出現(xiàn)中毒癥狀[6]，掌握急性鹽度變化下美洲鰣的滲透壓調(diào)節(jié)方式，對(duì)人工養(yǎng)殖過(guò)程中控制適宜的鹽度具有重要的意義[7]。近年來(lái)，眾多學(xué)者研究了鹽度變化對(duì)不同魚類生理的影響以及魚類對(duì)鹽度的適應(yīng)機(jī)制[8-16]，發(fā)現(xiàn)魚類血液滲透壓、Na+/K+-ATP酶活性、抗氧化酶活性等指標(biāo)在研究魚類鹽度脅迫下滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制和生理變化的過(guò)程中具有重要的意義，然而目前對(duì)急性鹽度下美洲鰣的相關(guān)研究仍相對(duì)較少。筆者以幼魚階段的美洲鰣為研究對(duì)象，探討不同鹽度對(duì)美洲鰣幼魚的血清滲透壓、Na+/K+-ATP酶活性和過(guò)氧化氫酶活性的急性脅迫效應(yīng)，以期為美洲鰣對(duì)鹽度突變的適應(yīng)性研究提供理論依據(jù)，并為生產(chǎn)中通過(guò)進(jìn)行鹽度調(diào)節(jié)從而調(diào)控美洲鰣的生長(zhǎng)發(fā)育、提高存活率以及促進(jìn)美洲鰣養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用美洲鰣幼魚購(gòu)自上海申漕特種水產(chǎn)養(yǎng)殖公司，體長(zhǎng)(6.3±0.3) cm，體質(zhì)量(3.3±0.5) g。按60尾/m3分別置于500 L圓形塑料桶淡水中進(jìn)行暫養(yǎng)，塑料桶內(nèi)事先鋪設(shè)孔徑550～700 μm篩絹網(wǎng)，便于后期轉(zhuǎn)移試驗(yàn)魚，使用散氣石不間斷充氣。試驗(yàn)期間投喂浙江明輝牌海水魚配合飼料(粒徑1.8 mm，粗蛋白含量44%)，每日8：00和16：00各投喂1次，投飼率1%～2%，以1 h攝食完為準(zhǔn)。暫養(yǎng)期間測(cè)得溶解氧7.63～7.89 mg/L，水溫29.0～32.2 ℃，每日18：00虹吸去除試驗(yàn)桶底部雜質(zhì)糞便。暫養(yǎng)15 d后，選取規(guī)格相近的健康個(gè)體進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)容器為500 L圓形塑料桶，試驗(yàn)用水由曝氣24 h后的自來(lái)水與海鹽按比例調(diào)配制成，試驗(yàn)前用鹽度計(jì)(YSI30型)進(jìn)行校準(zhǔn)。有研究表明，美洲鰣仔魚24 h全致死鹽度(LC100)為30，96 h零致死鹽度(LC0)為20[6]，故本試驗(yàn)設(shè)淡水為對(duì)照組，另設(shè)鹽度5、10、20試驗(yàn)組，各組均設(shè)3個(gè)平行。每個(gè)平行投放試驗(yàn)魚30尾，每組共計(jì)90尾。試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，各組水溫為(30±2) ℃、溶解氧為(7.5±0.3) mg/L、pH為7.6±0.4。用篩絹網(wǎng)將美洲鰣幼魚自淡水中取出，直接放入各鹽度組(含對(duì)照組)水體中。

試驗(yàn)期間停止投喂，在0、6、12、24、48、96 h分別從每組中隨機(jī)挑取9尾(每個(gè)平行3尾)，使用10 mg/L丁香油麻醉，用1 cm3注射器心臟采血，每3尾魚所取血液作為1個(gè)測(cè)定樣本，混合后置于離心管分裝后靜置15 min，待血液分層后以 3500 r/min離心(離心半徑10 cm)5 min，所得血清用于滲透壓測(cè)定。抽血后快速將魚右側(cè)第二鰓弓上鰓絲取下，以4 ℃雙蒸水沖洗3次，去除污物，每3尾魚所取鰓絲混合作為1個(gè)樣本，置于5 mL無(wú)菌離心管中，轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱內(nèi)保存用于測(cè)定Na+/K+-ATP酶活性。取鰓絲后立即進(jìn)行解剖并挑取肝臟組織，3尾魚肝臟混合后作為1個(gè)測(cè)定樣本，清洗后置于超低溫冰箱保存，用于過(guò)氧化氫酶活性的測(cè)定。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 血清滲透壓的測(cè)定

美洲鰣幼魚的血清滲透壓使用冰點(diǎn)滲透壓儀(Vapro5600型)測(cè)定，單位：1 mOsm/kg表示1 kg 溶劑中含1 mmol溶質(zhì)。

1.3.2 鰓Na+/K+-ATP酶活性的測(cè)定

將鰓絲在勻漿介質(zhì)(0.01 mol/L蔗糖，0.1 mmol/L EDTA-2Na，0.01 mol/L Tris-HCl，0.8% NaCl，pH 7.4)中剪碎，使用勻漿器(PRO250型)15 000 r/min制成勻漿，4 ℃下2500 r/min低溫離心(離心半徑10 cm)5 min后取上清液[16]，Na+/K+-ATP酶活性的測(cè)定與計(jì)算按照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的Na+/K+-ATP酶試劑盒說(shuō)明書操作。

1.3.3 肝臟過(guò)氧化氫酶活性的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取肝臟組織質(zhì)量，在勻漿介質(zhì)(0.01 mol/L蔗糖，0.1 mmol/L EDTA-2Na，0.01 mol/L Tris-HCl，0.8% NaCl，pH 7.4)中剪碎，使用勻漿器(PRO250型)15 000 r/min制成勻漿，4 ℃下3000 r/min低溫離心(離心半徑10 cm)5 min后取上清液[17]，按照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的過(guò)氧化氫酶試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)Excel 2019與SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理和分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用方差分析檢驗(yàn)鹽度對(duì)測(cè)定指標(biāo)影響的顯著性，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性鹽度脅迫下美洲鰣幼魚的滲透壓變化

急性鹽度脅迫下美洲鰣幼魚血清滲透壓的變化情況見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，鹽度處理對(duì)美洲鰣幼魚血清滲透壓有顯著影響(P<0.05)。從鹽度脅迫的時(shí)間過(guò)程來(lái)看，各鹽度組滲透壓隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先快速升高后逐漸降低的趨勢(shì)，其中鹽度20試驗(yàn)組在6 h時(shí)達(dá)到最大值[(265.4±4.8) mOsm/kg]，而鹽度5試驗(yàn)組、鹽度10試驗(yàn)組在12 h時(shí)達(dá)到最大值[(262.3±2.8) mOsm/kg、(266.0±3.1) mOsm/kg]。24 h后鹽度5、10、20試驗(yàn)組幼魚血清滲透壓隨時(shí)間變化呈下降趨勢(shì)并逐漸穩(wěn)定。從各時(shí)間點(diǎn)比較4組不同鹽度處理的滲透壓變化，結(jié)果顯示，處理6 h時(shí)各試驗(yàn)組幼魚血清滲透壓隨鹽度的升高均出現(xiàn)上升，12～96 h各時(shí)間點(diǎn)基本表現(xiàn)出鹽度高的處理組其滲透壓較高，且與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。鹽度5試驗(yàn)組美洲鰣幼魚血清滲透壓在6、48 h時(shí)顯著低于鹽度20試驗(yàn)組(P<0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明：提高鹽度處理時(shí)，美洲鰣幼魚可以通過(guò)升高自身的滲透壓以適應(yīng)外界的高鹽度環(huán)境；美洲鰣幼魚對(duì)鹽度的脅迫反應(yīng)較強(qiáng)烈，鹽度差越大，其滲透壓的應(yīng)激反應(yīng)越快并越強(qiáng)烈，隨后會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，或趨于穩(wěn)定。

2.2 急性鹽度脅迫下美洲鰣幼魚Na+/K+-ATP酶活性變化

鹽度處理對(duì)美洲鰣幼魚Na+/K+-ATP酶活性影響顯著(P<0.05)(圖2)。從鹽度脅迫的時(shí)間過(guò)程來(lái)看，6 h后各試驗(yàn)組Na+/K+-ATP酶活性顯著下降，12～24 h各試驗(yàn)組Na+/K+-ATP酶活性總體趨于平緩，48 h各試驗(yàn)組Na+/K+-ATP酶活性總體呈上升趨勢(shì)，96 h鹽度5、10試驗(yàn)組繼續(xù)上升，鹽度20試驗(yàn)組出現(xiàn)下降。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中試驗(yàn)組Na+/K+-ATP酶活性明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。從各時(shí)間點(diǎn)比較4個(gè)不同鹽度處理的Na+/K+-ATP酶活性，結(jié)果顯示，6 h時(shí)鹽度10、20試驗(yàn)組顯著低于鹽度5試驗(yàn)組(P<0.05)，12～48 h各試驗(yàn)組無(wú)顯著性差異，96 h時(shí)鹽度20試驗(yàn)組顯著低于其他2個(gè)試驗(yàn)組(P<0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明，美洲鰣對(duì)急性鹽度的脅迫反應(yīng)較強(qiáng)烈，Na+/K+-ATP酶活性出現(xiàn)了較大幅度下降，且鹽度差越小，其Na+/K+-ATP酶活性出現(xiàn)上升趨勢(shì)所用時(shí)間越短。

圖1 急性鹽度脅迫對(duì)美洲鰣幼魚血清滲透壓的影響Fig.1 Effect of acute salinity stress on serum osmotic pressure of juvenile American shad A. sapidissima相同時(shí)間不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同.Means with different letters at the same time are significant difference among treatments (P<0.05)，et sequentia.

圖2 急性鹽度脅迫對(duì)美洲鰣幼魚鰓絲Na+/K+-ATP酶活性的影響Fig.2 Effect of acute salinity stress on Na+/K+-ATP enzyme activity in gill filaments of juvenile American shad A. sapidissima

2.3 急性鹽度脅迫下美洲鰣幼魚過(guò)氧化氫酶活性變化

從鹽度脅迫的時(shí)間過(guò)程來(lái)看：鹽度5試驗(yàn)組美洲鰣幼魚過(guò)氧化氫酶活性在6 h時(shí)升高，12～24 h維持相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)；鹽度10試驗(yàn)組酶活性在6 h時(shí)未出現(xiàn)明顯變化，12～24 h出現(xiàn)下降(圖3)；兩組至48 h均達(dá)到峰值，96 h出現(xiàn)下降；鹽度20試驗(yàn)組幼魚酶活性在試驗(yàn)期間持續(xù)下降。從各時(shí)間點(diǎn)看：6～12 h，鹽度5試驗(yàn)組過(guò)氧化氫酶活性顯著高于其他組(P<0.05)，鹽度10試驗(yàn)組6 h時(shí)與對(duì)照組無(wú)顯著差異，12 h時(shí)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；24～48 h時(shí)各鹽度組過(guò)氧化氫酶活性差異顯著(P<0.05)，24 h時(shí)酶活性依次為對(duì)照組>鹽度5試驗(yàn)組>鹽度20試驗(yàn)組>鹽度10試驗(yàn)組，48 h時(shí)酶活性大小為鹽度5試驗(yàn)組>鹽度10試驗(yàn)組>對(duì)照組>鹽度20試驗(yàn)組，鹽度20試驗(yàn)組顯著低于其他組(P<0.05)；96 h時(shí)各試驗(yàn)組過(guò)氧化氫酶活性均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其中鹽度5試驗(yàn)組顯著高于鹽度10、20試驗(yàn)組(P<0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明，急性鹽度脅迫對(duì)美洲鰣幼魚過(guò)氧化氫酶活性有較強(qiáng)的影響，表現(xiàn)為鹽度變化越大該酶活性越易受到抑制。

3 討 論

3.1 急性鹽度脅迫對(duì)美洲鰣幼魚血清滲透壓的影響

高鹽度環(huán)境下幼魚需消耗一定能量來(lái)維持體內(nèi)滲透壓，直接影響攝入營(yíng)養(yǎng)的分配和餌料利用率，會(huì)對(duì)魚類的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響[18-19]。魚類滲透壓調(diào)節(jié)主要通過(guò)腎臟、鰓等器官完成[20]，幼魚由淡水進(jìn)入高鹽度環(huán)境，其血清滲透壓低于水體滲透壓，幼魚會(huì)大量吞飲鹽水同時(shí)攝入大量離子，這些離子通過(guò)腸道吸收進(jìn)入血液，血清中離子濃度增高，滲透壓也隨之增高。在高滲環(huán)境中魚類的滲透壓調(diào)節(jié)主要通過(guò)大量飲水，鰓絲上的氯細(xì)胞排出大量的Na+，

圖3 急性鹽度脅迫對(duì)美洲鰣幼魚過(guò)氧化氫酶活性的影響Fig.3 Effect of acute salinity stress on catalase activity of juvenile American shad A. sapidissima

腎臟排出部分離子與極少量的水分來(lái)維持體內(nèi)的低滲透壓[11,14]。魚類對(duì)鹽度的適應(yīng)過(guò)程分兩個(gè)階段：一是鹽度升高或降低后，短期內(nèi)魚類血清滲透壓迅速變化的階段；二是滲透壓逐漸恢復(fù)穩(wěn)定的階段[21]。在本試驗(yàn)中，美洲鰣幼魚的滲透調(diào)節(jié)在鹽度5、10、20環(huán)境中明顯升高，24 h前為幼魚對(duì)鹽度變化的適應(yīng)階段。有研究表明，硬骨魚類血清滲透壓會(huì)隨鹽度呈正相關(guān)的變化[11]。本試驗(yàn)中，各試驗(yàn)組美洲鰣幼魚血清滲透壓隨鹽度升高也相應(yīng)升高，并出現(xiàn)波動(dòng)變化，24 h后，各處理組美洲鰣幼魚血清滲透壓穩(wěn)定在246.0～255.3 mOsm/kg，并隨著時(shí)間推移緩慢降低。96 h時(shí)各鹽度組血清滲透壓均有恢復(fù)正常的趨勢(shì)，與施兆鴻等[16]結(jié)論一致。說(shuō)明美洲鰣幼魚在一定范圍內(nèi)的鹽度突變下，可以通過(guò)自身滲透壓調(diào)節(jié)去適應(yīng)環(huán)境變化，并表現(xiàn)為鹽度差越大，其滲透壓的應(yīng)激反應(yīng)越強(qiáng)烈，隨后會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸趨于穩(wěn)定，對(duì)鹽度有較強(qiáng)的適應(yīng)能力。

3.2 急性鹽度脅迫對(duì)美洲鰣幼魚Na+/K+-ATP酶活性的影響

鰓是魚類進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)和離子運(yùn)輸?shù)闹饕鞴?，鰓上皮氯細(xì)胞中含有大量Na+/K+-ATP酶，該酶是魚體氯細(xì)胞與外界離子轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵酶，也是廣鹽性魚類參與滲透調(diào)節(jié)的一項(xiàng)重要指標(biāo)[22]。Na+/K+-ATP酶在環(huán)境鹽度發(fā)生變化時(shí)，魚類鰓絲Na+/K+-ATP酶活性會(huì)升高或降低，這是鰓對(duì)體內(nèi)外Na+和Cl-等離子運(yùn)輸需要的適應(yīng)機(jī)制[23-25]。

廣鹽性魚類的Na+/K+-ATP酶活性一般隨鹽度變化呈“U”型變化，在等滲點(diǎn)附近Na+/K+-ATP酶活性最低[9]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，24 h內(nèi)試驗(yàn)組美洲鰣幼魚鰓絲Na+/K+-ATP酶活性均隨鹽度的升高而降低，在24 h時(shí)酶活性達(dá)到最低，鹽度5試驗(yàn)組、鹽度10試驗(yàn)組幼魚鰓絲Na+/K+-ATP酶活性48、96 h持續(xù)上升，總體呈“U”型分布，并表現(xiàn)為鹽度差越小，酶活性出現(xiàn)上升趨勢(shì)所用時(shí)間越短。鹽度20試驗(yàn)組幼魚的Na+/K+-ATP酶活性在48 h上升，96 h下降，未呈現(xiàn)“U”型變化，說(shuō)明鹽度20的急性變化對(duì)幼魚的滲透調(diào)節(jié)脅迫要大于低鹽度環(huán)境[13]。由于鰓絲Na+/K+-ATP酶不是魚類滲透壓調(diào)節(jié)的唯一要素，故本試驗(yàn)中鹽度20試驗(yàn)組酶活性上升受阻，可能與鹽度脅迫下美洲鰣幼魚需要時(shí)間去啟動(dòng)其他調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)，具體機(jī)理待進(jìn)一步研究。

3.3 急性鹽度脅迫對(duì)美洲鰣幼魚過(guò)氧化氫酶活性的影響

過(guò)氧化氫酶在魚體清除脅迫過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧自由基環(huán)節(jié)中起重要作用[19,26]，過(guò)氧化氫酶能防止代謝及超氧化物歧化酶轉(zhuǎn)化過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫對(duì)機(jī)體造成傷害，以抵御鹽脅迫，防止生理應(yīng)激[27]。當(dāng)鹽度發(fā)生變化時(shí)，魚類必然要經(jīng)歷滲透調(diào)節(jié)等一系列過(guò)程[28]，需要消耗大量能量，加速體內(nèi)新陳代謝，引發(fā)體內(nèi)抗氧化酶的響應(yīng)，以應(yīng)對(duì)自由基對(duì)機(jī)體的脅迫。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，大菱鲆(Scophthalmusmaximus)幼魚[29]、條石鯛(Oplegnathusfasciatus)幼魚[30]、施氏鱘(Acipenserschrenckii)[12]在不同鹽度脅迫下體內(nèi)過(guò)氧化氫酶活性均會(huì)發(fā)生適應(yīng)性變化，來(lái)消除鹽度突變下產(chǎn)生的多余自由基以維持機(jī)體的正常功能。本試驗(yàn)中，鹽度5試驗(yàn)組、鹽度10試驗(yàn)組的過(guò)氧化氫酶活性變化趨勢(shì)一致，其變化幅度與鹽度有著密切的關(guān)系，表現(xiàn)為先升后降，說(shuō)明急性鹽度的脅迫對(duì)幼魚酶活性有較強(qiáng)的影響，其中鹽度5試驗(yàn)組過(guò)氧化氫酶活性響應(yīng)時(shí)間較鹽度10試驗(yàn)組快，表明美洲鰣較為適應(yīng)鹽度5的環(huán)境變化。鹽度10試驗(yàn)組酶活性響應(yīng)慢的原因可能為鹽度脅迫導(dǎo)致美洲鰣幼體內(nèi)產(chǎn)生并堆積較多活性氧自由基，過(guò)氧化氫酶活性需要一定時(shí)間誘導(dǎo)緩慢升高來(lái)減少自由基對(duì)細(xì)胞的傷害[31]，這與譚春明等[32]研究結(jié)果較為一致。有研究表明，魚類在過(guò)高鹽度脅迫下會(huì)生成大量活性氧，過(guò)量的活性氧在體內(nèi)往往表現(xiàn)為毒性分子，易導(dǎo)致機(jī)體受氧化脅迫，引起細(xì)胞氧化損傷，從而破壞生理機(jī)能[33-35]。本試驗(yàn)中，鹽度20試驗(yàn)組過(guò)氧化氫酶活性長(zhǎng)時(shí)間顯著低于對(duì)照組，鹽度變化越大該酶活性越易受到抑制，可能在鹽度20的急性脅迫下，幼魚未能較好地適應(yīng)環(huán)境，體內(nèi)氧自由基不斷積累，抗氧化酶的活性不足以抑制細(xì)胞內(nèi)的氧化損傷，導(dǎo)致清除自由基的能力下降，從而使抗氧化酶活性降低[36]。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，美洲鰣幼魚對(duì)鹽度適應(yīng)能力較強(qiáng)，可以通過(guò)機(jī)體的一系列生理調(diào)節(jié)，較好地適應(yīng)鹽度5及鹽度10的急性脅迫。人工養(yǎng)殖馴化過(guò)程中應(yīng)控制水體鹽度突變?cè)?0以下，且鹽度變化幅度越小美洲鰣可越快適應(yīng)水體環(huán)境。