魯 萍，于龍政

1.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，吉林延吉 133002；2. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133002；3.東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心，吉林延吉 133002

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，出現(xiàn)藥物殘留、機(jī)體耐藥性的產(chǎn)生等諸多問(wèn)題。因此，目前積極開(kāi)展替代抗生素的微生態(tài)制劑的研究。微生態(tài)制劑是從自然界中分離得到的有益微生物，通過(guò)微生物工程工藝制作成含有活菌或其代謝物的活菌劑。微生態(tài)制劑可以平衡宿主腸道內(nèi)的微生物菌群，調(diào)節(jié)免疫力，其代謝物可以抑制病原菌，具有安全、無(wú)藥物殘留、有利于動(dòng)物的生長(zhǎng)繁殖等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛重視和應(yīng)用。解淀粉類芽孢桿菌是廣泛存在于自然界中的桿菌，解淀粉類芽孢桿菌的分離鑒定報(bào)道較多，但多數(shù)是從植物中分離。反芻動(dòng)物的瘤胃中棲息著多種微生物群，本試驗(yàn)旨在從羊瘤胃內(nèi)分離菌源，對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定、生長(zhǎng)情況、耐酸、耐膽鹽、抑菌作用等研究，以期為微生態(tài)制劑的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

教學(xué)牧場(chǎng)的羊瘤胃內(nèi)容物，RCM培養(yǎng)基、藥敏紙片購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生物有限公司，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌為實(shí)驗(yàn)室從腹瀉病例分離菌株。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化

從教學(xué)牧場(chǎng)的羊瘤胃瘺管處采集羊瘤胃內(nèi)容物物，用無(wú)菌PBS稀釋后80 ℃水浴加熱10 min。熱處理后的內(nèi)容物涂布在RCM固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取菌落，反復(fù)純化分離3次，得到純培養(yǎng)物。對(duì)純培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.2 分子生物學(xué)鑒定

對(duì)分離純化的菌進(jìn)行16S rRNA鑒定分析。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物為細(xì)菌16S rRNA基因通用引物，上游引物 27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACG CT-3'，下游引物1492R:5'-TACGGCTACCTTGTTACGA CTTCACCCC-3'。PCR擴(kuò)增采用20 μL反應(yīng)體系，其中:2×Taq Mix 10 μL，10 nM引物各1 μL，菌液DNA 2 μL，ddH2O 6 μL。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物送至吉林省庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST工具對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，應(yīng)用軟件Clustalx和MEGA建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

挑取分離純化的單個(gè)菌落接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，制成菌懸液。菌液按照2%的接種量接種到新的RCM液體培養(yǎng)基中，并每隔2 h取樣品，測(cè)定其菌液的OD值，38 h后繪制出該菌的生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 耐酸和耐膽鹽能力測(cè)定

耐酸試驗(yàn)：pH為7.0的PBS用0.1 mol/L的鹽酸分別調(diào)節(jié)pH至4.0、3.0、2.0，高壓滅菌。取菌懸液0.1 mL，分別加入到裝有9.9 mL上述pH的PBS試管中（3次平行試驗(yàn)），制成菌懸液，并在37 ℃搖床培養(yǎng)3 h。做3個(gè)稀釋度，各取100 μL培養(yǎng)液涂在普通瓊脂培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，平板菌落計(jì)數(shù)。以原菌液作為對(duì)照，計(jì)算菌株的存活率。

耐膽鹽試驗(yàn)：分別稱取豬膽鹽，加入PBS溶解，使其濃度分別為0.1%、0.2%和0.3%，高壓滅菌后備用。取菌懸液0.1 mL，加入到裝有9.9 mL上述濃度的豬膽鹽溶液的試管中（3次平行試驗(yàn)），充分混勻，在37℃搖床培養(yǎng)3 h。做3個(gè)稀釋度，取100 μL培養(yǎng)液涂布在普通瓊脂培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，平板菌落計(jì)數(shù)。以原菌液作為對(duì)照，計(jì)算菌株的存活率。

1.2.5 抑菌試驗(yàn)

將大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，測(cè)試分離菌的抑菌特性。將分離菌株在平皿上點(diǎn)種，培養(yǎng)過(guò)夜，按照每7 mL的0.7%軟瓊脂接種300 μL指示菌為比例，接種指示菌，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 菌落及細(xì)菌形態(tài)

羊瘤胃中分離純化的菌株Y1在RCM培養(yǎng)上菌落呈現(xiàn)圓形、邊緣不整、淡黃色、不透明、大菌落。革蘭氏染色后菌株Y1呈紫色、短桿狀，為革蘭氏陽(yáng)性菌。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

提取菌液DNA，經(jīng)27 F和1 492 R引物PCR擴(kuò)增，得到1.5 kb左右的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物純化后測(cè)序。將菌株Y1的16S rRNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，應(yīng)用Lasergene軟件進(jìn)行同源性分析，菌株Y1與解淀粉類芽孢桿菌（GenBank No.MK618627, KC355293）同源性最高，為99.7%。應(yīng)用軟件Clustalx構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)，應(yīng)用MEGA軟件繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)（圖1）。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，菌株Y1與解淀粉類芽孢桿菌遺傳距離最近，處于同一進(jìn)化分支上；與解淀粉芽孢桿菌（GenBank No.KY357304）和枯草芽孢桿菌（GenBank No.X60646）不在同一分支上。

圖1 菌株Y1的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 生長(zhǎng)曲線

菌液經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，每隔2 h取樣品，測(cè)定其菌液的OD值，繪制生長(zhǎng)曲線。由Y1生長(zhǎng)曲線可知，經(jīng)過(guò)4 h生長(zhǎng)遲緩期，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在14 h進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，34 h后進(jìn)入衰落期。

2.4 耐酸、耐膽鹽特性

經(jīng)過(guò)不同pH的PBS處理，在37 ℃培養(yǎng)3 h之后，在pH 2.0、3.0、4.0的存活率分別為0、0.15%、51.23%。該菌在pH 3.0條件下可存活，但存活率低。在pH 4.0條件下存活率可達(dá)50%以上。

經(jīng)過(guò)不同濃度的豬膽鹽在37 ℃培養(yǎng)3 h之后，在0.1%（w/v）豬膽鹽條件下細(xì)菌存活率83.4%，0.2%豬膽鹽條件下細(xì)菌存活率為75.3%，0.3%豬膽鹽條件下細(xì)菌存活率為66.5%，隨著膽鹽濃度的增加，存活率下降，但仍保持在60%以上，具備耐膽鹽特性。

2.5 抑菌試驗(yàn)

以大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，檢測(cè)該菌的抑菌效果。結(jié)果沒(méi)有抑菌圈出現(xiàn)，表明分離到的菌對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌沒(méi)有抑菌作用。

3 討論

本研究從羊瘤胃內(nèi)容物中分離到一菌株，經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和16S rRNA鑒定，該菌株與解淀粉類芽孢桿菌形態(tài)相同，革蘭氏陽(yáng)性菌，同源性高達(dá)99.7%、遺傳距離最近，鑒定為解淀粉類芽孢桿菌。

解淀粉類芽孢桿菌培養(yǎng)2 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在培養(yǎng)14 h后進(jìn)入穩(wěn)定期；在pH 4.0條件下存活率可達(dá)50%以上，在0.3%豬膽鹽條件下細(xì)菌存活率為60%以上，表明該菌的生長(zhǎng)規(guī)律適合腸道內(nèi)繁殖。為進(jìn)一步幫助機(jī)體消化吸收提供基礎(chǔ)。

大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌是腸道主要致病菌。本試驗(yàn)分離純化的解淀粉類芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌均無(wú)抑制作用。這結(jié)果與王政露等人報(bào)道的解淀粉芽孢桿菌的結(jié)果一致，然而也有報(bào)道解淀粉芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌均有抑制作用。這可能與菌株差異有關(guān)，因此在開(kāi)發(fā)益生菌劑時(shí)應(yīng)選擇對(duì)腸道病原菌具有良好抑制作用的菌株。