馮海旭，王新華，李 嬌，李 娟，孟 澤，曹 揮，馮 雪

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，山西 太谷 030801）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）又名洋芋、土豆等，屬茄科多年生草本植物，原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)[1]，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。馬鈴薯是世界第四大主糧作物，我國(guó)馬鈴薯種植面積和產(chǎn)量均位于世界前列[2]，山西省是我國(guó)中北部重要的馬鈴薯產(chǎn)區(qū)之一。根據(jù)山西省自然條件和馬鈴薯品種的特點(diǎn)，共劃分為3 個(gè)主要產(chǎn)區(qū)：晉北一季作區(qū)，包括懷仁、左云、岢嵐等地；晉中一二季混作區(qū)，包括左權(quán)、文水等地；晉南二季作區(qū)，包括沁源、蒲縣等地。

馬鈴薯在種植過(guò)程中易受到多種生物與非生物因素的影響，其中，病毒病是導(dǎo)致其質(zhì)量與產(chǎn)量下降的主要因素[3]。馬鈴薯病毒病在我國(guó)各馬鈴薯主產(chǎn)地均能檢測(cè)到，受病毒侵染的馬鈴薯一般會(huì)減產(chǎn)10%～30%，危害嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)達(dá)80%以上甚至絕產(chǎn)[4-6]。被病毒侵染的馬鈴薯葉片通常出現(xiàn)花葉、黃化及皺縮等癥狀[7]，目前已經(jīng)報(bào)道的馬鈴薯病毒有40 多種[8]，其中，較為常見(jiàn)且危害嚴(yán)重的有6 種病毒和1 種類病毒：馬鈴薯A 病毒（potato virus A，PVA）、馬鈴薯Y 病毒（PVY）、馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）、馬鈴薯M 病毒（PVM）、馬鈴薯S 病毒（PVS）、馬鈴薯X 病毒（PVX）和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PSTVd）[9-10]。目前馬鈴薯病毒病的防治主要依靠脫毒種薯的種植和推廣，近年來(lái)山西省已經(jīng)形成以山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高寒區(qū)作物研究所、薯類脫毒中心為核心，多個(gè)馬鈴薯脫毒種薯制種企業(yè)共同參與的種薯產(chǎn)業(yè)體系[11]。然而目前企業(yè)生產(chǎn)的脫毒種薯質(zhì)量參差不齊，脫毒種薯對(duì)于農(nóng)民的成本較高，以及種薯的推廣技術(shù)人員的缺乏等，使得脫毒種薯的全面種植依然存在許多問(wèn)題。

馬鈴薯病毒病在全國(guó)廣泛存在，對(duì)馬鈴薯的質(zhì)量和產(chǎn)量造成了嚴(yán)重?fù)p失。白艷菊等[12]研究表明，PVX 和PVY 分別是我國(guó)南部和北部的優(yōu)勢(shì)病毒。陳瑩等[7]在浙江省7個(gè)地市的馬鈴薯種植區(qū)進(jìn)行了馬鈴薯病毒檢測(cè)，共檢測(cè)到6種馬鈴薯病毒；魏瑤等[3]對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)馬鈴薯病毒病的檢測(cè)結(jié)果表明，PVY 是內(nèi)蒙古馬鈴薯病毒病發(fā)生的優(yōu)勢(shì)病毒，并且存在多種病毒復(fù)合侵染的情況。研究人員對(duì)我國(guó)青海省、福建省、云南省、甘肅省馬鈴薯病毒病的研究表明，田間普遍存在PVS、PVX、PLRV、PVA、PVM、PVY 等病毒，并且病毒的復(fù)合侵染嚴(yán)重[13-17]。

田間病毒調(diào)研時(shí)需要對(duì)大批量樣本進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的病毒種類檢測(cè)和鑒定，所以，選擇合適的檢測(cè)方法至關(guān)重要。馬鈴薯病毒常見(jiàn)的檢測(cè)方法 有ELISA 和RT-PCR 法。1972 年，ENGVALL和PERLMANN 首 次報(bào) 道 了ELISA 的 方 法[18]，但ELISA 對(duì)病毒的檢測(cè)需要與之相對(duì)應(yīng)的特異性抗體，所以，無(wú)法在一次反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)多種病毒的同時(shí)檢測(cè)；同時(shí)由于類病毒本身只含有核酸而沒(méi)有蛋白質(zhì)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)和抗體的特異性結(jié)合，所以，不可用于類病毒的檢測(cè)。PCR是1985年美國(guó)科學(xué)家MULLIS等[19]發(fā)明的一種特異性體外擴(kuò)增DNA 的技術(shù)，由于植物病毒多數(shù)是以單鏈RNA 的形式存在，需要將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（complementary DNA）后再進(jìn)行后續(xù)的擴(kuò)增，即通常采用RT-PCR，此方法在單次試驗(yàn)中同時(shí)檢測(cè)多種病毒時(shí)，引物的設(shè)計(jì)難度較大，且隨著引物數(shù)量的增加，相互間造成的干擾會(huì)使引物特異性隨之下降，易影響復(fù)合侵染樣品檢測(cè)的靈敏性和準(zhǔn)確性。生物芯片技術(shù)檢測(cè)病毒擁有極高的靈敏度，生物芯片利用樣本提取的核酸RNA，由PCR 將其生物信號(hào)放大到230倍，再利用專一性探針進(jìn)行結(jié)合檢測(cè)，其靈敏度比以上檢測(cè)方法（ELISA 或RT-PCR）高，用時(shí)短且結(jié)果肉眼可見(jiàn)，具有可操作性強(qiáng)、綜合成本較低等優(yōu)點(diǎn)[20]。Gene Top PVB-ⅣKit 可對(duì)馬鈴薯常見(jiàn)的7 種病毒（PVA、PVM、PVS、PVX、PVY、PLRV、PMTV）與1 種類病毒PSTVd，以及Ech（Erwinia chrysanthem）（菊歐氏桿菌）等4 種主要危害馬鈴薯的細(xì)菌進(jìn)行快速精準(zhǔn)的檢測(cè)，對(duì)復(fù)合侵染嚴(yán)重的樣品具有檢測(cè)優(yōu)勢(shì)。

山西省是北方馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)之一，馬鈴薯是山西省重要的糧食作物，但是目前還沒(méi)有對(duì)山西省馬鈴薯病毒病發(fā)生、分布有全面檢測(cè)的報(bào)道，也少見(jiàn)對(duì)山西省馬鈴薯病毒病的相關(guān)研究。本研究通過(guò)對(duì)山西省晉北、晉中和晉南3 個(gè)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)8 個(gè)主產(chǎn)地采集的疑似被病毒病侵染的馬鈴薯樣品進(jìn)行生物芯片檢測(cè)，明確了山西省馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)病毒種類及發(fā)生分布情況，旨在為山西省馬鈴薯質(zhì)量的監(jiān)測(cè)、評(píng)價(jià)、病毒病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試馬鈴薯樣品采集信息如表1 所示。

表1 供試馬鈴薯樣品采集信息Tab.1 Collection information of potato samples tested

1.2 方法

2019—2020 年5 月，在山西省晉北、晉中、晉南3 個(gè)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)的8 個(gè)縣采集癥狀為花葉、皺縮、黃化等疑似被病毒侵染的馬鈴薯葉片樣品319 份（表1），采集后將樣品放入采樣袋后置于4 ℃冰箱暫存待用。

本研究使用馬鈴薯病原菌芯片（Ⅳ）檢測(cè)套組（巨合生物科技股份有限公司），按操作要求[20]檢測(cè)樣品感染病原菌情況。具體試驗(yàn)方法參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)采用Microsoft Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯病毒病的癥狀

2019—2020 年在山西省晉北的左云、岢嵐、懷仁、嵐縣，晉中的文水、左權(quán)，晉南的蒲縣、沁源，3 個(gè)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)的共8 個(gè)馬鈴薯主產(chǎn)地采集表現(xiàn)為花葉、皺縮、黃化等癥狀的樣品（圖1）。

圖1 田間馬鈴薯病毒病癥狀Fig.1 Symptoms of potato virus diseases in the fields

2.2 生物芯片檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 檢出病毒種類及檢出率 對(duì)山西省8 個(gè)馬鈴薯主產(chǎn)地采集的全部樣品芯片檢測(cè)結(jié)果表明（表2），319 份樣品中，檢測(cè)到陽(yáng)性樣品共305 份，共檢測(cè)到5 種病毒和1 種類病毒，分別為PVY、PLRV、PVM、PVS、PVX 和PSTVd，病毒總檢出率為95.61%；采集樣本中PVY 發(fā)生率最高，共檢出280 份，總檢出率87.77%；其次是PLRV，共檢測(cè)到140 份，總檢出率為43.89%；PVM、PVS 和PSTVd總檢出數(shù)依次減少，分別為114、70、6 份，總檢出率分別為35.74%、21.94%和1.88%；采集樣本中檢出數(shù)目最少的是PVX，僅1 份，檢出率僅為0.31%，沒(méi)有檢測(cè)到PVA 和馬鈴薯帚頂病毒（potato moptop virus，PMTV）的存在。

表2 山西省馬鈴薯病毒/類病毒分布及檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Distribution and detection results of potato viruses/viroid in Shanxi province

續(xù)表2 山西省馬鈴薯病毒/類病毒分布及檢測(cè)結(jié)果Tab.2（Continued） Distribution and detection results of potato viruses/viroid in Shanxi province

本次生物芯片檢測(cè)到的所有馬鈴薯病毒如圖2所示，其中圖2-Ⅰ的注1 表示無(wú)效數(shù)據(jù)，注2 情況可直接判讀結(jié)果；圖2-Ⅱ?yàn)楸敬螛颖局袡z測(cè)到的所有馬鈴薯病毒病的侵染類型：A.PVM；B.PVYN+PVS；C. PVM+PVS；D. PVY-N+PVS+PLRV；E. PVY-N+PVM+PLRV；F. PVY；G.PVY-N+PVM+PVS+PLRV； H. PVY-N+PLRV；I.PVS+PLRV；J.PVY+PVM+PLRV+PSTVd；K. PVM+PVX；L. PVY-N+PLRV+PSTVd；M. PLRV；N. PVM+PVS+PSTVd；O.PVY+PVM+PVS；P. PVM+PLRV；Q. PVYN+PVM；R.PVY-N。

圖2 全部樣本生物芯片檢測(cè)結(jié)果Fig.2 All samples detection results of biochip

2.2.2 各主產(chǎn)區(qū)病毒檢出情況及危害程度 山西省晉北、晉中及晉南3 個(gè)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)的病毒檢出率分別為95.56%、94.29%、97.10%，相比之下，晉南地區(qū)馬鈴薯病毒病發(fā)生較為嚴(yán)重，晉北和晉中地區(qū)次之。8 個(gè)縣馬鈴薯主產(chǎn)地采集的樣本中被馬鈴薯病毒侵染的檢出率在90.00%～97.83%，晉北4 個(gè)縣馬鈴薯病毒病發(fā)生最為嚴(yán)重的是懷仁，病毒總檢出率為97.83%，并且在懷仁檢測(cè)到本研究中的5 種病毒和1 種類病毒均有存在；其余發(fā)生嚴(yán)重程度依次為左云、岢嵐、嵐縣，檢出率分別為95.56%、95.45%、93.33%；馬鈴薯病毒病在晉中的文水和左權(quán)的檢出率分別為97.50%和90.00%；在晉南的沁源和蒲縣的檢出率分別為97.44%和96.67%。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，檢出率均≥90.00%，說(shuō)明全省范圍內(nèi)馬鈴薯上的馬鈴薯病毒病發(fā)生都較為嚴(yán)重。

2.2.3 檢出病毒在各主產(chǎn)地的發(fā)生情況 在晉北、晉中以及晉南的8 個(gè)馬鈴薯主產(chǎn)地檢出的5 種病毒和1 種類病毒中，PVY、PLRV、PVM 和PVS 在本次所有采樣地均有發(fā)生，其中，PVY 檢出率最高和最低分別出現(xiàn)在文水和嵐縣，檢出率分別為97.50%和77.78%；PLRV 檢出率最高和最低分別出現(xiàn)在嵐縣和文水，檢出率分別為66.67% 和20.00%；PVM 檢出率最高和最低分別出現(xiàn)在嵐縣和文水，檢出率分別為73.33%和17.50%；PVS 檢出率最高和最低分別出現(xiàn)在嵐縣和沁源，檢出率分別為28.89%和15.38%；PSTVd 僅檢出6 份，檢出率為1.88%，其中，懷仁3份，岢嵐、文水、沁源各1份；PVX 僅在懷仁檢出1 份，檢出率為0.31%。結(jié)果表明，每種病毒在各地侵染情況差異較大。

2.2.4 病毒的單獨(dú)侵染及復(fù)合侵染情況 通過(guò)對(duì)8 個(gè)馬鈴薯主產(chǎn)地采集的319 份樣品進(jìn)行生物芯片檢測(cè)結(jié)果（圖2-Ⅱ）表明，陽(yáng)性樣品存在單獨(dú)侵染以及2 種或多種病毒復(fù)合侵染的情況，病毒存在單一侵染和多種病毒復(fù)合侵染的不同組合（表3），檢測(cè)到有3 種病毒存在單獨(dú)侵染、2 種病毒復(fù)合侵染的組合7 種，3 種病毒復(fù)合侵染的組合5 種，4 種病毒復(fù)合侵染的組合2 種，其中，芯片檢測(cè)結(jié)果PVY 和PVY-N 型均歸為PVY。芯片檢測(cè)結(jié)果表明，田間絕大多數(shù)馬鈴薯植株并不只是被一種馬鈴薯病毒單獨(dú)侵染，同時(shí)還存在被多種病毒復(fù)合侵染。本研究的319 份檢測(cè)樣品中，病毒單侵染樣品共122 份，總檢出率為40.00%，PVY、PLRV、PVM 在田間均檢測(cè)到單獨(dú)侵染的情況：PVY 114 份，檢出率為35.74%；PLRV 1 份，檢出率為0.31%；PVM 7 份，檢出率為2.19%。復(fù)合侵染包括2、3、4 種病毒復(fù)合侵染：2 種病毒復(fù)合侵染的組合有7 種，共93 份，總檢出率為29.15%，分別為PVY+PLRV、PVY+PVM、PVM+PLRV、PVY+PVS、PVS+PVM、PVM+PVX、PVS+PLRV，其中，檢出率最高的是PVY+PLRV，共檢測(cè)到53 份，檢出率為16.61%；3 種病毒復(fù)合侵染的組合有5 種，共57 份，總檢出率為17.87%，分別為PVY+PVM+PLRV、PVY+PVS+PLRV、PVM+PVS+PVY、PVY+PLRV+PSTVd、PVM+PVS+PSTVd，其中，檢出率最高的是PVY+PVM+PLRV，共檢測(cè)到28 份，檢出率為8.78%；4 種病毒復(fù)合侵染的組合有2 種，共33 份，總檢出率為10.34%，分別為PVY+PVS+PVM+PLRV 和PVM+PVY+PLRV+PSTVd，分 別 檢測(cè)到30、3份，檢出率分別為9.40%和0.94%。芯片檢測(cè)結(jié)果表明，單一病毒侵染樣本數(shù)＞2 種＞3 種＞4 種病毒復(fù)合侵染，但多種病毒復(fù)合侵染總檢出率為60.00%，大于單一病毒侵染的總檢出率。多種病毒復(fù)合侵染類型中，2 種病毒復(fù)合侵染樣本數(shù)和組合數(shù)在復(fù)合侵染中占比最多，是復(fù)合侵染的主要類型。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，PVY 不僅在單一侵染中占比最高，在本研究的14 種病毒復(fù)合侵染類型共183 份樣本中，PVY 參與的復(fù)合侵染樣本共166 份，同樣占比最高。說(shuō)明PVY 是山西省優(yōu)勢(shì)病毒，田間侵染馬鈴薯的病毒主要以復(fù)合侵染的形式存在。

表3 田間馬鈴薯病毒/類病毒的單獨(dú)侵染以及復(fù)合侵染情況Tab.3 The condition of single and co-infection of potato virus/viroid in the fields

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)山西省晉北、晉中、晉南8 個(gè)馬鈴薯主產(chǎn)地的馬鈴薯病毒病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)研，通過(guò)生物芯片檢測(cè)技術(shù)對(duì)采集的319 份疑似病樣進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)到305 份陽(yáng)性樣品，總檢出率為95.61%，晉北、晉中以及晉南3 個(gè)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)的病毒檢出率在94.29%～97.10%，其中，晉南地區(qū)病毒發(fā)生最為嚴(yán)重，3 地共檢測(cè)到5 種馬鈴薯病毒和1 種類病毒，每種病毒檢出率排序依次為PVY＞PLRV＞PVM＞PVS＞PSTVd＞PVX，其中，PVY 的檢出率最高，是侵染山西省馬鈴薯的優(yōu)勢(shì)病毒。各主產(chǎn)地都存在多種病毒復(fù)合侵染的情況，并且占比較大，其中，懷仁縣檢測(cè)出病毒的種類最多，涵蓋本次檢測(cè)的全部病毒和類病毒。

根據(jù)我國(guó)各地的馬鈴薯病毒檢測(cè)結(jié)果表明，多數(shù)地區(qū)PVY 為侵染馬鈴薯的優(yōu)勢(shì)病毒，各地基本都存在PVS、PLRV 等馬鈴薯常見(jiàn)病毒。郭喜文[21]對(duì)山西省馬鈴薯病毒進(jìn)行了檢測(cè)，但采樣的馬鈴薯產(chǎn)區(qū)局限于山西省北部，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的方法（Double antibody sandwich ELISA，DAS-ELISA）對(duì)PVY、PVS、PVX、PLRV、PVA 以及PVM 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，PVY 和PVS 是限制山西省北部馬鈴薯生產(chǎn)的主要病毒。與前者的檢測(cè)相比，本研究采樣地點(diǎn)更廣，覆蓋山西省晉北、晉中和晉南的馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)；同時(shí)芯片檢測(cè)技術(shù)可檢測(cè)的病毒種類更多，還可以檢測(cè)1 種類病毒和4 種細(xì)菌；所以，從檢測(cè)種類和地域覆蓋性上，結(jié)果更具代表性。郭喜文[21]研究表明，馬鈴薯病毒檢出率從大到小依次為PVY（17.85%）＞PVS（5.95%）＞PLRV（2.64%）＞PVX（1.32%）＞PVM（0.47%）＞PVA（0.09%）；本研究的病毒檢出率排序?yàn)镻VY（87.77%）＞PLRV（43.89%）＞PVM（35.74%）＞PVS（21.94%）＞PSTVd（1.88%）＞PVX（0.31%）。對(duì)山西省馬鈴薯病毒檢測(cè)2 次結(jié)果比較表明，PVY在山西省的發(fā)生率仍為第一，但病毒發(fā)生程度有所改變，PVY 發(fā)生率較之前升高了69.92%；PLRV、PVM、PVS 的檢出率均較2011 年調(diào)研顯著提高，PLRV 和PVM 超越PVS 成為主要病毒；本研究中PVX 僅檢出1 份；檢測(cè)到1 種類病毒PSTVd，檢出率為1.88%。郭喜文從天鎮(zhèn)縣檢測(cè)出1 份PVA，而本研究采集樣本中沒(méi)有檢測(cè)到PVA 的存在。

山西省晉北、晉中、晉南的8 個(gè)馬鈴薯主產(chǎn)地馬鈴薯病毒侵染嚴(yán)重，存在單病毒侵染和多種病毒復(fù)合侵染，其中，3 種病毒單獨(dú)侵染占陽(yáng)性樣本的比例達(dá)40.00%，病毒復(fù)合侵染占陽(yáng)性樣本的比例高達(dá)60.00%。郭喜文[21]共檢測(cè)到6 種單獨(dú)侵染的病毒、由2 種病毒復(fù)合侵染的組合6 種、由3 種病毒復(fù)合侵染的組合2 種；本研究共檢測(cè)到3 種單獨(dú)侵染的病毒、由2 種病毒復(fù)合侵染的組合7 種、由3 種病毒復(fù)合侵染的組合5 種、由4 種病毒復(fù)合侵染的組合2 種；相比之前，病毒復(fù)合侵染組合更加復(fù)雜多樣，多病毒復(fù)合侵染可使發(fā)病癥狀更加明顯，對(duì)產(chǎn)量的影響更大，嚴(yán)重制約山西省馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

傳統(tǒng)的馬鈴薯檢測(cè)方法具有耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)樣本數(shù)量受限、操作復(fù)雜、成本高等缺點(diǎn)，不適用于大批量樣本的同時(shí)檢測(cè)，不便于對(duì)田間馬鈴薯進(jìn)行快速檢測(cè)、監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)。崔紅紅等[22]通過(guò)采集155 個(gè)馬鈴薯樣本，對(duì)湖南省種薯質(zhì)量和病毒病的發(fā)生情況進(jìn)行檢測(cè)。穆艷娥等[23]通過(guò)DAS-ELISA 的方法檢測(cè)到6 種馬鈴薯病毒；2 項(xiàng)研究使用了RT-PCR和DAS-ELISA，但是該技術(shù)對(duì)于大批量的樣本檢測(cè)不具有優(yōu)勢(shì)。盧麗麗等[24]通過(guò)馬鈴薯病原菌芯片檢測(cè)，評(píng)價(jià)了云南大田馬鈴薯種薯和商品薯繁育質(zhì)量，該試驗(yàn)通過(guò)大量采集馬鈴薯樣品進(jìn)行檢測(cè)，共檢出5 種馬鈴薯常見(jiàn)病原菌，可見(jiàn)通過(guò)生物芯片檢測(cè)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、大量的對(duì)目標(biāo)馬鈴薯樣本的檢測(cè)，對(duì)馬鈴薯的監(jiān)測(cè)、檢測(cè)和評(píng)價(jià)具有重要作用。

本研究通過(guò)馬鈴薯病芯片檢測(cè)技術(shù)對(duì)山西省晉北、晉中及晉南的8 個(gè)馬鈴薯主產(chǎn)地進(jìn)行馬鈴薯病毒病全面準(zhǔn)確的檢測(cè)，明確了病毒的發(fā)生分布情況，結(jié)果表明，全省馬鈴薯病毒病的發(fā)生均較為嚴(yán)重。應(yīng)加強(qiáng)種薯質(zhì)量把控，提高抗病育種水平，加大對(duì)蚜蟲(chóng)等傳毒介體的監(jiān)測(cè)和防控，采用科學(xué)合理的耕作制度，才能有效控制馬鈴薯病毒病在田間的發(fā)生和傳播，提高山西省馬鈴薯的質(zhì)量和品質(zhì)。