滕爽爽，張炯明，張利兵，謝尚庶，王瑤華，肖國強,4，楊千元,4，方 軍

(1.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護重點實驗室，溫州市海洋生物遺傳育種重點實驗室，浙江 溫州 325005； 2.樂清市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江 溫州 325699； 3.瑞安市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江 溫州 325200； 4.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 316022)

弧菌是海洋環(huán)境中常見的細菌種群之一，廣泛分布于河口、海灣、近岸海域的海水和海洋動物體內(nèi)[1-4]?；【鷮俜N類繁多，主要致病弧菌有哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)、鰻弧菌(V.anguillarum)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、霍亂弧菌(V.cholerae)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)等[5]。哈維氏弧菌是海水養(yǎng)殖業(yè)重要的條件致病菌[6-7]，已有研究表明，哈維氏弧菌可感染褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)[8-9]、尖吻鱸(Latescalcarifer)[10]、刺尾魚(Acanthurussohal)[11]、紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)[12-13]、斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)[14-15]、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[16]和文蛤(Meretrixmeretrix)[17]等重要水產(chǎn)養(yǎng)殖動物，并致其死亡，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。

泥蚶(Tegillarcagranosa)屬瓣鰓綱、列齒目、蚶科、泥蚶屬，是我國沿海灘涂的主要養(yǎng)殖貝類之一，也是沿海居民青睞的生食雙殼貝類之一。隨著泥蚶養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，在每年溫度上升的4—5月和繁殖后的7—8月間，易發(fā)生泥蚶細菌性疾病，嚴重影響了泥蚶養(yǎng)殖效益和泥蚶養(yǎng)殖業(yè)。研究發(fā)現(xiàn)，夏季泥蚶體內(nèi)的優(yōu)勢菌群主要是弧菌屬細菌和氣單胞菌屬細菌[18]；對浙江省11市泥蚶副溶血弧菌污染情況檢測發(fā)現(xiàn)，50%為陽性[19]。尚未見有關(guān)哈維氏弧菌感染泥蚶的報道，僅見泥蚶血紅蛋白(Tg-HbⅡ)酶解多肽對哈維氏弧菌具有明顯的抗菌活性的研究[20]。2014年8月，浙江灘涂養(yǎng)殖泥蚶暴發(fā)大規(guī)模死亡，其主要特征為閉殼肌無力，軟體部顏色發(fā)白，體液呈淡紅色或無色，黏液增多。筆者自瀕死的泥蚶中分離得到1株優(yōu)勢菌，從該菌株的形態(tài)、生理生化特征、分子生物學(xué)分類方面進行研究，以期為泥蚶病害研究提供生物學(xué)資料，為泥蚶弧菌病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從養(yǎng)殖群體中隨機選取500個外形規(guī)則、閉殼肌閉合有力的2齡泥蚶[殼長(30.51±1.56) mm]，試驗開始前一周，于水溫(29±1) ℃、鹽度21±1、pH 8.10±0.05的砂濾海水中凈化暫養(yǎng)，每日更換海水，早晚各投喂硅藻1次。

1.2 病原菌分離

2014年8月浙江灘涂暴發(fā)泥蚶大規(guī)模死亡。無菌條件下，取瀕死泥蚶[2齡，殼長(28.67±1.97) mm，總質(zhì)量(9.08±1.61) g]的肝胰腺，用無菌的生理鹽水沖洗3次以上，置于1.5 mL無菌離心管中，加入適量的無菌生理鹽水，用眼科剪搗碎，吸取組織液，稀釋后涂布于硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(HB4310，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)，28 ℃培養(yǎng)24 h后挑取優(yōu)勢單菌落，劃線接種在2216E固體培養(yǎng)基(HB0132，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)上，獲得1株優(yōu)勢菌，命名為J14，將該菌株移入2216E液體培養(yǎng)基，28 ℃搖床培養(yǎng)12 h，在菌液中加入滅菌甘油至終體積分數(shù)為25%，于-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 人工感染試驗

將菌株J14劃線于2216E固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h后挑取單菌落接種于裝有2216E液體培養(yǎng)基的試管中，28 ℃搖床培養(yǎng)12 h，再將其接種于3 L的2216E液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)。菌液密度以血細胞計數(shù)法測定[21]，每瓶取3～5次，每次重復(fù)計數(shù)3次，取平均值。以測定的3 L瓶中的菌液J14作為母液，分別以不同的體積添加到試驗組，以制備不同密度的菌株J14感染組。

采用浸泡感染的方法，設(shè)置菌株J14感染試驗組的密度為2.5×106、5.0×106、7.5×106、10.0×106、12.5×106、15.0×106個/mL，對照組為不添加菌液的砂濾海水，每組設(shè)3個平行，每個平行40個泥蚶，試驗容器為43 cm×28 cm×25 cm的30 L白色塑料水箱。感染期間海水溫度保持28 ℃，持續(xù)充氣，日換水1次，換水后添加菌液，早晚各投喂硅藻1次。感染5 d，每日記錄泥蚶死亡數(shù)，利用SPSS 19.0 的概率單位法分析菌液密度與泥蚶死亡率之間關(guān)系，計算菌株J14感染泥蚶的96 h半致死密度。

感染試驗中，取瀕死泥蚶的肝胰腺，無菌生理鹽水沖洗數(shù)次，勻漿后取100 μL涂布于硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基，分離純化優(yōu)勢菌并命名為J19。菌株J19同樣在3 L的2216E液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，以血細胞計數(shù)法[21]測定菌液密度，以10.0×106個/mL再次進行人工浸泡感染試驗，記錄泥蚶的死亡率。

采用SPSS 19.0獨立樣本t檢驗，比較泥蚶在J14和J19菌液浸泡感染下的死亡率差異，以P<0.05為差異顯著。

1.4 菌株形態(tài)及生化特征分析

將菌株J14和J19劃線接種至2216E和硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂平板，28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落的形態(tài)，并進行革蘭氏染色。再將2菌株接種至2216E液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用微量生化反應(yīng)管(杭州濱和微生物試劑有限公司)進行生理生化試驗。

1.5 16S rRNA基因序列測定和毒力基因分析

將菌株J14和J19接種于2216E液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h，離心收集菌體，滅菌生理鹽水洗滌2次后，采用細菌基因組DNA快速提取試劑盒(DN11，北京艾德萊生物科技有限公司)提取菌株的基因組DNA作為模板，以細菌16S rRNA基因，14個毒力基因進行PCR擴增，引物信息見表1。

表1 16S rRNA基因和14個毒力基因的引物信息

16S rRNA基因PCR產(chǎn)物送上海祥音生物科技有限公司雙向測序，所得序列在美國國家生物技術(shù)信息中心進行BLAST比對分析，并從GenBank中下載同屬標準菌株的16S rRNA基因序列，選取大腸桿菌(Escherichiacoli)DQ360844.1為外群。序列輸入MEGA-X軟件對齊序列后，采用鄰接法，重復(fù)1000次計算自展值，以Kimura 2-parameter模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。毒力基因PCR擴增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳，對照產(chǎn)物預(yù)期片段長度，讀取結(jié)果。

1.6 藥敏試驗

采用紙片擴散法對病原菌進行藥物敏感性測試。分別挑取2216E平板上培養(yǎng)的菌株J14和J19于無菌生理鹽水，調(diào)節(jié)菌懸液密度為0.5麥氏濁度[D(625 nm)=0.08～0.13]。取100 μL菌懸液均勻涂布于水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(HB6232，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)上，10 min后將不同抗生素藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司)貼于培養(yǎng)基表面，每種抗生素貼2片藥敏試紙片，每個平板貼2片，并置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，游標卡尺測量抑菌圈直徑。試驗結(jié)果判讀參考文獻[27-28]。

2 結(jié) 果

2.1 人工感染試驗結(jié)果

人工感染結(jié)果顯示，菌株J14對泥蚶具有較強的致病性，可引起泥蚶死亡，其發(fā)病癥狀為閉殼肌無力，體液發(fā)白，肉質(zhì)顏色發(fā)白，發(fā)臭，貝殼邊緣有煙灰色黏液流出(圖1)，與自然發(fā)病泥蚶癥狀一致。根據(jù)泥蚶死亡結(jié)果，計算得到菌株J14感染泥蚶的96 h半致死密度為7.74×106個/mL(表2)。將菌株J14和J19以10.0×106個/mL密度感染泥蚶，5日累積死亡率均逾90%，菌株J14引起的死亡率略低于菌株J19(表3)，經(jīng)SPSS 19.0獨立樣本t檢驗分析，二者之間差異不顯著(P>0.05)。

2.2 菌株形態(tài)及生理生化特征

28 ℃培養(yǎng)24 h條件下，菌株J14和J19形態(tài)相同：在2216E培養(yǎng)基上為直徑(0.89±0.30) mm、圓形、黏稠、邊緣整齊、表面光滑略凸起的白色不透明菌落；在硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基上為直徑(1.15±0.35) mm、圓形、邊緣整齊的黃色不發(fā)光菌落；革蘭氏染色后觀察為革蘭氏陰性短桿菌。生化特征鑒定結(jié)果表明，2個菌株在鳥氨酸脫羧酶和西蒙氏枸櫞酸鹽利用與哈維氏弧菌標準株有差異(表4)，參考文獻[29-30]，確定2株菌屬于弧菌屬。

圖1 健康泥蚶和患病泥蚶Fig.1 The healthy and the sick ark shell T. granosaa.自然發(fā)病泥蚶； b.人工感染發(fā)病泥蚶； c.健康泥蚶.a.naturally infected ark shell; b.artificially infected ark shell; c.healthy ark shell.

表2 菌液J14浸泡泥蚶的感染結(jié)果

表3 泥蚶感染菌株J14和J19后的死亡率比較

表4 菌株J14和J19的生理生化特征

2.3 16S rRNA基因序列分析

為進一步確定菌株J14和J19的分類地位，將菌株J14和J19的16S rRNA基因序列在美國國家生物技術(shù)信息中心中進行BLAST比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前100個比對結(jié)果相似性均在99%以上，其中哈維氏弧菌約占75%，其余為坎貝氏弧菌(V.campbellii)、輪蟲弧菌(V.rotiferianus)和未定種細菌。由構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)可見，菌株J14和J19均與哈維氏弧菌聚類，結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化試驗結(jié)果，確定菌株J14和J19均為哈維氏弧菌。結(jié)合人工感染試驗可以確定，菌株J14為本試驗中泥蚶大規(guī)模性死亡的病原菌。

圖2 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的弧菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogentic tree of Vibrio based on 16S rRNA gene sequences標尺0.01表示核苷酸替換數(shù).Bar 0.01 indicates the number of nucleotide substitutions.

2.4 毒力基因檢測結(jié)果

哈維氏弧菌J14和J19攜帶毒力基因情況見表5。哈維氏弧菌J14和J19中均能擴增出7個毒力基因(luxR、toxR、vhhA、vhhB、toxS、chiA、絲氨酸蛋白酶基因)的目的條帶；毒力基因flaA的擴增結(jié)果有差異，哈維氏弧菌J14不含有flaA基因，而哈維氏弧菌J19攜帶flaA基因；哈維氏弧菌J14和J19中均未擴增出其余6個毒力基因(vhpA、vhpB、pap6、toxRVh、vhml、vhs)的目的片段。

2.5 藥敏試驗結(jié)果

哈維氏弧菌J14和J19對32種抗菌藥物敏感性試驗的結(jié)果顯示：2個菌株對青霉素、氨芐西林、阿莫西林、桿菌肽不敏感；對多黏菌素B中度敏感；對紅霉素的敏感性存在差異，即哈維氏弧菌J14對紅霉素中度敏感，哈維氏弧菌J19對紅霉素敏感；對其他26種藥物敏感(表6)。

表5 哈維氏弧菌J14和J19毒力基因的擴增結(jié)果

表6 哈維氏弧菌J14和J19的耐藥性分析

3 討 論

3.1 菌株J14的分離與鑒定

哈維氏弧菌為條件致病菌，有毒株可引起養(yǎng)殖貝類發(fā)病、死亡。如感染哈維氏弧菌的文蛤，在發(fā)病高峰期病狀特征明顯，解剖患病文蛤發(fā)現(xiàn)，其外套膜萎縮，閉殼肌松弛、開合無力、兩殼呈張開狀態(tài)，軟體部消瘦，部分發(fā)病文蛤的鰓黏液明顯增多[17]。本試驗中，菌株J14是從夏季規(guī)模性死亡的泥蚶中分離得到的，表明菌株J14可在高溫環(huán)境下生長。由人工感染試驗結(jié)果可知，感染后的泥蚶出現(xiàn)明顯的病癥：外套膜萎縮，閉殼肌松弛，開合無力，軟體部消瘦，有些發(fā)爛發(fā)白，肝胰腺顏色淡紅，體液淡紅至無色，部分患病泥蚶鰓黏液明顯增多，黏液呈煙灰色。感染后死亡率高達90%。人工感染發(fā)病泥蚶的癥狀與自然發(fā)病的泥蚶癥狀表現(xiàn)一致，說明菌株J14具備重復(fù)感染的能力。泥蚶貝殼堅硬，如受到外界刺激，則雙殼緊閉，較難通過注射方法將菌液注射到泥蚶軟體部，因此本試驗中采用不同密度的J14菌液浸泡感染泥蚶，分析得到菌株J14感染泥蚶的96 h半致死密度為7.74×106個/mL，表明菌株J14具有較強致病性。

對菌株J14和J19進行形態(tài)、常規(guī)生理生化鑒定，結(jié)果顯示，2個菌株均為革蘭氏陰性細菌，硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基平板上呈黃色，生理生化鑒定結(jié)果與哈維氏弧菌特征極為相近。與標準菌株比較，部分鑒定項存在差異[31]，推測2個菌株可能為哈維氏弧菌。對菌株J14和J19進行16S rRNA基因分子生物學(xué)鑒定，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，2株菌與哈維氏弧菌聚為一支。綜合生理生化與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定這2個菌株均為哈維氏弧菌。

3.2 哈維氏弧菌J14的毒力基因

已有研究表明，弧菌屬不同種間存在相同的毒力基因，相同的種內(nèi)存在不同的毒力基因，毒力基因或相關(guān)毒力因子的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致某些無毒株變?yōu)橛卸局暌约俺霈F(xiàn)弧菌新病原的重要原因[32]。本試驗中，共檢測了14種毒力基因的攜帶情況，結(jié)果顯示，哈維氏弧菌J14和J19均攜帶有群體效應(yīng)調(diào)控基因luxR，毒力調(diào)控基因toxR，溶血素基因vhhA、vhhB，毒力相關(guān)基因toxS，幾丁質(zhì)酶基因chiA，絲氨酸蛋白酶基因。Xu等[33]對46株不同哈維氏弧菌的17種毒力基因進行PCR分析，發(fā)現(xiàn)所有的致病菌均含有l(wèi)uxR、toxRVh、vhh、chiA、絲氨酸蛋白酶基因這5種毒力基因，表明哈維氏弧菌毒力是由多基因共同作用的結(jié)果。據(jù)Nakamura等[34]報道，毒力基因在適應(yīng)不同環(huán)境和不同宿主方面具有優(yōu)勢，擁有很強的轉(zhuǎn)移能力。另外，哈維氏弧菌致病菌株較非致病菌株可能擁有更強的接收通過基因水平轉(zhuǎn)移而來的外源基因的能力[35]。本試驗中的鞭毛結(jié)構(gòu)基因flaA在2個菌株中存在差異，J14不含有flaA基因，而J19含有flaA基因，由此推測，毒力基因水平轉(zhuǎn)移可能是2株菌攜帶毒力基因差異的原因。

3.3 哈維氏弧菌J14的藥敏性

藥物的敏感試驗結(jié)果表明，2個菌株對青霉素、氨芐西林、阿莫西林和桿菌肽不敏感。文蛤源哈維氏弧菌對氨芐西林和阿莫西林不敏感[17]；珍珠龍膽石斑魚(Epinepheluslanceolatus♂×E.fuscoguttatus♀)源哈維氏弧菌X12XC30對呋喃唑酮、阿莫西林和紅霉素耐藥，X13SZ03對四環(huán)素、呋喃唑酮、利福平、復(fù)方新諾明和頭孢克肟等耐藥[36]。有研究顯示，不同年份、不同來源、不同養(yǎng)殖環(huán)境分離得到的哈維氏弧菌對抗生素的耐藥存在差異，環(huán)境、宿主影響細菌的耐藥性，同時抗生素的過度使用導(dǎo)致細菌產(chǎn)生更廣的耐藥性[37-40]。本試驗中的2株哈維氏弧菌對26種藥物敏感，其中氯霉素、呋喃唑酮、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢噻吩、頭孢拉啶、諾氟沙星、氧氟沙星屬于水生食品動物禁用藥[41]，因此在泥蚶弧菌病的防治過程中應(yīng)合理合規(guī)用藥，通過改善泥蚶養(yǎng)殖環(huán)境水質(zhì)和底質(zhì)，以達到生態(tài)防治的目的。

4 結(jié) 論

從浙江灘涂發(fā)病泥蚶中分離得到優(yōu)勢菌株J14，經(jīng)生理生化試驗和16S rRNA基因序列分析，確定為哈維氏弧菌，該菌株具有較強的致病性，攜帶7種毒力基因，對慶大霉素、卡那霉素、復(fù)方新諾明等26種常用抗生素藥物敏感。