陳丹陽 陳壽明 梅運鵬 甘 勇 楊章明 杜 曉 馬應超李 斌 安德榮

（1西北農(nóng)林科技大學植物保護學院植物病毒和資源微生物實驗室，陜西楊凌 712100；

2四川省煙草公司攀枝花市公司，四川攀枝花 617000；3中國煙草總公司陜西省公司，陜西西安 710000；4中國煙草總公司四川省公司，四川成都 610000）

煙草野火病，又稱火燒病，是由丁香假單胞菌煙草致病變種（Pseudomonas syringae pv.tabaci）侵染引起的細菌性病害，在煙草上發(fā)生較為普遍。該病害首次由美國人Wolf和Foster在1917年報道[1]，隨后在美國、澳大利亞、德國、法國、意大利等國家相繼發(fā)生，嚴重影響了烤煙的質(zhì)量和產(chǎn)量[2]。

20世紀40年代末在我國云南煙區(qū)首次發(fā)現(xiàn)少數(shù)煙株感染了煙草野火病[3]，隨后在多省份煙區(qū)都有發(fā)現(xiàn)，但危害性不是很嚴重。直到20世紀80年代，煙草野火病才開始逐漸從北向南真正傳播，在陜西煙區(qū)和山東煙區(qū)的發(fā)生面積較大，在黑龍江煙區(qū)的發(fā)病率更是達到100%，使烤煙價值喪失，經(jīng)濟損失嚴重，已經(jīng)上升為煙區(qū)主要病害[4]。本文針對煙草野火病的發(fā)病癥狀、病原菌的生物學特征、流行規(guī)律、病原菌鑒定方法及綜合防治等方面的研究進行了闡述。

1 煙草野火病田間發(fā)病癥狀

煙草野火病在幼苗期、團棵期和旺長期均可發(fā)生，主要危害葉片，莖稈、果實和萼片偶爾也會發(fā)病[5]。發(fā)病初期，葉片上出現(xiàn)褐色小圓點，隨后周圍形成明顯的黃色暈圈，這是由野火病病原物分泌的毒素導致的（圖1a）。在高溫高濕的適宜條件下，病斑迅速擴大，并大面積連接在一起，像火燒一樣，同時黃色暈圈也隨之變大。當遭遇連續(xù)降雨、濕度較大時，病斑大面積擴展，葉片背面還會有菌膿產(chǎn)生[6]。當天氣少雨干燥時，葉片上的病斑容易脆落，高溫有利于野火病的發(fā)生。

田間煙草野火病與角斑病、赤星病、靶斑病經(jīng)?；旌习l(fā)生，在癥狀上很相似，難以分辨（表1）。有研究表明：煙草野火病菌會產(chǎn)生毒素，使病斑周圍產(chǎn)生黃色暈圈；而煙草角斑病菌不會產(chǎn)生毒素，病斑沒有被黃色暈圈包圍[4]。煙草野火病病斑輪紋成不規(guī)則形和多角形，發(fā)病嚴重時大片病斑連接在一起，同時天氣潮濕時葉片背部會有菌膿產(chǎn)生；而煙草赤星病是真菌性病害，不會產(chǎn)生菌膿，其病斑呈現(xiàn)同心輪紋狀，顏色深（多為深褐色），病斑獨立分布。煙草感染靶斑病后，葉片會出現(xiàn)同心輪紋不規(guī)則斑，病斑被褪綠暈圈包圍，病斑壞死部位容易碎裂，類似打靶打出的洞孔[7]。因此，煙農(nóng)要做好田間病害的監(jiān)控調(diào)查工作，以便于采取相應的防治措施，取得較好的防治效果。

表1 煙草野火病與煙草角斑病、赤星病、靶斑病等相似葉部病害比較

2 煙草野火病病原菌生物學特性

煙草野火病菌是由丁香假單胞菌煙草致病變種引起的一種細菌性病害，發(fā)病較為普遍[8]。丁香假單胞菌煙草致病變種可侵染多個種屬的植物，但在宿主煙草植物上會引發(fā)野火病，在其他非寄主中誘導超敏反應，因而認為煙草才是其真正的寄主[9]。煙草植株感染煙草野火病后，野火病病原菌可分泌一種煙毒素，結(jié)構(gòu)為α-乳酸氨基-β-羥基-Σ-氨基庚二酸內(nèi)酯，它能夠破壞煙草葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能，導致葉片上生成褪綠暈圈和病斑[10]。煙毒素也會干擾寄主組織的遺傳因子代謝和生物膜的谷氨酸代謝，從而導致煙株幼苗發(fā)育不良甚至凋亡[11]。徐 玲等[12]采用注射法將煙草野火病毒素注射到煙葉內(nèi)，觀察處理后的變化，發(fā)現(xiàn)從葉綠體形態(tài)變化到部分細胞出現(xiàn)質(zhì)壁分離再到細胞器逐漸解體，細胞變成碎片，細胞壁斷裂。

蔡訓輝[13]對煙草野火病病原菌進行分離與鑒定，結(jié)果表明，野火病病原菌短桿狀，無莢膜，無芽孢，兩端鈍圓，2～5根單極生鞭毛，革蘭氏染色陰性（圖1b）。煙草野火病病原菌在NA培養(yǎng)基上生長菌落特征是圓形微隆起，整齊，邊緣半透明白色，中心不透明暗黃色。在PDA培養(yǎng)基上菌落呈現(xiàn)灰白色或者乳白色，圓形微隆起。在LB培養(yǎng)基上野火病病原菌菌落呈圓形微隆起，邊緣整齊，顏色從乳白色過渡到灰白色，整體半透明（圖1c）。在金氏B培養(yǎng)基上生長的菌落呈乳白色隆起，在320 nm的紫外燈照射下能夠觀察到綠色熒光[14]。煙草野火病菌的最適生長溫度是28℃，其菌株可以選擇用KB斜面繁殖，然后加入已滅菌的液體石蠟，在4～8℃條件下保存，半年轉(zhuǎn)移1次。

3 煙草野火病流行規(guī)律

煙草野火病的主要初侵染來源是田間越冬病殘體和種子[15]。在我國有學者利用血清學技術(shù)驗證了煙草野火病的初侵染來源是種子和煙草根圍，沒有發(fā)現(xiàn)越冬病殘體帶菌[16]。田間煙草野火病病原菌是通過風雨傳播、氣孔侵染和傷口侵染，其中最主要是通過傷口侵染，病菌擴散到細胞間隙后分泌煙草野火病毒素，從而導致葉綠素合成受阻，周圍產(chǎn)生黃色暈圈[17]。

煙草野火病的發(fā)生受多種因素的影響，如煙草品種、栽培技術(shù)、氣候條件等。我國種植的多數(shù)煙草品種對野火病都沒有抗性或抗性較低，容易感染該病并造成大流行。此外，多施氮肥容易降低煙株對野火病的抗性，而多施磷、鉀肥能夠提高煙株的抗病性[18]。最關(guān)鍵的影響因素是氣候條件，其中濕度決定了煙草是否會感染野火病，濕度大尤其是下雨時，氣孔的開放程度較高，土壤中的病菌會通過雨水傳播從氣孔侵入煙株體內(nèi)，造成病害大流行[19]；惡劣氣候如暴風雨和冰雹等，會對煙草產(chǎn)生很大的傷害，造成的傷口加快了病情的流行。

4 煙草野火病的鑒定方法

煙草野火病最直觀的鑒定方法就是田間癥狀觀察，但由于煙草野火病的發(fā)病癥狀與角斑病比較相似，即使是經(jīng)驗豐富的技術(shù)人員一般也是在普遍發(fā)病之后才能鑒定出來，很難達到預報效果。煙草野火病與煙草赤星病、靶斑病田間發(fā)病癥狀相似，因而癥狀鑒定法非常耗時，效果極差[20]。

目前，常采用組織分離法對煙草野火病病原菌進行分離鑒定：剪取病斑消毒后直接研磨，吸取汁液稀釋成不同濃度并采用涂布平板法進行涂布，放置在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d長出單菌落；隨后開展相關(guān)的生理生化試驗等進行鑒定，如煙草野火病能在金氏B培養(yǎng)基上生長，在紫外燈照射下能觀察到綠色熒光[14]。但是，這種方法操作繁瑣、費時、鑒定準確率還低，不再適用于煙草病害的鑒定[21]。

細菌學最常見的鑒定方法是細菌16S測序，這種技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)病原菌的快速鑒定，但只能鑒定到分類學上的種的級別，對于有?；偷膶僖韵碌男》N病害難以鑒定[22]。

PCR技術(shù)可以很好地解決上述問題，包括實時定量PCR技術(shù)、巢式PCR技術(shù)和多重PCR技術(shù)。其中多重PCR是在一個反應體系中加入2對以上引物，同時擴增出多個核苷酸序列的反應[23]。這種方法操作簡單、方便快捷，能夠快速鑒定出煙草病害，還能一次檢測2種以上病原物，但它對于模板DNA的濃度有要求，需要經(jīng)過提取基因組DNA的步驟，耗費時間較長。

2000年日本學者建立了一種新型的恒溫核酸擴增技術(shù)（LAMP），恒溫條件下，1 h左右就能完成病原菌的檢測鑒定[24]。該擴增技術(shù)的反應成本低廉，特異性較強，反應的2對引物是針對目標序列中的6個區(qū)域設計的，靈敏度高，只需要微量的底物就能完成該反應，鑒定的結(jié)果也很容易判斷，加入特殊物質(zhì)就能發(fā)生特殊顏色變化[20]。

5 煙草野火病的防治

5.1 抗病品種選育

培育抗病新品種是控制煙草野火病最經(jīng)濟有效的方法。我國對于煙草野火病抗病品種的研究較少，且推廣的抗病品種其抗病性也沒有取得很好的防治效果。黃杏娥等[25]選擇24個普通煙草品種和2個野生品種進行煙草野火病抗性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：遼煙15、C28等表現(xiàn)為高感，云南廣泛種植的K326、云煙85表現(xiàn)為中感，對煙草野火病的抗性均較低；而黃花煙和長花煙均表現(xiàn)為高抗，可以作為新的種質(zhì)資源來種植。夏緯躍[26]選擇75個煙草品種進行抗性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：高抗品種、抗病品種、感病品種和高感品種分別有6、25、35、9個；吉林省主栽品種云煙87、吉煙7號等都是感病品種，抗性較差，從而成為病害流行的關(guān)鍵因素。高 崇等[27]對收集到的38個煙草品種采用針刺結(jié)合無針頭注射法進行抗性檢測，將其分為中抗、中感和感病3個抗性類型，其中中抗品種14個、中感品種20個、感病品種4個。由于供試菌株不同，環(huán)境、氣候和試驗地點也有一定差別，每個研究者的試驗結(jié)果都會有一些差異?？偠灾?，國內(nèi)煙草野火病的抗性品種研究還有很長的路要走。

5.2 農(nóng)業(yè)防治

目前，煙草野火病的農(nóng)業(yè)防治主要是采取以下幾種方法：一是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上要注重肥料的施用，少施氮肥、多施磷鉀肥，能有效提高煙株的抗病性；二是及時摘除感病的下層葉片，田間病殘物的清理要徹底，減少病害流行的初侵染來源；三是采取煙稻輪作的方法，減輕病害大面積的發(fā)生。

5.3 化學防治

化學藥劑防治煙草野火病的研究比較多，它也是防治該病害的主要手段。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上使用較多的藥劑有波爾多液、農(nóng)用硫酸鏈霉素、四環(huán)素、細菌清、福美雙、硫酸銅、銅高尚、浸種靈等。前人通過室內(nèi)防效和大田防效試驗，為煙草野火病的化學防治提供了一些思路。魏代福等[28]采用紙碟法測定了福美雙可濕性粉劑等多種藥劑抑制煙草野火病菌的效果，結(jié)果顯示，農(nóng)用鏈霉素與福美雙等5種組合復配使用，抑菌效果比較顯著。劉起業(yè)等[29]通過使用波爾多液、農(nóng)用鏈霉素、氫氧化銅、80%必備波爾多液和自配波爾多液防治山東煙區(qū)的野火病，結(jié)果顯示，在團棵期、旺長期和打頂前各噴施1次自制波爾多液，自配波爾多液中硫酸銅、生石灰和水配比為1∶1∶150時預防效果最好。唐 明等[30]研究了4種化學藥劑和3種噴藥時期對煙草野火病發(fā)生的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4%春雷霉素對煙草野火病的防治效果最好，其次是20%噻菌銅、3%噻霉銅、50%氯溴異氰尿酸，不同噴藥時期防治效果以旺長末期最佳，其次是下部葉成熟期、團棵期。

王振國等[31]采取單獨使用和復配使用的方法研究野火病的最佳防治方案，結(jié)果表明：煙苗生長前期批次使用噻菌銅懸浮液、諾爾霉素水劑+能量金+斯德考普，能有效控制團棵前野火病的發(fā)生；后期批次使用噻菌銅懸浮劑+菌核凈、噻菌銅懸浮劑、諾爾霉素，能夠有效控制后期野火病的發(fā)生。蔡訓輝[13]研究表明，代森錳鋅、多菌靈和多粘類芽孢桿菌對野火病菌有很好的抑制效果。

5.4 生物防治

針對煙草野火病的生物防治研究比較少，主要是研究拮抗菌對煙草野火病的抑制作用?；瘜W農(nóng)藥的應用帶來了很嚴重的“3R”問題，因而目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上對綠色防控的重視程度越來越高。研究并應用拮抗菌和生物工程是煙草野火病生物防治的重要手段，可從發(fā)生煙草野火病的煙田中采集健康煙株的葉片、莖和根際土壤分離篩選和鑒定拮抗菌，為煙草野火病的防治提供新的種質(zhì)資源，從而提高烤煙的產(chǎn)量和質(zhì)量，獲得更高的經(jīng)濟效益。王玲玲[32]從土壤分離到127個菌株，通過平板對峙法篩選出3株對煙草野火病菌抑制效果最佳的菌株，其中枯草芽孢桿菌w-5233對煙草野火病的防治效果最顯著，達80%左右。王娜娜[33]采用平板對峙法及氯仿熏蒸法測定了120株菌株對煙草野火病菌的抑菌作用，結(jié)果篩選到有拮抗作用的菌株共計35株，其中放線菌21株、細菌14株。陳燾[34]利用濾紙法從煙草莖、葉片和土壤中篩選到10株對煙草野火病菌有拮抗作用的菌株，其中16SF34的抑菌圈直徑達到了7.25 mm。蔡訓輝通過平板紙碟法發(fā)現(xiàn)了10株對煙草野火病有拮抗作用的菌株，其中最大的抑菌圈直徑達到了0.73 cm，被鑒定為芽孢桿菌屬。劉天波等[35]從健康煙草葉片上分離到對煙草野火病菌有較好抑制作用的3種拮抗菌群，包括寡養(yǎng)單胞菌、假單胞菌和芽孢桿菌，田間防治效果均在50%以上，其中芽孢桿菌的防治效果顯著優(yōu)于化學藥劑。眾多學者逐漸地意識到生物資源對煙草野火病防治有著明顯的效果，尤其是將生物菌劑和化學藥劑進行復配使用，能夠揚長避短，防治效果較好，可提高烤煙的質(zhì)量，增加經(jīng)濟效益。

6 展望

煙草野火病已成為全國性煙草病害，已經(jīng)上升為煙草生產(chǎn)上的重要病害之一。煙草野火病的田間發(fā)病癥狀與角斑病、真菌性赤星病等病害相似，容易混淆，因而要系統(tǒng)地掌握煙草野火病的鑒定方法，并對各煙區(qū)煙草野火病菌的生理小種進行劃分，以期為煙草抗病品種的選育提供指導?；瘜W藥劑防治煙草野火病成為控制該病害流行的重要手段，但長期使用化學藥劑會對環(huán)境造成嚴重污染，導致煙株產(chǎn)生抗藥性，烤煙質(zhì)量變差，煙農(nóng)經(jīng)濟效益受到嚴重影響。近幾年來，綠色防控管理深入人心，須找到有利于環(huán)境、有利于煙株、有利于經(jīng)濟發(fā)展的防治方法。經(jīng)過科研人員的探索，假單胞菌屬、芽孢桿菌屬等在病害防治方面的應用也取得了一定的成果，為后人指明了方向。目前，芽孢桿菌在生物防治方面的應用較多，這是由于它產(chǎn)生的芽孢具有耐高溫、耐強酸強堿、耐紫外線、耐藥性等特性，能適應不良環(huán)境而得到研究人員的青睞。未來，我們要更重視生物種質(zhì)資源的探索，為煙草野火病的防治提供更有效的方法。