王 茜，喬燕莎，王君碩，李 彥,3，王 璐,3

(1.東華大學(xué) 紡織學(xué)院，上海 201620；2.東華大學(xué) 紡織面料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201620；3.東華大學(xué) 紡織行業(yè)生物醫(yī)用紡織材料與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201620)

人體組織或器官通過薄弱或缺損的部位向外形成突起，稱為疝氣。據(jù)流行病學(xué)資料統(tǒng)計(jì)，疝氣在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率高達(dá)5%，無張力疝修補(bǔ)術(shù)已經(jīng)成為普外科最常見的手術(shù)之一[1-2]。聚丙烯(PP)補(bǔ)片作為臨床使用最廣泛的一類疝修補(bǔ)片[3]，由于其材料本身缺乏足夠的生物相容性，植入人體后會(huì)引發(fā)過度的異物反應(yīng)，阻礙組織與血管的正常新生，導(dǎo)致黏連、感染、慢性疼痛等并發(fā)癥的發(fā)生。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，在開放或腹腔鏡腹股溝疝修補(bǔ)術(shù)后，約有10%～12%的患者會(huì)產(chǎn)生慢性疼痛[4]，植入材料引起的異物反應(yīng)極大影響了患者的術(shù)后愈合。

植入物引起的異物反應(yīng)可歸納為蛋白質(zhì)吸附、急性炎癥、慢性炎癥和纖維化包封4個(gè)階段[5]。其中，非特異性蛋白吸附被認(rèn)為是引發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答的重要步驟[6]。兩性離子聚合物(ZPs)是一類在同一單體單元中同時(shí)包含帶負(fù)電荷和帶正電荷基團(tuán)的親水聚合物。近年來，利用ZPs構(gòu)建親水防污表面已被證明是降低蛋白質(zhì)吸附的有效手段，ZPs中的正負(fù)電荷通過靜電作用與水分子結(jié)合，為蛋白在材料表面的吸附筑成能量壁壘[7]。為實(shí)現(xiàn)兩性離子與疏水材料的結(jié)合，通常采取可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移[8-10]和原子轉(zhuǎn)移自由基聚合[11-13]的方式對(duì)兩性離子進(jìn)行表面接枝；然而，上述方式制備過程繁瑣復(fù)雜、耗時(shí)較長且涉及到引發(fā)劑的殘留[14]，因此，亟需一種簡便高效且生物溫和的方式將ZPs與植入式醫(yī)療器械的惰性表面相結(jié)合。

受茶漬黏附機(jī)制的啟發(fā)，本文利用單寧酸(TA)與金屬三價(jià)鐵離子(Fe3+)的配位作用在PP補(bǔ)片表面經(jīng)由層層自組裝(LBL)搭建金屬酚醛網(wǎng)絡(luò)(MPN)，之后憑借TA與ZPs間的氫鍵和陽離子-π鍵等多重作用，將ZPs——聚羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯(PCBMA)固定在PP補(bǔ)片上，探究涂層補(bǔ)片的抗蛋白吸附性能及細(xì)胞毒性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

材料：聚丙烯(PP)補(bǔ)片，常州市潤源醫(yī)療用品科技有限公司；丙酮、三氯化鐵(FeCl3)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸(HCl)、過硫酸銨(APS)、亞硫酸氫鈉(SBS)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；單寧酸(TA)，文冬化工有限公司；3-((2-(甲基丙烯酰氧)乙基)二甲基銨)丙酸酯(CBMA)，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；磷酸緩沖溶液干粉(PBS)，索萊寶科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、異硫氰酸熒光素(FITC)、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)，上海翊圣生物科技有限公司。

儀器：DXS-10ACKT型掃描電子顯微鏡，日本日立株式會(huì)社；Avance3HD600 MHz型全數(shù)字化核磁共振譜儀，瑞士布魯克公司；Spectrum Two型傅里葉變換紅外光譜儀，美國珀金埃爾默股份有限公司；Escalab 250Xi型X射線光電子能譜儀(XPS)、Multiskan Sky型全波長酶標(biāo)儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；OCA15EC型接觸角測(cè)量儀，德國Data Physics公司；NANO ZS型Zeta電位及粒徑分析儀，英國馬爾文儀器；YG(B)026G型紡織品多功能強(qiáng)力儀，浙江大榮紡織儀器有限公司。

1.2 涂層聚丙烯補(bǔ)片的制備

1.2.1 單寧酸-金屬酚醛涂層的制備

將PP補(bǔ)片先后置于丙酮和去離子水中，分別使用超聲波清洗15 min，干燥；在60 ℃下將PP補(bǔ)片置于0.3 mol/L APS溶液中水浴處理6 h，將PP補(bǔ)片親水預(yù)活化，干燥后待用。

將預(yù)活化后的PP補(bǔ)片先浸入10 mg/mL的FeCl3溶液浸泡5 min，清洗干燥，再浸入10 mg/mL的TA溶液中5 min，清洗干燥，以此為1個(gè)循環(huán)，共循環(huán)處理10次；隨后將補(bǔ)片置于Tris-HCl緩沖溶液(0.05 mol/L，pH=8.5)中浸漬30 min。反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水充分清洗，干燥，將最終得到的補(bǔ)片記為Fe/TA-PP。

1.2.2 兩性離子聚合物的制備

在0.1 g/mL的CBMA水溶液中加入2%的APS和0.5%的SBS，在室溫下攪拌反應(yīng)12 h，反應(yīng)結(jié)束后加入乙醇，分離提純得到聚合物PCBMA。

1.2.3 兩性離子聚合物涂層的制備

配制2 mg/mL PCBMA的Tris-HCl(0.05 mol/L，pH=8.5)溶液，將Fe/TA-PP補(bǔ)片浸漬于其中，在37 ℃、60 r/min的恒溫?fù)u床中反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，使用去離子水充分清洗、干燥，所得補(bǔ)片標(biāo)記為PCBMA-Fe/TA-PP。

1.3 性能測(cè)試與表征

1.3.1 微觀形貌觀察

將PP、Fe/TA-PP和PCBMA-Fe/TA-PP補(bǔ)片固定于樣品臺(tái)，真空鍍金后在掃描電子顯微鏡(SEM)下對(duì)補(bǔ)片單絲表觀形貌進(jìn)行觀察。

1.3.2 理化性能表征

用氘代水(D2O)溶解PCBMA，采用全數(shù)字化核磁共振譜儀對(duì)其核磁共振氫譜(1H NMR)進(jìn)行掃描，評(píng)估PCBMA的組成和化學(xué)結(jié)構(gòu)；采用X射線光電子能譜儀對(duì)PCBMA-Fe/TA-PP的X射線光電子能譜(XPS)進(jìn)行掃描，采用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)PP、Fe/TA-PP和PCBMA-Fe/TA-PP進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)掃描分析，表征補(bǔ)片的表面化學(xué)組成與結(jié)構(gòu)。

將PP、Fe/TA-PP和PCBMA-Fe/TA-PP固定于接觸角測(cè)量儀樣品臺(tái)上，采用液滴法測(cè)試PP的水接觸角，采用氣泡法測(cè)試Fe/TA-PP和PCBMA-Fe/TA-PP的水接觸角，表征其親疏水性。將PP、Fe/TA-PP和PCBMA-Fe/TA-PP固定于Zeta電位及粒徑分析儀樣品臺(tái)上，浸沒于示蹤粒子溶液中，對(duì)其表面電位進(jìn)行測(cè)試。

1.3.3 力學(xué)性能測(cè)試

參照ASTM D5035—2011 (R2019)《織物斷裂強(qiáng)力和伸長率的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法(條樣法)》對(duì)PP和PCBMA-Fe/TA-PP補(bǔ)片進(jìn)行單軸拉伸測(cè)試。分別沿橫向與縱向裁剪成25 mm×75 mm的條形試樣，標(biāo)距設(shè)為50 mm，在樣品條的夾持方向與受力方向平行時(shí)，以200 mm/min的速度拉伸試樣直至樣品斷裂。若測(cè)試過程中樣品條滑移或在夾頭夾持處發(fā)生斷裂，則該數(shù)據(jù)無效。每個(gè)方向重復(fù)測(cè)試5次，取平均值。

1.3.4 抗蛋白吸附性能測(cè)試

選用BSA模擬補(bǔ)片體內(nèi)使用環(huán)境中的蛋白質(zhì)，測(cè)試補(bǔ)片的抗蛋白吸附性能。將PP、Fe/TA-PP和PCBMA-Fe/TA-PP補(bǔ)片裁剪成1 cm×1 cm規(guī)格，分別浸沒于10 mg/mL的BSA溶液中，溶劑為PBS溶液(0.01 mol/L，pH=7.4)，將樣品浸泡12 h后用去離子水清洗，采用1 mg/mL FITC熒光標(biāo)記BSA，避光標(biāo)記4 h后，用PBS溶液(0.01 mol/L，pH=7.4)清洗、干燥，在倒置熒光顯微鏡下觀察蛋白質(zhì)的吸附情況。

1.3.5 細(xì)胞毒性測(cè)試

采用CCK-8測(cè)試PCBMA-Fe/TA-PP補(bǔ)片的細(xì)胞毒性。以1×104個(gè)/孔的密度將小鼠成纖維細(xì)胞(L929)接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，穩(wěn)定貼附后加入滅菌的PP和PCBMA-Fe/TA-PP補(bǔ)片，設(shè)置空白對(duì)照樣，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行樣。培養(yǎng)24 h后，將CCK-8染液加入24孔板孵育2 h，測(cè)試其在450 nm波長下的吸光度值，取平均值(l1、l2分別為樣品和對(duì)照樣品的吸光度值)。利用下式計(jì)算相對(duì)細(xì)胞活力：

R=l1/l2×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 補(bǔ)片涂層的微觀形貌分析

圖1示出補(bǔ)片在SEM下的微觀形貌照片。由圖1(a) 和(b)可以看出，由Fe3+和TA構(gòu)成的MPN層在PP單絲上呈現(xiàn)均勻涂覆，因而PP與Fe/TA-PP在形貌上未表現(xiàn)出顯著差異。通過對(duì)涂層形成過程進(jìn)行分析可知，F(xiàn)e3+與TA的配位過程受到反應(yīng)環(huán)境的影響。一方面，MPN是由TA解離后產(chǎn)生的氧負(fù)離子與Fe3+發(fā)生配位反應(yīng)而形成的，溶液pH值會(huì)影響TA的解離程度，不同的解離程度會(huì)生成不同含量的氧負(fù)離子，其與Fe3+的配比差異過大就會(huì)導(dǎo)致TA-Fe3+顆粒狀聚集體的出現(xiàn)，適宜的酸堿環(huán)境可促進(jìn)MPN網(wǎng)絡(luò)的均勻形成；另一方面，若基材與TA和Fe3+的混合溶液共孵育，TA會(huì)瞬間聚集在Fe3+周圍，生成的配合物沉積到基材上會(huì)呈現(xiàn)出明顯的顆粒狀凸起，而層層自組裝的多步組裝法可將基材表面未發(fā)生配位反應(yīng)的TA和Fe3+洗脫，避免了TA-Fe3+聚集體的形成，使得配合物均勻地分布于基材表面[15]，故據(jù)此推斷，補(bǔ)片單絲表面的MPN涂層所具有的均勻形態(tài)主要?dú)w因于其分子級(jí)組裝結(jié)構(gòu)。

圖2示出CBMA聚合反應(yīng)產(chǎn)物的核磁共振氫譜圖?？芍浠瘜W(xué)位移(δ)在1.98處出現(xiàn)了CBMA聚合后產(chǎn)生的2H峰。PCBMA沉積固定后，補(bǔ)片單絲的表觀形貌仍呈現(xiàn)出均勻的涂層狀(見圖1(c))，此時(shí)是聚合物將單絲包覆，PCBMA與MPN層通過非共價(jià)鍵力結(jié)合，具有一定黏度的聚合物均勻鋪展在補(bǔ)片單絲表面，單絲交界處未顯示出過度沉積。這種溫和的二步沉積涂層方式可較為完整地保留PP補(bǔ)片的原始形貌。

圖2 PCBMA的核磁共振氫譜圖Fig.2 1H NMR spectra of PCBMA

2.2 表面理化性能分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證功能性涂層在PP表面的成功構(gòu)建，對(duì)補(bǔ)片的元素組成進(jìn)行表征，結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯?，在PCBMA-Fe/TA-PP的XPS圖像中出現(xiàn)了LBL層的Fe2s峰以及PCBMA涂層的N1s峰，證明了金屬酚醛/兩性離子聚合物涂層疝修補(bǔ)片的成功制備。

圖3 PCBMA-Fe/TA-PP的X射線光電子能譜圖Fig.3 XPS spectra of PCBMA-Fe/TA-PP

圖4 PP、Fe/TA-PP和PCBMA-Fe/TA-PP的紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectra of PP,Fe/TA-PP and PCBMA-Fe/TA-PP

TA中的酚羥基一方面能通過氫鍵和靜電力等多重作用與基材黏合；另一方面，也能夠?yàn)榛膸砀玫谋砻鏉櫇裥訹17]。圖5示出處理前后補(bǔ)片水接觸角的變化?？芍篗PN將疏水的PP表面改性為親水表面；PCBMA作為ZPs，其聚合物鏈中的正負(fù)離子能夠與水分子在靜電作用力下結(jié)合，形成致密的水合層[18]，進(jìn)一步改善了補(bǔ)片的表面浸潤性，使補(bǔ)片的水接觸角降至37°。

圖5 改性前后補(bǔ)片的水接觸角變化Fig.5 Change in water contact angle of meshes before and after modification

圖6示出處理前后補(bǔ)片的表面電位變化。原始PP補(bǔ)片表面呈電負(fù)性，F(xiàn)e/TA-PP補(bǔ)片的表面電位由原始的-55.7 mV變?yōu)?47.9 mV，F(xiàn)e/TA涂層提高了PP補(bǔ)片的表面電位，這歸因于Fe3+的存在；最終，PCBMA-Fe/TA-PP補(bǔ)片的表面電位提高至-5.14 mV，這是因?yàn)镻CBMA的電中性能夠中和補(bǔ)片表面的一部分電荷。

圖6 改性前后補(bǔ)片的表面Zeta電位變化Fig.6 Change in surface Zeta potential of meshes before and after modification

2.3 力學(xué)性能分析

表1示出改性前后補(bǔ)片的力學(xué)性能指標(biāo)。研究表明：人體腹壁可承受的最大張力為16 N/cm；臨床上通常要求合成補(bǔ)片力學(xué)強(qiáng)度大于 32 N/cm[5]。涂層在PP單絲表面的附著可能會(huì)對(duì)補(bǔ)片的力學(xué)性能產(chǎn)生影響，如果涂層的加入會(huì)顯著改變補(bǔ)片的力學(xué)強(qiáng)度，那么以犧牲補(bǔ)片力學(xué)性能換取補(bǔ)片抗蛋白吸附性能的方式是得不償失的，因此，對(duì)改性前后補(bǔ)片的單向拉伸性能進(jìn)行了分析。

表1 改性前后補(bǔ)片的力學(xué)性能Tab.1 Mechanical properties of meshes before and after modification

對(duì)表1力學(xué)性能結(jié)果進(jìn)行顯著性分析可知，制備PCBMA-Fe/TA涂層的二步沉積法并沒有使補(bǔ)片單向拉伸性能產(chǎn)生顯著性變化；同時(shí)，PCBMA-Fe/TA-PP補(bǔ)片仍然滿足疝修補(bǔ)片的臨床力學(xué)需求，可為腹壁提供較好的力學(xué)支撐。利用這種二步沉積法制備PCBMA-Fe/TA涂層的方式是一種較為溫和的改性方式。

2.4 抗蛋白吸附性能分析

據(jù)資料顯示，白蛋白是血液中最豐富的血漿蛋白，在與補(bǔ)片表面的初始相互作用中起主導(dǎo)作用[19]，因此，本文選用FITC標(biāo)記的BSA對(duì)補(bǔ)片的蛋白吸附性能進(jìn)行定性觀察結(jié)果見圖7。圖中白色高亮處為吸附的BSA。由圖可以看出：原始PP補(bǔ)片表面出現(xiàn)了大面積的熒光，吸附了較多蛋白質(zhì)；而PCBMA-Fe/TA-PP補(bǔ)片表面幾乎沒有熒光標(biāo)記。研究表明，親/疏水表面都能發(fā)生蛋白質(zhì)的非特異性吸附，但疏水表面與蛋白質(zhì)的結(jié)合力更強(qiáng)、黏附牢度更大；通常認(rèn)為親水性表面可賦予材料更優(yōu)異的抗生物污染性能[20]。補(bǔ)片改性后，F(xiàn)e/TA基底賦予了補(bǔ)片一定的親水性，加之ZPs超強(qiáng)的表面水合能力，PCBMA使得改性補(bǔ)片表面形成了致密水合層，增強(qiáng)了補(bǔ)片的防污性能，減少了補(bǔ)片表面吸附的BSA，因此改性后的補(bǔ)片呈現(xiàn)出幾乎沒有熒光標(biāo)記的狀態(tài)。

圖7 BSA-FITC標(biāo)記的補(bǔ)片熒光圖像Fig.7 Fluorescence images labeled by BSA-FITC of meshes

2.5 細(xì)胞毒性分析

通過小鼠成纖維細(xì)胞(L929)與材料共培養(yǎng) 24 h 的狀況可反映改性補(bǔ)片的細(xì)胞毒性。表2示出L929在與補(bǔ)片材料共培養(yǎng)24 h后使用CCK-8測(cè)試的吸光度。計(jì)算可得，PP和PCBMA-Fe/TA-PP補(bǔ)片的相對(duì)細(xì)胞活力分別約為96%和89%，結(jié)果表明，PCBMA-Fe/TA涂層補(bǔ)片不具有細(xì)胞毒性。

表2 小鼠成纖維細(xì)胞在24 h的CCK-8吸光度Tab.2 CCK-8 absorbance value of L929 at 24 h

3 結(jié) 論

1)通過Fe3+和單寧酸(TA)層層自組裝，在聚丙烯(PP)補(bǔ)片表面構(gòu)建了金屬酚醛網(wǎng)絡(luò)(MPN)，利用分子間作用力在其上固載聚羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯(PCBMA)，通過一種簡便高效的方式制備了PCBMA-Fe/TA-PP補(bǔ)片。測(cè)試結(jié)果表明，二步沉積法可成功實(shí)現(xiàn)惰性PP與親水性兩性離子聚合物的有效結(jié)合。

2)PCBMA-Fe/TA涂層在保留了補(bǔ)片力學(xué)強(qiáng)度的基礎(chǔ)上，將疏水PP表面的水接觸角降低至37°，使補(bǔ)片呈現(xiàn)出優(yōu)異的抗蛋白吸附效果。

3)細(xì)胞毒性測(cè)試結(jié)果表明，這種抗生物污染表面具有良好的生物相容性，有望被應(yīng)用于醫(yī)療器械領(lǐng)域的抗污改性。

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