陳 洋，趙春暖，蔡忠強(qiáng)，王曉梅，鄭言鑫，于 濤

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 長(zhǎng)島增殖實(shí)驗(yàn)站，山東 煙臺(tái) 265800)

蝦夷扇貝 (Patinopectenyessoensis)原產(chǎn)于日本，于1982年引入中國(guó)，并迅速在山東、遼寧等地區(qū)進(jìn)行養(yǎng)殖，是我國(guó)重要的養(yǎng)殖貝類之一[1]。經(jīng)過(guò)多年的養(yǎng)殖，蝦夷扇貝大規(guī)模死亡現(xiàn)象頻發(fā)，長(zhǎng)?？h作為我國(guó)最大的蝦夷扇貝增養(yǎng)殖基地[2]，每年蝦夷扇貝死亡造成的經(jīng)濟(jì)損失就達(dá)10億元[3]。研究表明，蝦夷扇貝大規(guī)模死亡除了受懸浮物、高溫刺激等極端環(huán)境因素影響外[4-5]，種質(zhì)退化、高密度養(yǎng)殖、環(huán)境變化、病原侵襲等也是我國(guó)蝦夷扇貝死亡的主要原因[6-7]。其中種質(zhì)退化導(dǎo)致蝦夷扇貝自身抵抗環(huán)境、病原的能力下降，因此培育性狀優(yōu)良的品種是解決蝦夷扇貝死亡的途徑之一。

雜交育種是培育新品種的一種傳統(tǒng)、有效的育種方法，是改良遺傳性狀、培育優(yōu)良品種的可靠途徑。在貝類中，相關(guān)學(xué)者陸續(xù)開(kāi)展了扇貝[8-10]、牡蠣[11-14]、鮑[15-19]等養(yǎng)殖品種種內(nèi)、不同地理群體、種間等的雜交育種試驗(yàn)，所得雜交種在成活率、生長(zhǎng)速度和抗逆性等方面顯示出了良好的生產(chǎn)性狀和一定的雜種優(yōu)勢(shì)。

楊愛(ài)國(guó)等[20-21]分別開(kāi)展了櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)(♀)×蝦夷扇貝(♂)的遠(yuǎn)源雜交研究，雜交后代表型性狀偏向母本，但在生長(zhǎng)速度和抗逆性方面表現(xiàn)出一定的雜種優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)了櫛孔扇貝養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。筆者以蝦夷扇貝為母本、櫛孔扇貝為父本進(jìn)行雜交選育，分析子一代個(gè)體生長(zhǎng)、存活情況，探究雜交子代推廣的價(jià)值，以期改善蝦夷扇貝種質(zhì)，提高其生長(zhǎng)、存活和抗逆能力，保障蝦夷扇貝養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蝦夷扇貝選自長(zhǎng)島南隍城海域人工養(yǎng)殖群體，殼高(10.45±0.48) cm；櫛孔扇貝選自膠南人工養(yǎng)殖群體，殼高(6.73±0.32) cm。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

親本暫養(yǎng)、雜交及幼蟲(chóng)培育試驗(yàn)在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)島增殖實(shí)驗(yàn)站內(nèi)進(jìn)行；稚貝暫養(yǎng)及養(yǎng)成在長(zhǎng)島南隍城海域進(jìn)行。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)4個(gè)試驗(yàn)組合：蝦夷扇貝♀×蝦夷扇貝♂(蝦夷扇貝自交組合)、蝦夷扇貝♀×櫛孔扇貝♂(正交組合)、櫛孔扇貝♀×櫛孔扇貝♂(櫛孔扇貝自交組合)、櫛孔扇貝♀×蝦夷扇貝♂(反交組合)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 親貝暫養(yǎng)

采用浮動(dòng)網(wǎng)箱暫養(yǎng)，暫養(yǎng)密度30～50個(gè)/m3；前期每日倒池1次，后期每日早、晚各換水1次，每次換水1/3；餌料和升溫方式為：蝦夷扇貝采用自然水溫暫養(yǎng)，投喂三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)，經(jīng)過(guò)至少2次嚴(yán)格的挑選后將雌體和雄體分開(kāi)；櫛孔扇貝采用逐步升溫的方法進(jìn)行暫養(yǎng)促熟，餌料以三角褐指藻為主，搭配球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)和螺旋藻(Spirulina)進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化，經(jīng)過(guò)至少2次嚴(yán)格的挑選后將雌體和雄體分開(kāi)。

1.4.2 產(chǎn)卵、受精、孵化

性腺充分發(fā)育成熟后，再次確認(rèn)同一群體無(wú)雌雄混雜。采用陰干、升溫、間斷充氣的方法誘導(dǎo)蝦夷扇貝、櫛孔扇貝雌體在池中產(chǎn)卵，同時(shí)將蝦夷扇貝、櫛孔扇貝雄體分別放于2個(gè)玻璃缸水槽中排精。將精、卵混合受精后，每個(gè)卵子周圍有3～4個(gè)精子，連續(xù)取樣觀察胚胎發(fā)育情況，直到發(fā)育至D形幼蟲(chóng)。

1.4.3 幼蟲(chóng)培育

當(dāng)80%受精卵發(fā)育至D形幼蟲(chóng)，立即用虹吸法選優(yōu)進(jìn)行培養(yǎng)。培育適宜密度為8～12個(gè)/mL；光照低于500 lx；餌料以球等鞭金藻為主，日投喂量為1.5×104～5.0×104個(gè)/mL，日投喂3～6次；日換水2次，每次換水1/2，每5 d倒池1次；培育水溫：蝦夷扇貝自交組、正交組培育水溫16 ℃，櫛孔扇貝自交組、反交組培育水溫19 ℃。

培育期間，每日檢測(cè)試驗(yàn)組幼蟲(chóng)生長(zhǎng)情況，包括殼高、密度等，以確定其生長(zhǎng)速度和成活率。

1.4.4 附著基投放

當(dāng)幼蟲(chóng)眼點(diǎn)率達(dá)到30%～40%時(shí)，投放附著基。

1.4.5 稚貝暫養(yǎng)及養(yǎng)成

將附有稚貝的附著基放入60目網(wǎng)袋中，垂掛于海區(qū)的浮綆上，殼長(zhǎng)達(dá)0.3 cm時(shí)分入20目網(wǎng)袋中，稚貝殼長(zhǎng)約1 cm時(shí)裝入扇貝籠養(yǎng)殖，完成稚貝的海區(qū)中間培育。

1.5 數(shù)據(jù)分析

受精率、孵化率、幼蟲(chóng)生長(zhǎng)及存活中的相關(guān)數(shù)據(jù)計(jì)數(shù)使用生物顯微鏡(重慶奧特B204LED)。稚貝及成貝的殼高測(cè)量使用游標(biāo)卡尺。

各指標(biāo)計(jì)算公式如下：

R1=n2/n1×100%

(1)

R2=n4/n3×100%

(2)

R3=n6/n5×100%

(3)

R4=n8/n7×100%

(4)

式中，R1為受精率(%)，n1為所有卵子數(shù)(個(gè))，n2為出現(xiàn)第一極體的卵子數(shù)(個(gè))，R2為孵化率(%)，n3受精卵數(shù)(個(gè))，n4為孵化出的D形幼蟲(chóng)數(shù)(個(gè))，R3為幼蟲(chóng)期存活率(%)，n5為第1天的幼蟲(chóng)數(shù)(個(gè))，n6為測(cè)量日存活的幼蟲(chóng)數(shù)(個(gè))，R4為稚貝期存活率(%)，n7為掛入海區(qū)的稚貝總數(shù)(個(gè))，n8為測(cè)量日存活稚貝數(shù)(個(gè))。

幼蟲(chóng)期，于第1、3、5、7、9、12、15、18、20天取樣，每組每次取樣30個(gè)個(gè)體，于顯微鏡下測(cè)量殼長(zhǎng)，并統(tǒng)計(jì)存活率。

稚貝海區(qū)中間培育及養(yǎng)成期，于1月齡至8月齡，每月每組取樣30個(gè)個(gè)體，并在11月齡分苗、15月齡收獲時(shí)分別取樣，測(cè)量殼高，并統(tǒng)計(jì)存活率。

用Excel軟件對(duì)各試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析及鄧肯多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。

2 結(jié) 果

2.1 受精率、孵化率比較

自交、雜交組合均可完成受精過(guò)程，受精率為97.19%～98.15%；自交組合略高于雜交組合，以蝦夷扇貝為母本的組合略高于以櫛孔扇貝為母本的組合，但單因素方差分析及鄧肯多重比較結(jié)果顯示，相互之間差異不顯著(P>0.05)(表1)。

自交、雜交組合的孵化率也較高，為89.09%～92.76%；自交組合略高于雜交組合，以櫛孔扇貝為母本的組合略高于以蝦夷扇貝為母本的組合，但單因素方差分析及鄧肯多重比較結(jié)果顯示，組合間差異不顯著(P>0.05)(表1)。

表1 各組合的受精率和孵化率 %

2.2 幼蟲(chóng)期生長(zhǎng)和存活情況比較

孵化后至7日齡時(shí)，幼蟲(chóng)規(guī)格無(wú)顯著差異(P>0.05)；9日齡開(kāi)始幼蟲(chóng)生長(zhǎng)差異逐漸顯現(xiàn)出來(lái)，雜交組合明顯快于自交組合(表2、圖1)。

以櫛孔扇貝為母本的組合，櫛孔扇貝自交、反交組合在15日齡時(shí)投放附著基，反交組合的眼點(diǎn)幼蟲(chóng)平均規(guī)格為196.27 μm，而櫛孔扇貝自交組合的眼點(diǎn)幼蟲(chóng)的規(guī)格為189.20 μm，雜交組合較自交組合大3.74%；櫛孔扇貝自交、反交組合的生長(zhǎng)日平均增長(zhǎng)量為5.76、6.28 μm/d，雜交組合較自交組合提高9.03%。

以蝦夷扇貝為母本的組合，蝦夷扇貝自交、正交組在20日齡時(shí)投放附著基。正交組合的眼點(diǎn)幼蟲(chóng)平均規(guī)格為263.10 μm，而蝦夷扇貝自交組合的眼點(diǎn)幼蟲(chóng)的規(guī)格為252.20 μm，雜交組合較自交組合大4.32%；蝦夷扇貝自交、正交組合的生長(zhǎng)日平均增長(zhǎng)量為8.16、8.57 μm/d，雜交組合較自交組合提高5.02%。

表2 幼蟲(chóng)期各組合生長(zhǎng)情況 μm

圖1 幼蟲(chóng)期不同組合生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth at different larval stages in different combination

幼蟲(chóng)階段，櫛孔扇貝自交、反交組合的存活率分別為63.09%、64.83%，相互之間差異不顯著(P>0.05)；蝦夷扇貝自交、正交組合存活率相對(duì)較高，分別為70.07%、69.16%，但相互之間差異不顯著(P>0.05)(表3、圖2)。

2.3 附著變態(tài)率和海區(qū)保苗率的比較

櫛孔扇貝自交、反交組在15日齡時(shí)投放附著基，蝦夷扇貝自交、正交組合則在20日齡時(shí)投放附著基，4個(gè)組合幼蟲(chóng)均在一周內(nèi)完成附著變態(tài)過(guò)程。蝦夷扇貝自交、正交組合變態(tài)率較櫛孔扇貝自交、反交組合高，其中蝦夷扇貝自交附著變態(tài)率最高，達(dá)48.28%，櫛孔扇貝自交、反交組合變態(tài)率約為45%(表4)，但單因素方差分析及鄧肯多重比較結(jié)果顯示相互之間差異不顯著(P>0.05)。

表3 幼蟲(chóng)期各組合存活率情況 %

表4 各組合附著變態(tài)率與海區(qū)保苗率情況 %

以櫛孔扇貝為母本的櫛孔扇貝自交、反交組合的海區(qū)保苗率明顯高于以蝦夷扇貝為母本的蝦夷扇貝自交、正交組合，其中櫛孔扇貝自交、反交組合的保苗率分別為60.59%、61.25%，相互間差異不顯著(P>0.05)，蝦夷扇貝自交、正交組合的海區(qū)保苗率分別為31.17%、36.3%，雜交組合顯著高于自交組合，提高5.13個(gè)百分點(diǎn)。

2.4 養(yǎng)成期生長(zhǎng)和存活情況比較

生長(zhǎng)至8月齡時(shí)，櫛孔扇貝自交、反交組合的殼高分別達(dá)到33.49、35.97 mm(表5、圖3)，組合間差異顯著且雜交組合較自交組合生長(zhǎng)速度提高7.41%；8月齡時(shí)，櫛孔扇貝自交、反交組合生長(zhǎng)月增長(zhǎng)量為4.70、5.05 mm/月，組合間差異顯著且雜交組合較自交組合月增長(zhǎng)量提高7.45%。

生長(zhǎng)至15月齡時(shí)，蝦夷扇貝自交、正交組合的殼高分別達(dá)到64.30、75.47 mm(表5、圖3)，組合間差異顯著且雜交組合較自交組合生長(zhǎng)速度提高17.37%；15月齡時(shí)，蝦夷扇貝自交、正交組合生長(zhǎng)月增長(zhǎng)量明顯較高，為4.55、5.34 mm/月，組合間差異顯著且雜交組合較自交組合月增長(zhǎng)量提高17.36%。

表5 養(yǎng)成期各組合生長(zhǎng)情況 mm

第一次分苗時(shí)，櫛孔扇貝自交、反交組合的存活率分別為87.42%、89.35%，組合間差異不顯著(P>0.05)；第二次分苗時(shí)，櫛孔扇貝自交、反交組合的存活率分別為82.69%、87.45%，雜交組合顯著高于自交組合(表6)。反交組合總的存活率為78.14%，櫛孔扇貝自交組合總的存活率為72.29%，雜交組合較自交組合提高5.85個(gè)百分點(diǎn)。

第一次分苗時(shí)，蝦夷扇貝自交、正交組合的存活率分別為96.44%、98.50%，組合間差異不顯著(P>0.05)；第二次分苗時(shí)，蝦夷扇貝自交、正交組合的存活率分別為87.57%、92.22%，雜交組合顯著高于自交組合；第三次分苗時(shí)，蝦夷扇貝自交、正交組合的存活率分別為81.23%、89.45%，雜交組合顯著高于自交組合；第四次分苗時(shí)，蝦夷扇貝自交、正交組合的存活率分別為71.07%、82.66%，雜交組合顯著高于自交組合。整個(gè)養(yǎng)成期間，正交組合的總存活率為67.16%，而蝦夷扇貝自交組合的存活率為48.75%，雜交組合較自交組合提高18.41個(gè)百分點(diǎn)。

表6 不同時(shí)期各組合存活率情況 %

3 討 論

3.1 蝦夷扇貝與櫛孔扇貝雜交的可行性

蝦夷扇貝和櫛孔扇貝為扇貝科扇貝屬的兩個(gè)不同種，二者染色體同為2n=38條[22-24]，這就為二者進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交提供了可能。周麗青等[25-27]研究表明：在染色體數(shù)目上，蝦夷扇貝和櫛孔扇貝正、反交子代早期胚胎的染色體數(shù)目為38條，與其雙親一致；在染色體構(gòu)成上，絕大部分正、反交子代分別繼承了櫛孔扇貝和蝦夷扇貝各一套染色體，為真正的雜交種。本研究表明，二者正反交均可進(jìn)行，后期雜交子代均可正常生長(zhǎng)，這也與楊愛(ài)國(guó)等[20-21]的研究結(jié)果一致。

3.2 遠(yuǎn)緣雜交對(duì)受精率、孵化率的影響

本試驗(yàn)中，4個(gè)組合的受精率均在97%以上，組合間差異不顯著(P>0.05)，這也與楊愛(ài)國(guó)等[20-21]的研究結(jié)果一致。劉桂龍等[28]研究蝦夷扇貝與風(fēng)向標(biāo)扇貝(P.caurinus)種間雜交時(shí)發(fā)現(xiàn)，雜交組合的受精率與自交組合有顯著差異；而南樂(lè)紅等[29]在紫扇貝(Argopectenpurpuratus)與墨西哥灣扇貝(A.irradiansconcentricus)雜交的研究中發(fā)現(xiàn)，雜交組的受精率與自交組差異不顯著(P>0.05)，甚至部分雜交組的受精率和孵化率高于自交組。這些研究結(jié)果與陳來(lái)釗等[30]的觀點(diǎn)一致，即父母本親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近一般與受精無(wú)直接的聯(lián)系。

通常，孵化率的高低取決于卵子的成熟度，對(duì)雜交胚胎來(lái)說(shuō)，還取決于雙親之間差異的程度，即親和性大小[30]。呂振明等[27]研究表明，櫛孔扇貝與蝦夷扇貝雜交子代中兩套染色體具有較強(qiáng)的親合性，與雜交子代具有較高的孵化率結(jié)果吻合。

3.3 子代性狀表現(xiàn)

楊愛(ài)國(guó)等[20]研究表明，蝦夷扇貝(♀)×櫛孔扇貝(♂)的雜交子一代僅表現(xiàn)出存活率優(yōu)勢(shì)，生長(zhǎng)速度差異不顯著(P>0.05)。于瑞海等[21]研究表明，蝦夷扇貝(♀)×櫛孔扇貝(♂)的雜交子一代表現(xiàn)出一定的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，而成活率則差異不顯著(P>0.05)。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示：蝦夷扇貝(♀)×櫛孔扇貝(♂)的雜交子一代在幼蟲(chóng)期的存活率未表現(xiàn)出顯著性差異(P>0.05)，但在9日齡后表現(xiàn)出一定的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)；附著變態(tài)率雖然無(wú)顯著差異(P>0.05)，但海區(qū)保苗率提高5.13個(gè)百分點(diǎn)；在養(yǎng)成階段，雜交子一代表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，生長(zhǎng)速度提高了17.37%。

3.4 遠(yuǎn)緣雜交對(duì)子代存活率的影響

存活率是良種選育的另一個(gè)重要指標(biāo)，存活率的高低反映了子代對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，對(duì)最終產(chǎn)量也有很大的影響[31]。雜交除了對(duì)子代生長(zhǎng)速度有一定的影響，子代間的存活率也存在一定的差異。楊愛(ài)國(guó)等[20]研究表明，蝦夷扇貝(♂)×櫛孔扇貝(♀)的雜交子一代的存活率在夏季高溫季節(jié)明顯提高；鄭懷平等[32]研究表明，兩個(gè)海灣扇貝(A.irradians)養(yǎng)殖群體雜交組的存活率都高于相應(yīng)的自交組；豐瑋等[33]研究表明，紫扇貝與海灣扇貝雜交后代的存活率顯著高于自交組。關(guān)于貝類遠(yuǎn)緣雜交的研究也表明，雜交種不一定全部具有雜種優(yōu)勢(shì)，雜交過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)配子不兼容、幼蟲(chóng)存活率低和幼蟲(chóng)不變態(tài)等遠(yuǎn)交衰退現(xiàn)象[34]。張躍環(huán)等[35]進(jìn)行的長(zhǎng)牡蠣(Crassostreagigas)與近江牡蠣(C.ariakensis)種間雜交結(jié)果表明，在存活率方面，以長(zhǎng)牡蠣為母本的雜交組具有顯著的優(yōu)勢(shì)，而反交組則表現(xiàn)為劣勢(shì)。本研究結(jié)果表明，幼蟲(chóng)期各組合的存活率和附著變態(tài)率無(wú)顯著差異(P>0.05)，而養(yǎng)成期反交、正交組合的存活率較櫛孔扇貝自交、蝦夷扇貝自交組合分別提高5.85、18.41個(gè)百分點(diǎn)，雜交組合表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢(shì)。

4 結(jié) 論

筆者建立了蝦夷扇貝、櫛孔扇貝自交、雜交組合，比較了每個(gè)組合的生長(zhǎng)和存活性狀，結(jié)果顯示，正反交組合較自交組合均具有一定的雜種優(yōu)勢(shì)，且蝦夷扇貝(♀)與櫛孔扇貝(♂)雜交獲得的子一代雜種優(yōu)勢(shì)更加顯著。雖然雜交子一代外部形態(tài)與蝦夷扇貝相同，但顯著提高了蝦夷扇貝的生產(chǎn)性能，遠(yuǎn)緣雜交育種是解決蝦夷扇貝大面積死亡的重要途徑之一，正交子一代已經(jīng)具有生產(chǎn)使用價(jià)值，適于大面積推廣，提高蝦夷扇貝養(yǎng)殖的良種覆蓋率和養(yǎng)殖效益。