莊慧宇，張志強(qiáng)，王 維，瞿 紅，婁 彤，朱連成，劉娟娟，劉大我，林 蓓，王淑珍

人附睪蛋白4（human epididymis protein 4，HE4），又名乳清酸性蛋白，最早發(fā)現(xiàn)在人附睪中表達(dá)[1]，有研究證明，HE4不僅在卵巢癌中高表達(dá)，在子宮內(nèi)膜癌、肺腺癌等惡性腫瘤中也均有較高表達(dá)[2]。2005年有研究證實HE4是一種分泌性糖蛋白[3]。細(xì)胞膜上廣泛表達(dá)的糖基抗原是糖蛋白的重要組成部分，其改變與細(xì)胞的惡變、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性有著密切的聯(lián)系。巖藻糖廣泛參與各種糖鏈的構(gòu)成，Lewis聚糖是巖藻糖化的乳糖系列聚糖，根據(jù)其糖鏈結(jié)構(gòu)不同分為Lewis y、Lewis x、Lewis a、Lewis b、sLewis a和sLewis x。和唾液酸類似，一般認(rèn)為巖藻糖是糖鏈合成的終末殘基，接上巖藻糖基后，該糖鏈就不再繼續(xù)合成。巖藻糖糖鏈結(jié)構(gòu)改變與某些腫瘤細(xì)胞的惡性行為有關(guān)[4]。前期研究證明，卵巢惡性腫瘤細(xì)胞和組織中的HE4上均有Lewis y抗原的表達(dá)[5]，本實驗通過檢測多種上皮性腫瘤細(xì)胞中HE4表面巖藻糖基化抗原的表達(dá)，證明HE4表面巖藻糖基化修飾的普遍性，并證明卵巢癌細(xì)胞中HE4上的Ⅱ型糖鏈的表達(dá)明顯高于Ⅰ型糖鏈。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系來源 OVCA R-3、SKOV-3、ES-2及CaoV-3（卵巢癌細(xì)胞系），A549（肺癌），MCF7（乳腺癌），AsPC1（胰腺癌）和 HT-29（結(jié)腸癌）均購買于上海細(xì)胞庫。OVCAR-3、SKOV-3、ES-2、HT29在加了10%血清的McCoy's 5A（Invitrogen）培養(yǎng)基中培養(yǎng)。CaoV-3、AsPC-1使用1640（Hyclone）培養(yǎng)基，A549、MCF7使用 DMEM（Hyclone）培養(yǎng)基。

1.2 方法 首先選擇了高度表達(dá)HE4蛋白的卵巢癌和肺腺癌細(xì)胞、中度表達(dá)的乳腺癌和胰腺癌細(xì)胞以及低表達(dá)HE4的結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行研究。利用Western blot、免疫細(xì)胞化學(xué)以及Real time PCR分別檢測了上述8種細(xì)胞中HE4和Lewis y的表達(dá)。為了進(jìn)一步探討HE4表面是否還存在其他巖藻糖基化修飾，利用免疫共沉淀以及激光共聚焦對上述8種細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.2.1 免疫細(xì)胞化學(xué) 用0.25%胰蛋白酶消化對數(shù)生長期細(xì)胞，在含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并制成單細(xì)胞懸液。冷PBS洗滌細(xì)胞2次，4%甲醛固定30 min。兔抗人HE4抗體（Abcam，單克隆抗體）工作濃度為1：300和鼠抗人Lewis y抗體（Abcam，單克隆抗體）工作濃度為1：100。染色方法按SABC試劑盒說明書進(jìn)行。陰性對照由磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗。

1.2.2 實時定量PCR 按照說明書使用Trizol（Invitrogen）提取總RNA。取RNA 2 μl按照說明書合成cDNA（寶生物工程有限公司，中國）。SYBR Green RT-qPCR引物序列如下：人HE4：F：5'-AGTGTCCTGGCCAGATGAAATG-3'；R：5'-CAGGTGGGCTGGAACCAGAT-3'。FUT1：F：5'-TGGTTGGGAAAGGGAGAA-3'；R：5'-CGCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3'。GAPDH：F：5'-ATGGAAATCCCATCACCATCTT-3'；R：5'-CGC CCCACTTGATTTTGG-3'。應(yīng)用Light Cycler PCR 檢測系統(tǒng)（羅氏診斷產(chǎn)品公司，德國）按說明書進(jìn)行Real-time PCR（寶生物工程有限公司，中國）擴(kuò)增并檢測Ct值。目的基因表達(dá)倍數(shù)的改變利用2-ΔΔCT法進(jìn)行計算。2-ΔΔCT結(jié)果大于1.4或者小于0.6被認(rèn)為是有意義的。

1.2.3 免疫共沉淀 分別收集上述各種細(xì)胞，4 ℃裂解30 min，15 000 rpm離心30 min后取上清。上清中加入5 μg抗HE4抗體（Santa Cruz，山羊抗人多克隆抗體），4 ℃孵育過夜后，加入20 μl ProteinA/G PLUSAgarose（Santa Cruz），4 ℃，3 h。3 000 rpm離心5 min，1 ml裂解液洗滌沉淀，重復(fù)3次。免疫沉淀物變性后在Western Blot方法中分別用HE4抗體（Abcam，兔抗人單克隆抗體）和Lewis y抗體（Abcam，鼠抗人單克隆抗體）、Lewis x抗體（Santa Cruz，鼠抗人多克隆抗體）、saily Lewis x抗體（Lifespan，鼠抗人單克隆抗體）、Lewis a抗體（Abcam，鼠抗人單克隆抗體）、Lewis b抗體（Abcam，鼠抗人單克隆抗體）、saily Lewis a抗體（Millipore，鼠抗人單克隆抗體）檢測。ECL（Amersham）發(fā)光試劑發(fā)光。

1.2.4 激光共聚焦法 選取CaoV-3細(xì)胞，切片制作方法同免疫細(xì)胞化學(xué)。采用免疫熒光雙標(biāo)記法，每張切片中一抗同時加入HE4和Lewis y抗體，同時設(shè)磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作空白對照片。兔抗人HE4和鼠抗人Lewis y抗體工作濃度均為1∶100，山羊抗兔IgG TRITC、山羊抗鼠IgM FITC的工作濃度為1∶100，2種一抗和二抗均按1∶1均勻混合加入標(biāo)本中。染色方法按免疫熒光試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以表示，采用χ2檢驗及Fisher確切概率檢驗，2組間比較進(jìn)行t檢驗，多組間比較采用方差分析，相關(guān)分析采用χ2檢驗，分析密切程度用Pearson列聯(lián)系數(shù)C和直線回歸相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各種腫瘤細(xì)胞中HE4和Lewis y的表達(dá)情況 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8種細(xì)胞中均有HE4和Lewis y抗原，且Western blot（圖1A、B）、免疫細(xì)胞化學(xué)（圖1C）以及Real time PCR（圖1D）結(jié)果一致，卵巢癌細(xì)胞系（OVCZR-3，SKOV-3，ES-2，CaoV-3）和肺腺癌細(xì)胞（A549）中的HE4表達(dá)相對較高，高于乳腺癌（MCF7）和胰腺癌細(xì)胞（AsPC1）的表達(dá)，結(jié)腸癌（HT-29）中HE4的表達(dá)量最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1B）。但Lewis y的表達(dá)量在各種細(xì)胞中高低不一，可能與多種腫瘤相關(guān)蛋白表面均有Lewis y結(jié)構(gòu)有關(guān)。免疫細(xì)胞化學(xué)可以發(fā)現(xiàn)：HE4染色呈棕黃色顆粒或淡黃色顆粒，主要分布于胞漿，胞膜和核周也可見著色；Lewis y抗原也呈陽性表達(dá)，廣泛分布于胞膜和胞漿（圖1C）。

圖1 HE4和Lewis y抗原在多種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 各種腫瘤細(xì)胞中HE4與Lewi s抗原的共表達(dá)情況 免疫共沉淀提示，8種細(xì)胞HE4表面均有Lewis y、Lewis x、sLewis x、Lewis a、Lewis b、sLewis a的表達(dá)，但同種細(xì)胞中Ⅱ型糖鏈Lewis y、Lewis x、sLewis x的表達(dá)明顯高于Ⅰ型糖鏈Lewis a、Lewis b、sLewis a（圖2）。激光共聚焦也均檢測到8種細(xì)胞中HE4和Lewis抗原的共定位，但HE4和Lewis y抗原之間的共定位最明顯，尤其在卵巢癌細(xì)胞株中（部分結(jié)果未顯示）：在卵巢癌細(xì)胞OVCAR3中，HE4主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿；Lewis y抗原也主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿。兩通道合成后的圖像中，同時發(fā)出紅光和綠光的位置見到黃色熒光發(fā)出，證明HE4與Lewis y抗原存在共定位關(guān)系（圖3）。

圖2 免疫共沉淀檢測HE4及Lewis抗原在多種腫瘤細(xì)胞中的共表達(dá)情況

圖3 激光共聚焦檢測卵巢癌細(xì)胞CaoV-3中HE4及Lewis y抗原共定位情況表達(dá)情況

3 討論

Lewis y抗原是含有雙巖藻糖的寡糖，研究發(fā)現(xiàn)75%的上皮性卵巢癌中有Lewis y不同程度的過量表達(dá)，且表達(dá)增高的患者預(yù)后不佳[6]。除了上皮性卵巢癌腫瘤標(biāo)志物CA125和MUC-1的分子結(jié)構(gòu)中含有Lewis y抗原[7]外，還發(fā)現(xiàn)，最新的上皮性卵巢癌腫瘤標(biāo)志物HE4上也存在Lewis y抗原結(jié)構(gòu)[5]。同時，課題組前期研究還證實了表皮生長因子受體、整合素α5β1、CD44等糖復(fù)合物表面也存在Lewis y抗原結(jié)構(gòu)[8-9]。前期研究證明，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的Lewis y抗原通過改變相應(yīng)受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路磷酸化水平，參與許多細(xì)胞功能，影響細(xì)胞的惡性行為，包括粘附、識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，Lewis y抗原增加有利于腫瘤細(xì)胞的侵襲和播散[5]。

本研究對多種腫瘤細(xì)胞HE4表面的巖藻糖基化修飾進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HE4的巖藻糖基化修飾不僅發(fā)生在卵巢癌，在肺癌、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等細(xì)胞系中也檢測到HE4的巖藻糖基化修飾。本研究還證明了HE4上不僅存在Lewis y抗原修飾，還檢測到Lewis x、Lewis a、Lewis b、sLewis a和sLewis x的結(jié)構(gòu)。在不同細(xì)胞系中這種修飾存在量的差異，但是在同一細(xì)胞系中Lewis y、Lewis x、sLewis x等乳糖系列Ⅱ型糖鏈的修飾明顯高于Lewis a、Lewis b、sLewis a等Ⅰ型糖鏈表達(dá)，這可能與細(xì)胞系中a1，2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因高表達(dá)相關(guān)。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CaoV-3、SKOV3卵巢癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移和侵襲能力均較ES-2和OVCAR3強(qiáng)（P＜0.05）[9]，同時免疫共沉淀結(jié)果證明Caov-3、SKOV3細(xì)胞中HE4上Lewis y抗原的相對量也高于ES-2和OVCAR-3，而Lewis x抗原的相對量卻低于ES-2和OVCAR-3，說明轉(zhuǎn)移和侵襲能力強(qiáng)的細(xì)胞中的Lewis x抗原繼續(xù)被糖基化，多以Lewis y形式存在，而Lewis y抗原為雙巖藻糖比Lewis x對基質(zhì)的粘附性更強(qiáng)。為了進(jìn)一步證實Lewis y抗原對HE4介導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響，選擇了HE4上Lewis y抗原相對表達(dá)高的CaoV-3細(xì)胞和Lewis x抗原相對表達(dá)高，但Lewis y抗原相對表達(dá)低的細(xì)胞ES-2進(jìn)行研究。通過轉(zhuǎn)染HE4后，2種細(xì)胞中HE4、Lewis y及HE4上的Lewis y的表達(dá)均增高，且轉(zhuǎn)染后2種細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力較前均增強(qiáng)，特別是ES-2細(xì)胞變化更為明顯，Lewis y抗體阻斷實驗證明，其轉(zhuǎn)移能力6 h開始明顯減弱，侵襲能力24 h明顯減弱，結(jié)果證明HE4上Lewis y的過表達(dá)明顯促進(jìn)了卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[8-9]。

在前期的研究中證實了HE4表面Lewis y抗原的過表達(dá)促進(jìn)了卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，Lewis y抗體阻斷后，侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯下降[5，8-9]。但是否還有其他相關(guān)蛋白或通路參與了Lewis y介導(dǎo)的卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，HE4上Lewis y抗原的過表達(dá)是否影響了卵巢癌細(xì)胞的增殖、耐藥、自噬等其他生物學(xué)行為；肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等其他多種惡性腫瘤細(xì)胞HE4表面巖藻糖基化的修飾是否也像卵巢癌一樣，是否影響了侵襲、轉(zhuǎn)移等相關(guān)的惡性生物學(xué)行為，需要進(jìn)一步研究。另外，近年來，以Lewis y作為靶分子，成功研制的多種含有Lewis y的抗腫瘤藥物[10]，為惡性腫瘤的治療開辟了廣闊的前景。對于FDA批準(zhǔn)的監(jiān)測上皮性卵巢癌的復(fù)發(fā)和進(jìn)展的腫瘤標(biāo)志物HE4[2]，其表面過表達(dá)的Lewis y抗原，是否可以作為識別HE4的標(biāo)志，從而成為臨床治療的新靶點，為預(yù)防和治療卵巢癌提供了一個新的途徑，值得進(jìn)一步探討。