顧海龍，楊智景，盧 程，顧 明，馮亞明*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 泰州農(nóng)科所，江蘇 泰州 225300； 2.泰州市水產(chǎn)技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇 泰州 225300； 3.興化市水產(chǎn)技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇 興化 225700)

0 引言

【研究意義】魚類的早期發(fā)育是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)變化的復(fù)雜過程，盡管發(fā)育模式基本類似，但不同物種的受精卵在性質(zhì)、規(guī)格、發(fā)育進(jìn)程等方面存在著一定的差異[1]。因此，開展魚類的早期胚胎發(fā)育研究對(duì)于魚類的孵化與培育具有重要意義。長(zhǎng)春鳊(Parabramispekinensis)隸屬鯉科(Cyprinidae)、鳊屬(Parabramis)，俗稱長(zhǎng)身鳊、草鳊，廣泛分布于全國(guó)各大水系[2]。近年來由于野生資源逐年銳減，長(zhǎng)春鳊越來越受到學(xué)者的關(guān)注[3]，已被列入《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)經(jīng)濟(jì)水生動(dòng)植物資源名錄(第一批)》，但其當(dāng)前仍是少數(shù)未完全熟化推廣全人工繁殖技術(shù)的長(zhǎng)江經(jīng)濟(jì)魚類之一,開展長(zhǎng)春鳊早期發(fā)育研究，對(duì)其實(shí)現(xiàn)人工繁育具有重要現(xiàn)實(shí)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】關(guān)于魚類早期發(fā)育的研究已有很多。胡雪松等[4]研究黑龍江三角魴(Megalobramaterminalis)的胚胎和早期仔魚發(fā)育發(fā)現(xiàn)，在水溫(23.5±1.0)℃時(shí),黑龍江三角魴胚胎從受精到出膜歷時(shí)30 h 10 min，歷經(jīng)7個(gè)主要發(fā)育階段(卵裂前期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、器官形成期、出膜期), 25個(gè)發(fā)育時(shí)期。蔣國(guó)民等[5]以團(tuán)頭魴滅活精子為誘導(dǎo)，采用熱休克染色體加倍處理方法進(jìn)行錦鯉雌核發(fā)育，發(fā)現(xiàn)水溫(20±1)℃時(shí)，錦鯉受精卵50 min后開始卵裂，6 h后出現(xiàn)囊胚期，18 h后出現(xiàn)原腸胚期，30 h后出現(xiàn)神經(jīng)胚期，39 h后器官開始形成，約3 d后可以脫膜孵化?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】長(zhǎng)春鳊作為鳊魴屬魚類中唯一的鳊屬魚，其早期發(fā)育研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過干法受精獲得受精卵，觀察并分析長(zhǎng)春鳊從受精卵到晚期仔魚的全部發(fā)育時(shí)序，旨在為長(zhǎng)春鳊的人工繁殖和苗種培育提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 供試長(zhǎng)春鳊

試驗(yàn)在靖江市濱江水產(chǎn)良種場(chǎng)的長(zhǎng)江名特優(yōu)水產(chǎn)苗種繁育中心進(jìn)行。供試親魚為該良種場(chǎng)自繁培育的長(zhǎng)江第三代長(zhǎng)春鳊。2020年5月22日，選擇體質(zhì)健壯、規(guī)格相近且性腺發(fā)育至Ⅳ期末的長(zhǎng)春鳊親本60尾(雌雄比=1︰1)，體長(zhǎng)(37.5±1.3)cm，體重(1 110.2±80.4)g。采用一次注射法進(jìn)行人工繁殖，雌魚按劑量HCG+DOM+LHRH-A2=(500 IU+2.5 mg+5 μg)/ kg注射催產(chǎn)激素，雄魚劑量減半。通過干法受精獲得受精卵，開展胚胎發(fā)育觀察。

1.2 胚胎發(fā)育觀察

體視顯微鏡下連續(xù)觀察胚胎發(fā)育時(shí)序，每個(gè)發(fā)育時(shí)期隨機(jī)抽取20～30個(gè)受精卵，以50%個(gè)體出現(xiàn)新特征作為發(fā)育時(shí)期的劃分標(biāo)準(zhǔn)，詳細(xì)記錄各期特征。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)春鳊成熟卵的形態(tài)

長(zhǎng)春鳊成熟卵屬漂浮性，淡青色，光滑透明，卵圓形，卵無黏性，遇水吸水約30 min后膨脹至最大，卵黃囊徑平均(1.15±0.15) mm，卵膜徑平均(2.12±0.58) mm。

2.2 長(zhǎng)春鳊胚胎發(fā)育各階段的歷期及形態(tài)特征

人工繁育的長(zhǎng)春鳊胚胎發(fā)育期可概括為胚盤形成期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期及器官分化期等6個(gè)階段，歷時(shí)35 h 10 min。各階段主要特征及在水溫(26±0.5)℃環(huán)境下所需的時(shí)間見表1，各階段形態(tài)特征見圖1。

2.2.1 胚盤期 長(zhǎng)春鳊的卵受精后約42 min，卵內(nèi)原生質(zhì)移動(dòng)集中到動(dòng)物一極，并隆起形成小丘狀的胚盤(圖1-1)。

2.2.2 卵裂期 受精后55 min，隆起的胚盤中央凹陷，分裂形成2個(gè)大小相等的細(xì)胞，進(jìn)入2細(xì)胞期(圖1-2)。10 min后，第二次分裂完成，分裂成2×2排列的4個(gè)細(xì)胞，進(jìn)入4細(xì)胞期(圖1-3)。此后繼續(xù)分裂，先后經(jīng)歷8細(xì)胞期(圖1-4)、16細(xì)胞期(圖1-5)、32細(xì)胞期(圖1-6)等。在進(jìn)行第6次分裂后，分裂成的64個(gè)細(xì)胞大小不均一，排列也開始不甚整齊。細(xì)胞數(shù)繼續(xù)呈指數(shù)增加，受精后約2 h 25 min，分裂成的細(xì)胞越來越小，布滿動(dòng)物極，形成類似桑葚的多細(xì)胞胚(圖1-7)。

2.2.3 囊胚期 隨著細(xì)胞的進(jìn)一步分裂增加，受精后約3 h，卵的動(dòng)物極高高隆起，類似一頂高帽，進(jìn)入囊胚早期(圖1-8)。隨后的1 h 45 min內(nèi)，囊胚細(xì)胞開始擴(kuò)散至扁平，緊貼與卵上，進(jìn)入囊胚晚期(圖1-9)。

2.2.4 原腸胚期 緊貼于卵上囊胚細(xì)胞開始下包，受精后6 h 15 min，內(nèi)外胚層分化，下包的邊緣增厚形成胚環(huán)(圖1-10)，隨著下包的繼續(xù)，胚環(huán)的一側(cè)形成盾裝凸起的胚盾(圖1-11)，

當(dāng)下包至卵黃的4/5處時(shí)，即受精后8 h 20 min時(shí)，出現(xiàn)胚體雛形(圖1-12)。

2.2.5 神經(jīng)胚期 受精后9 h 58 min，囊胚下包至植物極時(shí)，形成卵黃栓(圖1-13)，胚體基本成型，隱約可見神經(jīng)版雛形，進(jìn)入神經(jīng)胚期。受精后10 h 40 min，卵黃囊逐漸被全部包裹，胚孔閉合(圖1-14)。

2.2.6 器官分化期 受精后11 h 40 min，胚體形成，肌節(jié)初現(xiàn)，逐漸清晰，此后數(shù)量不斷增加(圖1-15)。受精后12 h 27 min，胚體頭部前端膨大略抬起，眼囊出現(xiàn)，橢圓形(圖1-16)。受精后14 h，胚體尾端慢慢形成尾芽，且出現(xiàn)一圈不太明顯的鰭?cǎi)蓿錇槲馋捲?圖1-17)。約20 min后，胚體頭部出現(xiàn)小泡狀耳囊(圖1-18)。眼囊逐漸凹陷呈杯狀，受精后16 h 45 min，眼晶體形成(圖1-19)，受精后19 h 55 min，耳石也逐步形成(圖1-20)。受精后22 h 28 min，頭部前下方，緊貼卵黃的部位出現(xiàn)長(zhǎng)葫蘆狀的心臟原基(圖1-21)。又經(jīng)歷1 h 25 min，整個(gè)胚體出現(xiàn)頻率越來越高的間歇性顫動(dòng)，進(jìn)入肌肉效應(yīng)期(圖1-22)。隨著胚胎的進(jìn)一步發(fā)育，眼球內(nèi)側(cè)出現(xiàn)深色色素，胚體由顫動(dòng)變?yōu)樵诼涯?nèi)的不停轉(zhuǎn)動(dòng)，胚體體長(zhǎng)增加至約4 mm，最終卵膜破裂，仔魚出膜(圖1-23)，受精后35 h 10 min，出膜率達(dá)50%。

2.3 長(zhǎng)春鳊胚后發(fā)育過程及形態(tài)特征

長(zhǎng)春鳊胚后發(fā)育過程可分為卵黃囊仔魚和晚期仔魚2個(gè)階段，發(fā)育期間由內(nèi)源性營(yíng)養(yǎng)逐漸轉(zhuǎn)化為外源性營(yíng)養(yǎng)。

2.3.1 卵黃囊仔魚 出膜后到卵黃囊完全吸盡階段(圖2-a)，包括卵黃囊尚未耗盡但已開始依賴外源性營(yíng)養(yǎng)的混合營(yíng)養(yǎng)階段，歷時(shí)約2 d。卵黃囊仔魚體色透明，全長(zhǎng)5.03～6.85 mm，肌節(jié)約42對(duì)。卵黃囊前半部橢圓，向后延伸變細(xì)變尖，從后端開始逐漸消耗消失。頭部逐漸脫離卵黃囊并伸直，眼徑約0.4 mm，眼上出現(xiàn)黃色素沉著，眼下黑點(diǎn)清晰。心臟逐漸發(fā)育完全，心房、心室清晰，心率160次/min。血液透明，顯微鏡下可見尾靜脈和主動(dòng)脈間的血液流動(dòng)。鰭?cǎi)蕹霈F(xiàn)并逐步分化發(fā)育。

2.3.2 晚期仔魚 該階段主要以鰾室的形成及各鰭的分化為標(biāo)志(圖2-b)。自卵黃囊完全消失，完全依賴外源性營(yíng)養(yǎng)開始，到鱗片出現(xiàn)為止，歷時(shí)約25 d。晚期仔魚全長(zhǎng)10.25～14.70 mm，體色加深。已開口，頭部背面顏色進(jìn)一步加深，出現(xiàn)呈“八”字形的色素帶。視覺發(fā)達(dá)，眼烏黑外突，耳囊明顯，耳石清晰可見。鰓蓋逐步遮蓋住鰓絲。鰾室形成，背鰭、尾鰭、臀鰭、腹鰭依次分化發(fā)育。腸管清晰可見，仔魚攝食行為強(qiáng)烈，腸道飽滿。

注：a為卵黃囊仔魚，b為晚期仔魚。

3 討論

研究表明，長(zhǎng)春鳊的發(fā)育過程與其他常養(yǎng)魚類[6-8]類似，但長(zhǎng)春鳊的卵無黏性，與團(tuán)頭魴[9-10]、三角魴[4]及厚頜魴[11]均不同。長(zhǎng)春鳊的孵化可直接采用草魚的孵化設(shè)備和方法，將收集好的受精卵直接倒入孵化環(huán)道中，充氧流水孵化即可。研究發(fā)現(xiàn)，鳊的卵黃囊直徑尤其是吸水膨脹后的卵膜直徑遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于團(tuán)頭魴[9]等其他魚類，且剛出膜的魚苗體長(zhǎng)也大于團(tuán)頭魴[10]。較大的卵黃囊和魚苗意味著前期親本需要更多的營(yíng)養(yǎng)積累，前期的強(qiáng)化培育極為重要；同時(shí)，卵膜大、出膜時(shí)間短，造成鳊在孵化出膜期間，水質(zhì)容易變差，需要更頻繁的換水和更大的換水量，防止因水質(zhì)問題而降低出苗率。出膜后及時(shí)投喂輪蟲、枝角類等生物餌料。

受精卵的孵化是在孵化酶作用下發(fā)生的一系列生理生化過程[12-13]。孵化酶的活性直接影響魚類胚胎發(fā)育速度，而孵化酶的分泌和活性又受水溫主要調(diào)控，因此，水溫是魚類胚胎發(fā)育速度的主要影響因子之一[14]。在適宜的孵化溫度范圍內(nèi)，溫度越高，孵化時(shí)間越短。與鰱鳙、團(tuán)頭魴、草魚等大多數(shù)常見淡水魚類一樣，長(zhǎng)春鳊的最適孵化水溫為22～26℃。在發(fā)育所需時(shí)間上，長(zhǎng)春鳊從受精卵到出膜所需時(shí)間相對(duì)較短，一方面可能是品種間的差異性，另一方面是試驗(yàn)期間的水溫較高，為(26±0.5)℃。值得注意的是，在胚胎發(fā)育進(jìn)程上，長(zhǎng)春鳊的胚體肌肉效應(yīng)期出現(xiàn)在眼晶體形成之后，與鰱[15]、鳙[16]、刀鱭[17]等魚類一致，但與團(tuán)頭魴[10]、厚頜魴[11]等不同。

4 結(jié)論

長(zhǎng)春鳊的早期發(fā)育過程可概括為胚盤形成期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期及器官分化期等6個(gè)階段，在水溫(26±0.5)℃環(huán)境下，歷時(shí)約35 h 10 min；胚后發(fā)育過程可分為卵黃囊仔魚和晚期仔魚2個(gè)階段，歷時(shí)約25 d。在發(fā)育時(shí)序上，與魴屬魚之間存在著一定的差異，肌肉效應(yīng)期出現(xiàn)在眼晶體形成之后。