王耀坤, 劉雙春

(1.佳木斯大學(xué)醫(yī)學(xué)部，黑龍江 佳木斯 154007；2. 臺州市立醫(yī)院輸血科，浙江 臺州 318000)

腎小球毛細(xì)血管壓力升高 (glomerular capillary pressure, Pgc) 是不同病因誘導(dǎo)的慢性腎臟疾病進(jìn)展中主要致病決定因素。利用機(jī)械應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)方法，可以體外模擬腎小球系膜細(xì)胞(glomerular mesangial cell, GMC)高Pgc的傳遞，在結(jié)構(gòu)方面恰好為腎小球毛細(xì)血管簇提供了必要的支持[1]。在體外，循環(huán)應(yīng)用真空與可變形孔板模型拉伸效應(yīng)。在基質(zhì)上生長的MC經(jīng)循環(huán)拉伸/松弛后增加了基質(zhì)蛋白的合成[2]，此方法恰恰為MC中機(jī)械應(yīng)激誘導(dǎo)信號的研究提供了一個模型系統(tǒng)。另外，基質(zhì)蛋白合成和腎小球纖維化的兩個關(guān)鍵介質(zhì)是促纖維化細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長因子β1 (Transforming factor β1, TGF-β1)和結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)。CTGF至少介導(dǎo)了TGF-β1的部分促纖維化作用，但它也對基質(zhì)上調(diào)有獨(dú)立和疊加的作用[3]。CTGF的上調(diào)與腎纖維化的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，抑制其表達(dá)對MC具有明顯對的保護(hù)作用[4]。機(jī)械拉伸是否能夠上調(diào)CTGF的表達(dá)，其分子機(jī)制如何目前還不清楚。本研究利用原代培養(yǎng)的GMC作為研究對象，利用機(jī)械拉伸的實(shí)驗(yàn)方法分析 CTGF的表達(dá)變化及TβR1在此過程中的作用。研究結(jié)果可以為臨床慢性腎病的有效治療提供必要的理論和實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SD大鼠腎小球系膜細(xì)胞(GMC)，由加拿大 Joan Krepinsky教授(McMaster University)惠贈。DMEM 培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Sigma公司)；Trizol(美國ThermoFisher公司)； 抗CTGF抗體(mouse，美國Santa Cruz公司)；抗Tubulin抗體(rabbit, 美國Cell Signaling公司)；抗P-Smad3 S423/S425 抗體((rabbit，美國Cell Signaling公司)；TβR1阻斷劑SB431542 (5 mM, 30 minutes)(美國Cell Signaling公司)，細(xì)胞培養(yǎng)中需要的其他耗材均購自Corning 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SD大鼠，雌性，乙醚麻醉后用事先冷藏的生理鹽水反復(fù)灌洗腎臟，觀察腎臟顏色變白后按照常規(guī)細(xì)胞原代培養(yǎng)方法進(jìn)行[5,6]。6～15代的GMC饑餓24h后進(jìn)行機(jī)械拉伸處理。

1.3 機(jī)械應(yīng)激(Stretch)實(shí)驗(yàn)操作方法

6～15代GMC細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液后鋪在一種特殊的6孔板上，底部有彈性，涂有牛I型膠原蛋白(購置于Flexcell International公司，美國)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%～95%時饑餓24h。機(jī)械應(yīng)激實(shí)驗(yàn)前先加入TβR1阻斷劑SB431542 (5 mM, 30 minutes)，然后將鋪滿細(xì)胞的6孔板置于一種機(jī)器控制的真空中(Flexercell 4000, Flexcell International Corp.)，連續(xù)循環(huán)拉伸/放松，每循環(huán)0.5秒的拉伸和0.5秒的放松，總共60個循環(huán)/min。

1.4 Wester Blot方法檢測細(xì)胞中CTGF和P-Smad3蛋白表達(dá)

取對數(shù)生長期的GMC，調(diào)整其濃度為2.5×105/mL，每孔1mL，接種于直徑6cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)到80%～85%時饑餓24h，分為正常對照組、Stretch 1h組、Stretch 3h組、Stretch 6h組，固定時間點(diǎn)加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min，14000r /min，4℃離心10min收集上清。采用SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達(dá)，各泳道蛋白上樣量為50μg。再將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到0.45μm硝酸纖維素膜( NC膜) 上，NC 膜用脫脂奶粉進(jìn)行封閉，然后與一抗孵育4℃過夜，TBST 洗滌后再與過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2h，TBST再次洗滌，電化學(xué)發(fā)光( electrochemiluminescence，ECL) 檢測免疫印跡信號，發(fā)光成像儀拍照記錄，Image J圖像分析軟件進(jìn)行條帶分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 機(jī)械應(yīng)激增量調(diào)節(jié)了CTGF的表達(dá)

GMC細(xì)胞通過Stretch處理1h、3h和6h后CTGF的表達(dá)明顯增加，并與作用時間呈正相關(guān)(P<0.05)，說明外源性機(jī)械應(yīng)激可以明顯激活GMC細(xì)胞CTGF的表達(dá)。見圖1。

圖1 機(jī)械應(yīng)激上調(diào)了GMC細(xì)胞CTGF的表達(dá)與對照組相比，*P<0.05。

2.2 機(jī)械應(yīng)激增量調(diào)節(jié)了P-Smad3的表達(dá)

GMC細(xì)胞通過Stretch處理30S、1h和3h后P-Smad3的表達(dá)明顯增加，并與作用時間呈正相關(guān)(P<0.05)，說明外源性機(jī)械應(yīng)激可以明顯激活GMC細(xì)胞P-Smad3的表達(dá)。見圖2。

圖2 機(jī)械應(yīng)激實(shí)驗(yàn)上調(diào)了GMC細(xì)胞P-Smad3的表達(dá)與對照組相比，*P<0.05。

2.3 TβR1阻斷劑低調(diào)節(jié)了機(jī)械應(yīng)激誘導(dǎo)的CTGF增量表達(dá)

GMC細(xì)胞通過Stretch處理1h后CTGF的表達(dá)明顯增加，TβR1阻斷劑則明顯降低了CTGF的表達(dá)(P<0.001)，說明外源性機(jī)械應(yīng)激激活GMC細(xì)胞CTGF的表達(dá)依賴TβR1。見圖3。

圖3 TβR1阻斷劑降低了機(jī)械應(yīng)激誘導(dǎo)的GMC細(xì)胞CTGF增量表達(dá)與對照組相比，P<0.001。

2.4 TβR1阻斷劑低調(diào)節(jié)了機(jī)械應(yīng)激誘導(dǎo)的P-Smad3增量表達(dá)

GMC細(xì)胞通過Stretch處理1h后P-Smad3的表達(dá)明顯增加，TβR1阻斷劑則明顯降低了P-Smad3的表達(dá)(P<0.01)，說明外源性機(jī)械應(yīng)激激活GMC細(xì)胞P-Smad3的表達(dá)依賴TβR1。見圖4。

圖4 TβR1阻斷劑降低了機(jī)械應(yīng)激誘導(dǎo)的GMC細(xì)胞P-Smad3增量表達(dá)與對照組相比， P<0.01。

3 討論

更深入地了解調(diào)節(jié)基質(zhì)生成的分子機(jī)制，對于發(fā)掘治療慢性腎臟疾病的新的潛在治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。我們目前的研究提出了幾個新發(fā)現(xiàn)。首先我們確定了機(jī)械性拉伸實(shí)驗(yàn)以一種配體獨(dú)立反式激活方式激活TβR1發(fā)揮促纖維化作用。也就是說在沒有TGF-β1存在的情況下，GMC處于一種機(jī)械應(yīng)激狀態(tài)下TβR1可以被激活，發(fā)揮誘導(dǎo)基質(zhì)生成促纖維化的作用。事實(shí)上，大量文獻(xiàn)已經(jīng)證實(shí)，雖然Stretch可以誘導(dǎo)TGF-β1分泌水平增加，但均發(fā)生與Stretch后48～72h[7]。而本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Stretch 1h后 TβR1已經(jīng)活化。GMC中TGF-β1的分泌比信號通路的激活和CTGF的上調(diào)晚得多。

體外研究證實(shí)，CTGF誘導(dǎo)的GMC改變，主要涉及到了腎臟病變程度的進(jìn)展[8]。CTGF的作用機(jī)制主要涉及到增量調(diào)節(jié)了纖維連接蛋白和纖溶酶原激活物抑制因子的合成，結(jié)果引起了GMC外基質(zhì)產(chǎn)生的增加和積聚。TGF-β1與CTGF有著及其相似的功能。但是CTGF的siRNA或者RNAi均能抑制TGF-β1的這種作用。慢性腎臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中，無論是基質(zhì)擴(kuò)張，還是GMC肥大，病理改變均發(fā)生于系膜區(qū)，由此說明TGF-β1是腎臟疾病病理損傷中的決定性因子。在此過程中CTGF則是促進(jìn)TGF-β1作用發(fā)揮并增強(qiáng)其效應(yīng)的重要調(diào)節(jié)子[9]。相關(guān)文獻(xiàn)證明盡管機(jī)械應(yīng)激導(dǎo)致GMC中CTGF上調(diào)，但其上調(diào)的機(jī)制尚不清楚[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TβR1在機(jī)械應(yīng)激誘導(dǎo)的Smad3的磷酸化和CTGF表達(dá)上調(diào)中是絕對需要的。有趣的是，Smad3的激活是由配體獨(dú)立的TβR1激活介導(dǎo)的。相關(guān)文獻(xiàn)證明，Smad3也參與了內(nèi)半月板細(xì)胞機(jī)械應(yīng)激誘導(dǎo)的CTGF表達(dá)[11]。綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1是GMC機(jī)械應(yīng)激誘導(dǎo)CTGF上調(diào)的重要誘導(dǎo)子，Smad3作為TGF-β1下游蛋白也是誘導(dǎo)CTGF增量表達(dá)所必須的。我們的研究為評估TGF-β1抑制劑作為一種慢性腎臟疾病的新型抗纖維化策略提供了強(qiáng)有力的基礎(chǔ)。