張成賽，尹文林，李 明，曹 錚，藺凌云，潘曉藝，沈錦玉，王春鳳，姚嘉赟,，楊桂連

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，吉林省動(dòng)物微生態(tài)制劑工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省魚(yú)類(lèi)健康與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 湖州 313001； 3.金華市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江 金華，321051)

大口黑鱸(Micropterussalmoides)又稱加州鱸，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種，其肉質(zhì)肥美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，肌間刺相對(duì)較少，深受人們的喜愛(ài)，因此在我國(guó)南北地區(qū)均有養(yǎng)殖，2019年全國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量為4.778×105t，經(jīng)濟(jì)效益很好[1-5]。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度的不斷提高，以及養(yǎng)殖環(huán)境的不斷惡化，近年來(lái)大口黑鱸養(yǎng)殖過(guò)程中不斷暴發(fā)各種疾病，而在養(yǎng)殖階段主要病害是大口黑鱸的“爛身病”，其病原為虹彩病毒科蛙病毒屬(Ranavirus)的大口黑鱸虹彩病毒(Largemouthbassranavirus，LMBV)[6-9]，據(jù)調(diào)查該病的發(fā)病率可達(dá)80%以上，最高死亡率可達(dá)60%以上，給養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是制約該品種養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大瓶頸[10-12]。但目前對(duì)該病沒(méi)有有效的治療藥物。藥物治療會(huì)帶來(lái)藥物殘留、環(huán)境污染、耐以及食品安全等問(wèn)題，而免疫防治是一項(xiàng)切實(shí)可行的方案。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)大口黑鱸免疫學(xué)的基礎(chǔ)研究相對(duì)較少，而關(guān)于鱸魚(yú)免疫球蛋白的研究則更少。張福淼等[13-14]分離純化了花鱸(Lateolabraxmaculatus)血清免疫球蛋白并對(duì)其特性進(jìn)行了分析，劉悅等[15]克隆表達(dá)了花鱸免疫球蛋白的重鏈基因，馮娟等[16]對(duì)尖吻鱸(Latescalcarifer)的血清免疫球蛋白進(jìn)行了分離純化和特性分析。目前尚未見(jiàn)大口黑鱸免疫球蛋白單克隆抗體研究方面的報(bào)道，而其是評(píng)價(jià)抗體效價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)，因此筆者利用親和層析等方法制備大口黑鱸血清免疫球蛋白，通過(guò)雜交瘤篩選技術(shù)制備其單克隆抗體，并利用此單克隆抗體建立檢測(cè)大口黑鱸血清抗體的酶聯(lián)免疫吸附方法，為大口黑鱸病害的早期診斷監(jiān)測(cè)和免疫應(yīng)答水平的測(cè)定提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

大口黑鱸購(gòu)自浙江省湖州市南潯某養(yǎng)殖場(chǎng)，對(duì)其進(jìn)行大口黑鱸虹彩病毒、彈狀病毒以及諾卡氏菌(Nocardia)檢測(cè)，結(jié)果均為陰性；6—8周齡雌性BALB/c小鼠購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院；小鼠的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.2 主要試劑

RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司；8-氮鳥(niǎo)嘌呤、HT培養(yǎng)基、HAT培養(yǎng)基、聚乙二醇、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購(gòu)自Sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠免疫球蛋白G購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Protein A HP柱購(gòu)自GE公司；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 免疫球蛋白的分離純化

取體質(zhì)量(485.6±13.2) g大口黑鱸尾靜脈采血，37 ℃放置1 h后，4 ℃放置過(guò)夜，離心，取上清液。參考文獻(xiàn)[17]的方法，用硫酸銨沉淀法和親和層析法分離純化免疫球蛋白，并經(jīng)透析后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，所得免疫球蛋白置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 單克隆抗體的制備

取制備的純化免疫球蛋白50 μg，與等體積的弗氏完全佐劑混勻乳化后對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射免疫，首免后14 d和28 d取純化的免疫球蛋白，與弗氏不完全佐劑混合乳化后繼續(xù)免疫2次，并于融合前3 d加強(qiáng)免疫1次。于融合前兩周復(fù)蘇小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0，置于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中，在培養(yǎng)液中加入8-氮鳥(niǎo)嘌吟，連續(xù)處理3次，使小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0對(duì)HAT培養(yǎng)液更加敏感。融合前1 d傳代1次，使融合當(dāng)天的骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。參考文獻(xiàn)[18]的方法，取小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，取融合細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)，篩選時(shí)以純化的大口黑鱸免疫球蛋白作為包被抗原，將經(jīng)3次測(cè)定均為陽(yáng)性的細(xì)胞孔利用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，待克隆化至陽(yáng)性率為100%定株保存。將定株的雜交瘤細(xì)胞腹腔接種于BALB/c小鼠，14 d后采集腹水，離心收集上清液即為制備的腹水。

1.5 腹水效價(jià)的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[19]利用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定免疫球蛋白的腹水抗體效價(jià)。簡(jiǎn)而言之，以純化的大口黑鱸免疫球蛋白進(jìn)行包被，包被質(zhì)量濃度為2 μg/mL，4 ℃包被過(guò)夜后，用2%牛血清白蛋白—磷酸鹽吐溫緩沖液在37 ℃恒溫封閉1 h，再用磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次后(每次5 min)，加入采集的經(jīng)抗體稀釋液梯度稀釋的腹水抗體，同上封閉、洗滌3次后每孔加入100 μL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠免疫球蛋白G(1∶2×104)，再進(jìn)行封閉洗滌操作后，每孔加入底物顯色液50 μL，37 ℃避光15 min后加入終止液，37 ℃ 15 min后，測(cè)定各稀釋組的450 nm光密度[D(450 nm)]，以P/N比值≥2.1時(shí)單克隆抗體的最大稀釋度即為其抗體效價(jià)。測(cè)定過(guò)程中以陰性小鼠血清作為陰性對(duì)照，以抗體稀釋液作為空白對(duì)照，以融合小鼠血清作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.6 單克隆抗體的特性研究

單克隆抗體的亞級(jí)分類(lèi)按照單克隆抗體亞型分析試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：將雜交瘤培養(yǎng)上清液做100倍稀釋，取150 μL加入反應(yīng)管，室溫30 s后振蕩使乳膠顆粒重懸，將測(cè)試條帶黑色端向下插入反應(yīng)管，待陽(yáng)性對(duì)照條帶顯現(xiàn)即可讀取結(jié)果。靈敏度的測(cè)定以2 μg/mL的免疫球蛋白為起始質(zhì)量濃度進(jìn)行倍比稀釋，之后按照1.5的方法進(jìn)行測(cè)定，以其能測(cè)定抗體的最低包被質(zhì)量濃度為靈敏度?？贵w的特異性測(cè)定參考文獻(xiàn)[17]的酶聯(lián)免疫吸附法。收集大口黑鱸、鯽(Carassiusauratus)、花鱸、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、黃顙魚(yú)(Pelteobagrusfulvidraco)等血清為測(cè)定抗原，將待測(cè)魚(yú)血清1000倍稀釋后包被于酶標(biāo)板，一抗為1000倍稀釋的單克隆抗體腹水，其余步驟同1.5，進(jìn)行抗體特異性檢測(cè)。

1.7 蛋白免疫印跡分析

取純化后的免疫球蛋白通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳采用不連續(xù)緩沖液垂直電泳系統(tǒng)，濃縮膠為50 g/L,分離膠為120 g/L。電泳及蛋白免疫印跡參考《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》[18]進(jìn)行。一抗為1∶1000稀釋的抗體腹水，二抗為1∶2000的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠抗體。

1.8 免疫大口黑鱸虹彩病毒抗體效價(jià)的測(cè)定

隨機(jī)選取120尾體質(zhì)量為(20.5±2.8) g的大口黑鱸(經(jīng)隨機(jī)檢測(cè)，不攜帶大口黑鱸虹彩病毒)進(jìn)行分組，每組30尾，共分為3組。大口黑鱸虹彩病毒滅活疫苗設(shè)置高含量組和低含量組，用Reed-Muench法計(jì)算，高含量組病毒含量≥2.6×108/mL半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)，低含量組病毒含量≥2.6×107/mL半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量，待接有大口黑鱸虹彩病毒的細(xì)胞病變達(dá)到約90%時(shí)收獲病毒，-80 ℃反復(fù)凍融3次，離心取上清液用0.2%甲醛37 ℃滅活72 h，免疫佐劑為20%鋁膠佐劑，對(duì)照組為含相同劑量的甲醛和鋁膠佐劑的1640培養(yǎng)基(含2%胎牛血清、1%雙抗)，每尾試驗(yàn)魚(yú)腹腔注射0.2 mL。在免疫后7、14、21、28、35、42、49、56、63、70 d和84 d于每組試驗(yàn)組隨機(jī)抽取3尾魚(yú)，采集血清，測(cè)定其中的抗體效價(jià)。

2 結(jié) 果

2.1 大口黑鱸免疫球蛋白的分離純化

利用親和層析和硫酸銨沉淀法制備大口黑鱸血清免疫球蛋白，經(jīng)測(cè)定其質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL。經(jīng)SDS-PAGE鑒定后可知，大口黑鱸血清免疫球蛋白的重鏈大小為72 ku(圖1)。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，A9E7和C9B9兩株單克隆抗體均能特異性地識(shí)別大口黑鱸血清的免疫球蛋白M。

2.2 單克隆抗體效價(jià)及特性

經(jīng)過(guò)3次亞克隆最終獲得2株分泌穩(wěn)定的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，分別標(biāo)記為A9E7和C9B9，將二者分別制備腹水，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)后確定二者的抗體效價(jià)分別為2.187×106和7.29×105(表1)?？贵w分型結(jié)果表明，A9E7和C9B9均為IgG2a。

抗體A9E7和C9B9的檢測(cè)靈敏度分別為10 ng和20 ng?？贵w特異性結(jié)果表明，A9E7和C9B9均與大口黑鱸血清發(fā)生反應(yīng)，僅A9E7能與花鱸血清能發(fā)生交叉反應(yīng)，僅C9B9能與鱖(Sinipercachuatsi)血清能發(fā)生較弱的交叉反應(yīng)，而黃顙魚(yú)、翹嘴鲌(Culteralburnus)、草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)、鯽、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)、光唇魚(yú)(Acrossocheilusfasciatus)、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)、黃鱔(Monopterusalbus)、鰱和鳙(Aristichthysnobilis)的血清均不能與2株單克隆抗體發(fā)生交叉反應(yīng)(表2)。

圖1 大口黑鱸血清免疫球蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白免疫印跡Fig.1 SDS-PAGE and Western Blot of serum immunoglobulin from largemouth bass M. salmoidesM.蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量； A、B.免疫球蛋白M； C、D.分別為A9E7和C9B9與免疫球蛋白M的蛋白免疫印跡結(jié)果.M.standard molecular mass of protein; A and B.IgM; C and D.Western Blotting results of A9E7 and C9B9 with IgM, respectively.

表1 單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞腹水效價(jià)

表2 單克隆抗體的特異性

2.3 免疫大口黑鱸虹彩病毒后大口黑鱸抗體水平

大口黑鱸經(jīng)一次免疫甲醛滅活大口黑鱸虹彩病毒后其體內(nèi)免疫球蛋白的抗體水平變化結(jié)果見(jiàn)圖2。經(jīng)免疫后，大口黑鱸血清中抗體水平呈先增后降最后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，且高含量組和低含量組在14 d后均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而高含量組在第28、35、42、49天時(shí)均顯著高于低含量組，兩組的峰值均出現(xiàn)在免疫后第35天。經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)確定其抗體效價(jià)為1∶1280。

圖2 免疫后大口黑鱸血清抗體水平Fig.2 The serum antibody levels in largemouth bass M. salmoides immunized with LMBV

3 討 論

魚(yú)類(lèi)病毒性疾病具有潛伏期長(zhǎng)、發(fā)病快、致死率高等特點(diǎn)，通常難以防治，一旦發(fā)生可對(duì)魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖基地造成毀滅性打擊，嚴(yán)重限制了魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[20]。目前，在大口黑鱸養(yǎng)殖中，大口黑鱸虹彩病毒是危害最大的病毒之一。為有效防治大口黑鱸虹彩病毒病，借助疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防是切實(shí)可行的途徑，但疫苗免疫防治效果受諸多因素影響，要達(dá)到理想的免疫效果，需考慮大口黑鱸自身免疫系統(tǒng)組成特點(diǎn)及免疫應(yīng)答規(guī)律，而單克隆抗體正是理想的手段之一。單克隆抗體是由B細(xì)胞分化增殖的漿細(xì)胞產(chǎn)生的針對(duì)單一抗原決定簇的抗體，其在魚(yú)類(lèi)免疫學(xué)研究中的作用十分關(guān)鍵，Han等[21]對(duì)抗免疫球蛋白M單克隆抗體的研究表明，許氏平鲉(Sebastesschlegelii)在應(yīng)對(duì)特定病原體時(shí)候，機(jī)體防御水平與免疫球蛋白M表達(dá)水平是正相關(guān)的。與多克隆抗體相比，單克隆抗體具有較強(qiáng)優(yōu)越性，如特異性高、純度高、均質(zhì)性好、重復(fù)性強(qiáng)、成本低、量產(chǎn)可實(shí)現(xiàn)性強(qiáng)等，同時(shí)單克隆抗體也是評(píng)價(jià)疫苗效價(jià)的重要指標(biāo)[22]。

3.1 大口黑鱸免疫球蛋白單克隆抗體的生物學(xué)特性

筆者制備了2株具有較高靈敏度和特異性的大口黑鱸血清免疫球蛋白的單克隆細(xì)胞株。單克隆抗體的交叉試驗(yàn)結(jié)果表明，A9E7和C9B9均能與大口黑鱸血清發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)，A9E7能與花鱸血清發(fā)生交叉反應(yīng)，C9B9能與鱖血清發(fā)生較弱的交叉反應(yīng)。這兩種魚(yú)同屬鱸形目，但為不同科屬魚(yú)類(lèi)，表明鱸形目不同科屬之間的免疫球蛋白具有一定的保守性序列，其血清免疫球蛋白結(jié)構(gòu)具有一定的相似性故而發(fā)生交叉反應(yīng)，但兩株單克隆抗體未與花鱸和鱖全部發(fā)生交叉反應(yīng)，表明不同屬之間的免疫球蛋白也存在一定的差異性。試驗(yàn)結(jié)果還表明，A9E7和C9B9這2株單克隆抗體針對(duì)的是大口黑鱸免疫球蛋白的不同抗原位點(diǎn)，A9E7可特異性針對(duì)花鱸屬，而C9B9則可特異性針對(duì)鱖屬，從遺傳進(jìn)化角度而言，A9E7對(duì)應(yīng)的抗原表位基因較C9B9更為保守[17]。同時(shí)，鲿科的黃顙魚(yú)，鯉科的翹嘴鲌、草魚(yú)、鯽、團(tuán)頭魴，合鰓魚(yú)科的黃鱔，鰍科的泥鰍等血清均不能與本試驗(yàn)中的2株單克隆抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，表明鱸形目魚(yú)類(lèi)與上述魚(yú)類(lèi)的血清免疫球蛋白相似度較低，其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。上述結(jié)果表明，不同魚(yú)類(lèi)的免疫球蛋白的抗原位點(diǎn)具有較好的特異性和保守性，同時(shí)其在某些區(qū)域也存在相近的抗原表位決定簇，相近的抗原表位主要存在于親緣關(guān)系較近的品種之間[17]。

3.2 大口黑鱸免疫球蛋白單克隆抗體的初步應(yīng)用

魚(yú)類(lèi)免疫球蛋白是體液免疫的重要組成部分，在魚(yú)類(lèi)免疫中起重要作用，了解魚(yú)類(lèi)免疫應(yīng)答規(guī)律和免疫保護(hù)機(jī)制可為魚(yú)類(lèi)疫苗免疫效果評(píng)價(jià)、水產(chǎn)動(dòng)物免疫診斷等提供技術(shù)支撐。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)魚(yú)類(lèi)疫苗的免疫效果主要采用免疫保護(hù)率以及抗體效價(jià)等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)因魚(yú)種類(lèi)繁多，且不同種屬魚(yú)類(lèi)之間具有不同的免疫球蛋白，其交叉性差[18]，因此不同的魚(yú)類(lèi)需要采用不同的特異性免疫球蛋白抗體進(jìn)行評(píng)價(jià)，而目前大口黑鱸還沒(méi)有商品化的抗體產(chǎn)品，因此也迫切需要制備特異性強(qiáng)、靈敏度高的抗體用于魚(yú)類(lèi)疫苗免疫效果評(píng)估及抗體水平檢測(cè)等。筆者利用親和層析法獲得了大小為72 ku的大口黑鱸血清免疫球蛋白的重鏈，并利用雜交瘤技術(shù)篩選獲得了2株單克隆抗體，建立間接酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定其對(duì)大口黑鱸免疫球蛋白的檢測(cè)靈敏度，可達(dá)10 ng和20 ng。張福淼等[13]利用凝膠過(guò)濾等方法獲得了花鱸免疫球蛋白的重鏈和輕鏈，其大小分別為72 ku和28 ku 。許娜娜等[14]利用親和層析等方法從花鱸血清中分離獲得了大小分別為79 ku和29 ku的免疫球蛋白，其抗體效價(jià)最高可達(dá)1.39×105/mg，且蛋白免疫印跡結(jié)果也表明其只能識(shí)別免疫球蛋白重鏈[23]。這與歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)[24]和鱖[25]中血清免疫球蛋白單克隆抗體大部分特異性識(shí)別重鏈等研究結(jié)果一致，這主要是與魚(yú)類(lèi)免疫球蛋白的輕鏈分子量較小，其免疫原性較弱有關(guān)。

本試驗(yàn)中，通過(guò)注射免疫大口黑鱸虹彩病毒，利用建立的間接酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)了病毒免疫后大口黑鱸血清抗體應(yīng)答規(guī)律和抗體水平，表明通過(guò)本方法獲得的單克隆抗體可以用于滿足鱸魚(yú)病害的流行病的血清學(xué)和免疫學(xué)檢測(cè)。

4 結(jié) 論

筆者利用飽和硫酸銨鹽析法和親和柱層析法純化大口黑鱸血清的免疫球蛋白，并制備了免疫球蛋白單克隆抗體，其靈敏度和抗體效價(jià)分別可達(dá)10 ng和2.187×106，可用于大口黑鱸病害早期檢測(cè)及免疫應(yīng)答規(guī)律和抗體水平檢測(cè)。