王志恒，韓家晨，徐雯琦，陳曉峰

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙臺研究院，山東 煙臺 264670)

0 引言

【研究意義】黃瓜是南北方廣泛種植的蔬菜作物，種植過程中極易受病蟲害危害，尤以真菌病害的影響最嚴(yán)重，其中較常見的病害有霜霉病〔Pseudoperonosporacubensis(Berk.et Curt.)Rostov.〕、蔓枯病〔Mycosphaerellamelonis(Pas.)Chiu et walker.〕、炭疽病〔Colletotrichumorbiculare(Berk aLMont) Arx.〕和白粉病〔ErysiphecichoracearumZheng & Chen,Sphaerothecacucurbitae(Jacz.) Z.Y.Ahao〕[1-2]。霜霉病又稱跑馬干，是一種通過空氣傳播的毀滅性葉部病害，發(fā)生于黃瓜苗期至成熟期，發(fā)病后若控制不當(dāng)，易導(dǎo)致黃瓜大量減產(chǎn)甚至絕收，嚴(yán)重威脅黃瓜的安全生產(chǎn)。目前采取的主要防止手段是品種更新和藥物防治[3-5]，藥物以化學(xué)農(nóng)藥為主，但長期使用易造成病毒的耐藥性增強(qiáng)，且會(huì)帶來一系列環(huán)境問題[6]。所以，減少低效、高毒且高殘留化學(xué)農(nóng)藥的使用，尋求新型防止藥物是農(nóng)業(yè)現(xiàn)階段發(fā)展的必由之路，對蔬菜安全生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)綠色生態(tài)具有重要現(xiàn)實(shí)意義。【前人研究進(jìn)展】納米材料被譽(yù)為21世紀(jì)的“高科技材料”，其對促進(jìn)植物生長和提高植物抗病性有顯著作用。SWIFT等[7]研究發(fā)現(xiàn)，納米二氧化鈦(5 nm)可以促進(jìn)光吸收，植物的光合效率提高9.8%～21.6%。WANG等[8]報(bào)道，納米銀(5 nm、10 nm)使用濃度為 0.01 mg/L和0.05 mg/L時(shí)能夠促進(jìn)擬南芥的生長；納米銀(25 nm)使用濃度為 1 mg/L時(shí)可促進(jìn)楊樹生長。ADISA等[9]研究發(fā)現(xiàn)，納米二氧化鈰(8 nm)能抑制番茄枯萎病的發(fā)生并提高植物葉綠素含量。王志靜等[10]認(rèn)為，納米銀(10 nm)和納米銅(10 nm)的單劑防治柑橘青霉菌有明顯效果，其EC50分別為2.456 6 mg/L和1.196 2 mg/L。王運(yùn)強(qiáng)等[11]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度納米氧化銅對西瓜幼苗生長有顯著調(diào)節(jié)作用。劉振國等[12]報(bào)道，納米氧化銅處理紫花苜蓿根系的SOD、POD及CAT等抗氧化酶活性達(dá)最高，對根系活力影響顯著。邱凌之等[13]研究發(fā)現(xiàn)，50 mg/L納米氧化鐵對番茄具有促生長效應(yīng)?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】國內(nèi)外學(xué)者圍繞納米材料生理效應(yīng)進(jìn)行了大量研究，然而運(yùn)用納米材料針對黃瓜霜霉病防治方面的相關(guān)研究尚不多見?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在黃瓜真葉期采用葉面噴霧法，研究不同濃度納米氧化銅(CuO NPs)和納米氧化鐵(Fe2O3NPs)懸浮液噴施后再接種霜霉病病原菌黃瓜葉片丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和葉綠素(Chl.a+Chl.b)含量的變化，以及對黃瓜霜霉病的防治效果，以期為黃瓜生產(chǎn)中應(yīng)用納米材料防控黃瓜霜霉病提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 黃瓜 品種為津春四號，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院提供。

1.1.2 藥劑 納米氧化銅(CuO NPs，20 nm)、納米氧化鐵Fe2O3NPs，20 nm)，購自上海攀田粉體材料有限公司。

1.2 方法

1.2.1 材料預(yù)處理

1) 育苗。黃瓜種子采用55℃溫水進(jìn)行溫湯浸種，穴盤育苗，待植株長至4葉一心時(shí)選擇長勢一致、健壯且無病的幼苗備用。

2) 霜霉病病原菌(Pseudoperonosporacubensis)接種液制備。試驗(yàn)于2021年2—6月在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院進(jìn)行。從日光溫室內(nèi)取回自然發(fā)病的黃瓜霜霉病病葉，在適宜條件下用毛刷子蘸取無菌水刷取發(fā)病黃瓜葉片上新鮮的分生孢子，紗布過濾后用無菌水稀釋，在顯微鏡下計(jì)數(shù)制成濃度為1×106個(gè)/mL的分生孢子懸浮液。

3) 納米懸浮液制備。根據(jù)王建榮等[14]的方法，在超純水中按比例分別加入CuO NPs (A)和Fe2O3NPs (B)顆粒，超聲1.5 h制備成濃度為10 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL的懸浮液，備用。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)7個(gè)處理，根據(jù)CuO NPs 和Fe2O3NPs 的處理濃度(10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL)分別設(shè)3個(gè)處理(A1～A3和B1～B3)，以噴施超純水作對照(CK)，每處理6株幼苗，3次重復(fù)。用微型噴霧器將納米材料懸浮液均勻噴灑在葉片正反面，每處理約用懸浮液40 mL，噴灑至懸浮液即將開始滴落為止；24 h后再將病原菌接種液均勻噴灑到黃瓜葉片背面，每處理約需接種液15mL，噴灑至懸浮液即將開始滴落為止；套黑色塑料袋在25～28℃黑暗環(huán)境中保濕48 h后去袋。

1.2.3 指標(biāo)測定

1) 發(fā)病情況。在病原菌接種7 d后對黃瓜霜霉病發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查。參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則(一)殺菌劑防治黃瓜霜霉病》[15]規(guī)定的病害調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn)，各小區(qū)隨機(jī)取4個(gè)樣點(diǎn)，每點(diǎn)調(diào)查2株黃瓜，每株調(diào)查全部葉片。根據(jù)病斑面積占整個(gè)葉面積的百分率分級：0級，無病斑；1級，病斑面積占整片葉面積的5%以下；3級，病斑面積占整片葉面積的6%～10%；5級，病斑面積占整片葉面積的11%～20%；7級，病斑面積占整片葉面積的21%～40%；9級，病斑面積占整片葉面積的40%以上。根據(jù)所得數(shù)據(jù)計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

病情指數(shù)=∑(各級病葉數(shù)×相對級數(shù)值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×9)×100%

防治效果=[1-(CK0×PT1)/(CK1×PT0)]×100%

式中，CK0為對照組施藥前的病情指數(shù)，CK1為對照組施藥后的病情指數(shù)，PT0為試驗(yàn)組施藥前的病情指數(shù)，PT1為試驗(yàn)組施藥后的病情指數(shù)。

2) 丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量。參照李合生等[16-18]的方法，分別在接種病原菌0 h、24 h、48 h、72 h和96 h后隨機(jī)選擇黃瓜葉片，測定丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)的含量。

3) 葉綠素含量。參照LICHTENTHALER[19]的紫外吸收法進(jìn)行測定。首先，在接種病原菌14 d后取50 mg新鮮黃瓜葉片樣品，切成約1 cm的碎塊，加入15 mL試管中，用10 mL丙酮-乙醇提取液(V∶V=1∶1)進(jìn)行修正，加塞。然后在黑暗避光中保存72 h，用紫外可見分光光度計(jì)在波長664.2 nm和664.2 nm分別測定吸光度值(A)，計(jì)算葉綠素A、葉綠素B和總?cè)~綠素含量。

葉綠素A含量=13.36A664.2-5.19A648.6

葉綠素B含量=27.43A648.6-8.12A664.2

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2016記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算繪圖；采用SPSS 26.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan’s新復(fù)極差法比較和差異顯著性檢驗(yàn)(P≤0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種納米材料處理黃瓜葉片霜霉病的病情指數(shù)及防治效果

從表1看出，CuO NPs和Fe2O3NPs懸浮液處理黃瓜霜霉病的病情指數(shù)和防治效果均存在差異。

2.1.1 病情指數(shù) CuO NPs處理的黃瓜霜霉病病情指數(shù)為2.03～4.68，F(xiàn)e2O3NPs處理的病情指數(shù)為2.90～4.63。表明，2種納米材料處理黃瓜霜霉病的病情指數(shù)均顯著低于CK(12.73)。

2.1.2 防治效果 CuO NPs處理的防治效果為40.75%～72.23%，隨CuO NPs濃度增大防治效果呈先升后降趨勢，表現(xiàn)為A2>A3>A1。其中，A2的防治效果最好，為72.23%，顯著高于A1和A3，較A1提高31.48百分點(diǎn)；A3的防治效果為51.46%，較A2降低20.77百分點(diǎn)，且葉片出現(xiàn)發(fā)黃萎蔫。Fe2O3NPs處理的防治效果為58.73%～71.24%，隨Fe2O3NPs濃度增大防治效果呈逐漸上升趨勢，表現(xiàn)為B3>B2>B1。其中，B3的防治效果為71.24%，較B1和B2分別提顯著高12.51百分點(diǎn)和10.84百分點(diǎn)；B1與B2的防治效果差異不顯著。表明，50 μg/mL CuO NPs和100 μg/mL Fe2O3NPs 的防治效果最好。

表1 不同納米材料處理黃瓜霜霉病的病情指數(shù)及防治效果

2.2 2種納米材料處理黃瓜葉片的MDA含量

由圖1可知，2種納米材料處理不同時(shí)段黃瓜葉片的MDA含量存在差異。

2.2.1 CuO NPs 在接種霜霉病病原菌后CuO NPs各處理的MDA含量隨時(shí)間延長均呈上升趨勢，且均在96 h時(shí)達(dá)最高。0 h時(shí)各處理的MDA含量表現(xiàn)為CK>A1>A3>A2，其余時(shí)段均表現(xiàn)為A3>CK>A1>A2，A1和A2的MDA含量較CK低，A2較A1低，說明10 μg/mL和50 μg/mL納米懸浮液對黃瓜霜霉菌有較好的抑制效果，且50 μg/mL的抑菌效果更加明顯。

2.2.2 Fe2O3NPs 在接種霜霉病病原菌后Fe2O3NPs各處理的MDA含量隨時(shí)間延長均呈上升趨勢，且在96 h時(shí)達(dá)最高。0 h時(shí)各處理的MDA含量均表現(xiàn)為CK>B1>B2>B3，且同一濃度處理72 h與96 h的MDA含量無顯著差異(除處理B3間差異顯著外)；48 h及以后，同一時(shí)段下隨著Fe2O3NPs濃度增大，MDA含量均較CK顯著降低。當(dāng)Fe2O3NPs濃度為100 μg/mL時(shí)，接種病原菌96 h后，黃瓜葉片中MDA含量較CK降低43.3%。

注：圖中不同小寫字母表示各處理間差異顯著 (P≤0.05)。下同。

2.3 2種納米材料處理黃瓜葉片的GSH含量

由圖2可知，2種納米材料處理不同時(shí)段黃瓜葉片的GSH含量存在差異。

2.3.1 CuO NPs 各處理不同時(shí)段黃瓜葉片GSH含量均隨CuO NPs濃度升高呈先升后降趨勢，表現(xiàn)為A2>A1>A3>CK；在0 h之后各處理GSH含量與CK均差異顯著，其中，A2的GSH含量提升最明顯，A1次之，A3的效果最差且在處理48 h時(shí)葉片出現(xiàn)萎蔫發(fā)黃現(xiàn)象。隨處理時(shí)間延長，CK的GSH含量呈逐漸下降趨勢，A1、A2和A3的GSH含量均呈先升后降趨勢，均在72 h達(dá)峰值，隨后迅速下降，96 h時(shí)GSH含量與48 h時(shí)的水平接近。

2.3.2 Fe2O3NPs 各處理不同時(shí)段黃瓜葉片GSH含量呈現(xiàn)與CuO NPs處理不同的上升趨勢，即前72 h GSH含量呈顯著上升趨勢，但96 h時(shí)各處理的GSH含量與72 h時(shí)無明顯變化。0 h之后各處理GSH含量均表現(xiàn)為B3>B2>B1>CK；隨處理時(shí)間延長，CK和B1的GSH含量呈逐漸下降趨勢，B2和B3的GSH含量均呈逐漸上升趨勢。與CK相比，B1的GSH含量較CK略有提高，B2和B3較CK提高顯著。說明霜霉病菌的侵染造成黃瓜葉片GSH含量的下降，B1能緩解病原菌侵染造成的GSH含量下降，而B2和B3的GSH含量顯著上升，且后者作用效果更明顯。

圖2 納米氧化銅和納米氧化鐵處理黃瓜葉片的GSH含量

2.42種納米材料處理黃瓜葉片的葉綠素含量

從表2看出，2種納米材料處理14 d后黃瓜葉片葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量的變化。

2.4.1 CuO NPs 各處理黃瓜葉片的葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量分別為0.742～1.043 mg/g、0.196～0.372 mg/g和0.938～1.415 mg/g，均表現(xiàn)為A1>A2>CK>A3，即隨處理濃度升高葉綠素含量呈先升后降趨勢。其中，A1最高，A2其次，二者差異顯著，且均顯著高于CK，說明該濃度處理對霜霉病病菌有抑制作用，且在A1時(shí)更有利于葉綠素的合成。A3黃瓜葉片的葉綠素a含量顯著低于CK，下降9.842%；其葉綠素b和總?cè)~綠素含量均較CK低，分別下降7.981%和9.459%，但差異均不顯著。

2.4.2 Fe2O3NPs 各處理黃瓜葉片的葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量分別為0.903～1.174 mg/g、0.270～0.362 mg/g和1.173～1.536 mg/g，均表現(xiàn)為B2>B3>B1>CK，即隨處理濃度增大黃瓜葉綠素含量呈顯著上升趨勢，未出現(xiàn)中高濃度抑制的現(xiàn)象。其中，B3最高，顯著高于其余處理；B2其次，顯著高于B1和CK。B3黃瓜葉片的葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量較CK分別上升62.69%、69.95%和48.36%，說明，霜霉病病原菌侵染對葉綠素含量的影響受到明顯抑制。

表2 納米氧化銅和納米氧化鐵處理黃瓜葉片的葉綠素含量

3 討論

當(dāng)前蔬菜病害已成為制約蔬菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大問題，其中卵菌門病害對蔬菜生產(chǎn)造成的損失尤為嚴(yán)重，特別是黃瓜霜霉病菌對一般化學(xué)藥劑已普遍產(chǎn)生抗藥性[20-21]，致防治困難。研究發(fā)現(xiàn)，CuO NPs和Fe2O3NPs對黃瓜霜霉病均具有良好的抑制效果。不同濃度CuO NPs和Fe2O3NPs懸浮液處理可降低黃瓜葉片的病情指數(shù)，且在一定濃度范圍內(nèi)，濃度越大效果越明顯。但100 μg/mL CuO NPs懸浮液處理葉片出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，究其原因是過高濃度的納米材料對黃瓜具有細(xì)胞毒性，與張慧玲[22]研究的高濃度納米材料對植物有負(fù)面效應(yīng)的結(jié)論一致。

丙二醛(MDA)含量通常表示膜脂過氧化程度和膜的損傷程度[11]，膜脂過氧化程度越劇烈，MDA含量越高，則膜損傷越大。隨著CuO NPs和Fe2O3NPs懸浮液處理時(shí)間的增加，黃瓜葉片的MDA含量較CK逐漸下降，膜系統(tǒng)受損程度和膜脂過氧化程度較CK下降；谷胱甘肽(GSH)被認(rèn)為是植物活細(xì)胞體內(nèi)最重要的氧化還原緩沖劑，對應(yīng)急條件下高活性氧水平和產(chǎn)生的氧化應(yīng)激和損傷進(jìn)行解毒[23]。試驗(yàn)中GSH含量較CK逐漸提高，但CuO NPs處理96 h時(shí)的GSH含量呈下降趨勢，而Fe2O3NPs處理未出現(xiàn)下降趨勢，與趙銘等[24]的研究即多種酶聯(lián)合作用清除活性氧導(dǎo)致酶含量降低的結(jié)果一致。與Fe2O3NPs處理不同的是，當(dāng)CuO NPs懸浮液處理濃度過高時(shí)，抗氧化酶系活力升高[12]，納米材料對黃瓜葉片產(chǎn)生的氧化脅迫相應(yīng)增加，在100 μg/mL時(shí)對黃瓜葉片造成氧化損傷，傷害植株。

研究結(jié)果表明，一定濃度納米材料處理后可提高葉綠素含量，其中10 μg/mL CuO NPs和100 μg/mL Fe2O3NPs懸浮液處理的效果最好，而100 μg/mL CuO NPs懸浮液處理黃瓜葉片出現(xiàn)黃化萎蔫現(xiàn)象，說明100 μg/mL CuO NPs懸浮液已對黃瓜葉綠素合成產(chǎn)生抑制，高濃度納米懸浮液的積累對黃瓜生長產(chǎn)生毒害，與王發(fā)園等[25-26]的研究結(jié)果相似。所以，黃瓜葉片對納米氧化銅的耐性比對納米氧化鐵的耐性更弱，此結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證楊遠(yuǎn)強(qiáng)[27]對CuO NPs在植物耐性中的研究結(jié)果。目前還無法準(zhǔn)確判斷黃瓜對CuO NPs和Fe2O3NPs的耐受特性是否高于其他納米材料，未來將繼續(xù)開展試驗(yàn)及細(xì)胞學(xué)相關(guān)研究。

4 結(jié)論

CuO NPs和Fe2O3NPs有效減輕黃瓜霜霉病的發(fā)生，在適宜濃度范圍內(nèi)，CuO NPs和Fe2O3NPs的防效分別為40.75%～72.23%和58.73%～71.24%；同時(shí)，除100 μg/mL CuO NPs處理外，二者均可提高病菌侵染后的葉綠素含量和GSH含量(除CuO NPs處理GSH含量在病原接種后96 h受抑制外)，降低MDA含量，能促進(jìn)黃瓜光合作用及降低膜脂過氧化程度。其中，50 μg/mL CuO NPs和100 μg/mL Fe2O3NPs對黃瓜霜霉病病原菌的抗菌效果最佳；100 μg/mL CuO NPs懸浮液處理對黃瓜葉片產(chǎn)生毒害，進(jìn)而對霜霉病菌的抑制效果顯著減弱。在施用時(shí)應(yīng)根據(jù)種植條件控制施藥濃度，避免施加納米氧化銅濃度過大對黃瓜生長產(chǎn)生損害，影響施用效果和產(chǎn)品收益。