魯 萍，于龍政

1.延邊大學附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，吉林延吉 133002；2. 延邊大學農(nóng)學院，吉林延吉 133002；3.東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心，吉林延吉 133002

隨著抗生素的廣泛應用，出現(xiàn)藥物殘留、機體耐藥性的產(chǎn)生等諸多問題。因此，目前積極開展替代抗生素的微生態(tài)制劑的研究。微生態(tài)制劑是從自然界中分離得到的有益微生物，通過微生物工程工藝制作成含有活菌或其代謝物的活菌劑。微生態(tài)制劑可以平衡宿主腸道內(nèi)的微生物菌群，調(diào)節(jié)免疫力，其代謝物可以抑制病原菌，具有安全、無藥物殘留、有利于動物的生長繁殖等優(yōu)點，被廣泛重視和應用。解淀粉類芽孢桿菌是廣泛存在于自然界中的桿菌，解淀粉類芽孢桿菌的分離鑒定報道較多，但多數(shù)是從植物中分離。反芻動物的瘤胃中棲息著多種微生物群，本試驗旨在從羊瘤胃內(nèi)分離菌源，對其進行菌種鑒定、生長情況、耐酸、耐膽鹽、抑菌作用等研究，以期為微生態(tài)制劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

教學牧場的羊瘤胃內(nèi)容物，RCM培養(yǎng)基、藥敏紙片購自青島海博生物技術有限公司，細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生物有限公司，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌為實驗室從腹瀉病例分離菌株。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化

從教學牧場的羊瘤胃瘺管處采集羊瘤胃內(nèi)容物物，用無菌PBS稀釋后80 ℃水浴加熱10 min。熱處理后的內(nèi)容物涂布在RCM固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取菌落，反復純化分離3次，得到純培養(yǎng)物。對純培養(yǎng)物進行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.2 分子生物學鑒定

對分離純化的菌進行16S rRNA鑒定分析。用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA，進行PCR擴增。引物為細菌16S rRNA基因通用引物，上游引物 27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACG CT-3'，下游引物1492R:5'-TACGGCTACCTTGTTACGA CTTCACCCC-3'。PCR擴增采用20 μL反應體系，其中:2×Taq Mix 10 μL，10 nM引物各1 μL，菌液DNA 2 μL，ddH2O 6 μL。PCR擴增的反應條件:94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán)；最后在72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物送至吉林省庫美生物科技有限公司進行測序。利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST工具對序列進行比對，應用軟件Clustalx和MEGA建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 生長曲線測定

挑取分離純化的單個菌落接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，制成菌懸液。菌液按照2%的接種量接種到新的RCM液體培養(yǎng)基中，并每隔2 h取樣品，測定其菌液的OD值，38 h后繪制出該菌的生長曲線。

1.2.4 耐酸和耐膽鹽能力測定

耐酸試驗：pH為7.0的PBS用0.1 mol/L的鹽酸分別調(diào)節(jié)pH至4.0、3.0、2.0，高壓滅菌。取菌懸液0.1 mL，分別加入到裝有9.9 mL上述pH的PBS試管中（3次平行試驗），制成菌懸液，并在37 ℃搖床培養(yǎng)3 h。做3個稀釋度，各取100 μL培養(yǎng)液涂在普通瓊脂培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，平板菌落計數(shù)。以原菌液作為對照，計算菌株的存活率。

耐膽鹽試驗：分別稱取豬膽鹽，加入PBS溶解，使其濃度分別為0.1%、0.2%和0.3%，高壓滅菌后備用。取菌懸液0.1 mL，加入到裝有9.9 mL上述濃度的豬膽鹽溶液的試管中（3次平行試驗），充分混勻，在37℃搖床培養(yǎng)3 h。做3個稀釋度，取100 μL培養(yǎng)液涂布在普通瓊脂培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，平板菌落計數(shù)。以原菌液作為對照，計算菌株的存活率。

1.2.5 抑菌試驗

將大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，測試分離菌的抑菌特性。將分離菌株在平皿上點種，培養(yǎng)過夜，按照每7 mL的0.7%軟瓊脂接種300 μL指示菌為比例，接種指示菌，37 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑。

2 結果

2.1 菌落及細菌形態(tài)

羊瘤胃中分離純化的菌株Y1在RCM培養(yǎng)上菌落呈現(xiàn)圓形、邊緣不整、淡黃色、不透明、大菌落。革蘭氏染色后菌株Y1呈紫色、短桿狀，為革蘭氏陽性菌。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

提取菌液DNA，經(jīng)27 F和1 492 R引物PCR擴增，得到1.5 kb左右的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物純化后測序。將菌株Y1的16S rRNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對，應用Lasergene軟件進行同源性分析，菌株Y1與解淀粉類芽孢桿菌（GenBank No.MK618627, KC355293）同源性最高，為99.7%。應用軟件Clustalx構建遺傳進化樹，應用MEGA軟件繪制遺傳進化樹（圖1）。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，菌株Y1與解淀粉類芽孢桿菌遺傳距離最近，處于同一進化分支上；與解淀粉芽孢桿菌（GenBank No.KY357304）和枯草芽孢桿菌（GenBank No.X60646）不在同一分支上。

圖1 菌株Y1的系統(tǒng)進化樹

2.3 生長曲線

菌液經(jīng)過培養(yǎng)，每隔2 h取樣品，測定其菌液的OD值，繪制生長曲線。由Y1生長曲線可知，經(jīng)過4 h生長遲緩期，進入對數(shù)生長期。在14 h進入穩(wěn)定生長期，34 h后進入衰落期。

2.4 耐酸、耐膽鹽特性

經(jīng)過不同pH的PBS處理，在37 ℃培養(yǎng)3 h之后，在pH 2.0、3.0、4.0的存活率分別為0、0.15%、51.23%。該菌在pH 3.0條件下可存活，但存活率低。在pH 4.0條件下存活率可達50%以上。

經(jīng)過不同濃度的豬膽鹽在37 ℃培養(yǎng)3 h之后，在0.1%（w/v）豬膽鹽條件下細菌存活率83.4%，0.2%豬膽鹽條件下細菌存活率為75.3%，0.3%豬膽鹽條件下細菌存活率為66.5%，隨著膽鹽濃度的增加，存活率下降，但仍保持在60%以上，具備耐膽鹽特性。

2.5 抑菌試驗

以大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，檢測該菌的抑菌效果。結果沒有抑菌圈出現(xiàn)，表明分離到的菌對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌沒有抑菌作用。

3 討論

本研究從羊瘤胃內(nèi)容物中分離到一菌株，經(jīng)過形態(tài)學觀察和16S rRNA鑒定，該菌株與解淀粉類芽孢桿菌形態(tài)相同，革蘭氏陽性菌，同源性高達99.7%、遺傳距離最近，鑒定為解淀粉類芽孢桿菌。

解淀粉類芽孢桿菌培養(yǎng)2 h后進入對數(shù)生長期，在培養(yǎng)14 h后進入穩(wěn)定期；在pH 4.0條件下存活率可達50%以上，在0.3%豬膽鹽條件下細菌存活率為60%以上，表明該菌的生長規(guī)律適合腸道內(nèi)繁殖。為進一步幫助機體消化吸收提供基礎。

大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌是腸道主要致病菌。本試驗分離純化的解淀粉類芽孢桿菌對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均無抑制作用。這結果與王政露等人報道的解淀粉芽孢桿菌的結果一致，然而也有報道解淀粉芽孢桿菌對大腸桿菌和沙門氏菌均有抑制作用。這可能與菌株差異有關，因此在開發(fā)益生菌劑時應選擇對腸道病原菌具有良好抑制作用的菌株。