郭仁波 ，李 萍 ，于翰宗 ，姜 山 ，程 斐 ，孫朝輝

（1.青島農業(yè)大學 園藝學院，山東 青島 266109；2.青島市城陽區(qū)上馬街道辦事處，山東 青島 266112）

大白菜（Brassica campestrisL.ssp. pekinensis，染色體組AA，2n=2x=20）是十字花科蕓薹屬蕓薹種大白菜亞種，是目前我國播種面積最大的蔬菜作物之一。隨著人們對大白菜品質的要求越來越高，品質育種亦受到大白菜育種者的普遍重視。大白菜品質性狀包括商品、風味、營養(yǎng)品質，其中，營養(yǎng)品質由葉球內含有的營養(yǎng)物質決定，大白菜葉球顏色與營養(yǎng)品質、商品品質有著密切關系。彩色大白菜品種選育成為大白菜品質育種的重要方向之一。大白菜葉球的內葉顏色主要有黃色、橘紅色、白色、紫色，中間過渡類型有橘黃色、淡黃色、金黃色等。近年來，我國的育種工作者利用引進的黃心和橘紅心大白菜資源，通過種質改造與創(chuàng)新，陸續(xù)培育出了一系列黃心和橘紅心大白菜新品種。

類胡蘿卜素是植物體中一類重要的呈色組分和有益活性物質，大多為黃、橙或紅色等，是植物葉、花和果實呈色的主要成分之一，只能在植物或微生物中合成，是人體必需的營養(yǎng)成分之一。類胡蘿卜素在植物中擔當葉綠體光合作用的輔助色素并保護葉綠素免受強光破壞，同時也是合成ABA的前體；在動物體中，具有清除自由基、預防腫瘤、預防夜盲癥等功能[1-2]。類胡蘿卜素的種類和含量是評估水果和蔬菜品質的重要參數[3]。研究大白菜類胡蘿卜素種類與積累特點，對今后通過栽培或育種手段提高其類胡蘿卜素含量、改善營養(yǎng)品質、保障人民健康具有重要意義。

目前，已發(fā)現的類胡蘿卜素有700 余種，類胡蘿卜素根據化學結構的不同將其分為兩類，一類是胡蘿卜素（只含碳、氫2 種元素，不含氧元素），另一類是葉黃素（有羥基、酮基、羧基、甲氧基等含氧官能團）。由于生物基質的復雜性，一個完整的類胡蘿卜素分析方法包括3 個步驟，分別是磨樣、提取和檢測。使用液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）可精確的對物質進行定量分析。類胡蘿卜素屬于次級代謝物質，LC-MS/MS 能夠準確進行類胡蘿卜素的定性和定量分析。

以異戊烯焦磷酸為前體，經過異戊二烯焦磷酸構酶（IPPI）、櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸合酶（GGPS）、八氫番茄紅素合酶（PSY）、八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）、ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）、番茄紅素β-環(huán)化酶（LycB）、番茄紅素ε-環(huán)化酶（LycE）等催化，產生各類類胡蘿卜素。前期研究發(fā)現，大白菜葉球內葉黃色、橘紅色是由于類胡蘿卜素的積累造成[4]，大白菜葉球內主要呈色類胡蘿卜素為番茄紅素呈橙紅色，α-胡蘿卜素呈橙黃色，β-胡蘿卜素呈橙黃色，葉黃素呈黃色，新黃質呈黃色，紫黃質呈黃色。類胡蘿卜素種類的不同及含量的差異是造成大白菜葉球呈現不同顏色差異的主要原因[5]。

本研究以不同色澤的大白菜球葉為材料，基于高效液相色譜串聯三重四級桿質譜平臺，通過不同色澤球葉中類胡蘿卜素物質的差異分析，初步揭示不同色澤品種之間的組分差異，旨在為大白菜優(yōu)質資源的篩選和新品種選育提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為6 份成熟期內3 種球葉顏色的大白菜，其中，黃色品種（系）為11-2-266、喜諾傳祺；橘紅色品種（系）為桔紅65 號、ZC22-1；白色品種（系）為青雜三號、128-2-264，均來源于青島國際種苗有限公司。

1.2 試劑與儀器

甲醇、乙腈、乙醇、丙酮、甲酸、甲基叔丁基醚、2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）、正己烷，均為色譜純；氯化鈉、氫氧化鉀，標準品（BOC/Sigma-Aldrich 公司）均為分析純。

離心機（5424R 型號，Eppendorf 公司）、LCMS/MS（QTRAP-6500+型號，SCIEX 公司）、電子天平（AS 60/220.R2 型號，RADWAG 公司）、球磨儀（MM400 型號，Retsch 公司）、離心濃縮儀（CentriVap 型號，LABCONCO 公司）、多管渦旋振蕩器（MIX-200 型號，上海凈信公司）、超聲清洗儀（KQ5200E 型號，昆山舒美公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品提取 按照大白菜發(fā)育周期，于青島農業(yè)大學上馬實驗基地取成熟期球葉內葉，-80 ℃保存，取樣時間均在傍晚并于30 min 內完成，每個品種（系）從3 個成熟度一致的不同單株中取樣作為生物學重復[6]。

取出低溫保存的凍干大白菜球葉樣本，用球磨儀研磨（30 Hz，1 min）至粉末狀。稱取50 mg 研磨后的樣本，用含0.01% BHT（g/mL）的正己烷/丙酮/乙醇混合溶液（體積比1∶1∶2）進行4 ℃過夜提取。室溫下渦旋20 min，重復提取一次后離心合并上清液，將得到的提取液經離子濃縮儀濃縮后用甲醇/甲基叔丁基醚混合溶液（體積比3∶1）復溶[7]，過0.22 μm 濾膜后，保存于棕色進樣瓶中，用于超高效液相色譜（UPLC）和串聯質譜（MS/MS）分析。

1.3.2 色譜質譜分析條件 代謝組分析參考WEI等[8]開發(fā)的廣泛靶向代謝組學研究方法，進行樣品處理、物質提取、上機檢測。經超高效液相色譜和串聯三重四級桿質譜分析，其中，液相檢測色譜柱為C30 柱（3.0 μm，100 mm×2.0 mm），流動相:A 相，甲醇/乙腈（色譜純，Merck）（體積比1∶3）加入0.01% BHT 和0.1%甲酸（色譜，Sigma-Aldrich）；B相，甲基叔丁基醚加入0.01% BHT。梯度洗脫程序：0 min A/B 為100% A，3 min 為100% A，5 min 為30% A,70% B，9 min 為5% A,95% B，10 min 為100% A，11 min 為100% A；流速0.8 mL/min；柱溫28°C；進樣量2 μL。大氣壓化學離子源（Atmospheric Pressure Chemical Iosziaa-lion，APCI）溫度350 °C。基于邁維代謝自建標準品構建MWDB（Metware Database）數據庫，對質譜檢測的數據進行定性分析。利用三重四級桿質譜的多反應監(jiān)測模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM）對代謝物進行定量分析[9]。

1.4 數據分析

使用軟件Analyst 1.6.3 對質譜數據進行處理。根據標準品的保留時間與峰型的信息，對每種物質在不同樣本中檢測到的質譜峰進行校正，以確保定性定量的準確。

代謝物含量數據采用極差法進行歸一化處理，通過R 軟件（https://www.r-project.org/），對代謝物在不同樣本間的積累模式進行聚類分析并使用R 程序腳本繪制聚類熱圖。

2 結果與分析

2.1 類胡蘿卜素物質鑒定與分析

2 個黃色品種（系）（11-2-266、喜諾傳祺）、2 個橘紅色品種（系）（桔紅65 號、ZC22-1）、2 個白色品種（系）（青雜三號、128-2-264）的球葉色澤如圖1所示。6 個不同材料的球葉中共鑒定出44 種類胡蘿卜素物質，主要包括葉黃素（xanthophylls）14 種、胡蘿卜素（carotenes）7 種、胡蘿卜素酯（carotenoid esters）23 種。

圖1 不同顏色的大白菜球葉Fig.1 Bulb leaves of different colors of Chinese cabbage

由表1 可知，黃色球葉材料中，11-2-266 含有類胡蘿卜素物質24 種，喜諾傳祺含有類胡蘿卜素物質25 種。橘紅色球葉材料中，桔紅65 號含有類胡蘿卜素物質22 種，ZC22-1 含有類胡蘿卜素物質24 種。白色球葉材料中，青雜三號含有類胡蘿卜素物質21 種，128-2-264 含有類胡蘿卜素物質24 種。檢測結果表明，黃色球葉材料中類胡蘿卜素種類多于橘紅色和白色球葉材料。將檢測到的所有樣本的積分峰面積比值代入標準曲線線性方程進行計算，進一步帶入公式計算后，最終得到實際樣本中該物質的絕對含量數據（表1）。檢測結果表明，黃色球葉材料中類胡蘿卜素總含量顯著多于橘紅色和白色球葉材料。

表1 不同材料中類胡蘿卜素物質統計Tab.1 Statistics of carotenoids in different materials

2.2 差異類胡蘿卜素物質分析

根據定量分析結果，將類胡蘿卜素分為4 類：（1）在黃色球葉中大量積累的；（2）在橘紅色球葉中大量積累的；（3）在白色球葉中大量積累的；（4）在材料間無顯著積累差異。結果表明，在黃色球葉中優(yōu)勢積累的類胡蘿卜素有14 種，包括葉黃素2 種、胡蘿卜素3 種、胡蘿卜素酯9 種；在橘紅色球葉中優(yōu)勢積累的類胡蘿卜素有12 種，包括葉黃素2 種、胡蘿卜素4 種、胡蘿卜素酯6 種；在白色球葉中優(yōu)勢積累的類胡蘿卜素有7 種，包括葉黃素2 種、胡蘿卜素2 種、胡蘿卜素酯3 種；另外，9 種類胡蘿卜素在材料間無顯著積累差異（圖2）。差異組分的統計結果同樣表明，在黃色球葉中優(yōu)勢積累的類胡蘿卜組分要多于橘紅色球葉和白色球葉。

圖2 樣品總體聚類Fig.2 Sample clustering diagram

2.3 類胡蘿卜素差異代謝關聯分析

為進一步解釋黃色、橘紅色、白色球葉中類胡蘿卜素代謝差異，初步分析了差異類胡蘿卜素物質之間的代謝關聯。首先，整體上數量和含量的優(yōu)勢表明，黃色球葉中類胡蘿卜素物質的積累要優(yōu)于橘紅色和白色球葉。黃色球葉中高量積累的為葉黃素（Lutein）、葉黃素酯類物質，是類胡蘿卜素代謝通路的中下游產物；而橘紅色球葉中高量積累的為八氫番茄紅素、番茄紅素、β-胡蘿卜素，是類胡蘿卜素代謝的上中游產物；白色球葉中較多積累的為α-隱黃質、葉黃素、新黃質、紫黃質，是類胡蘿卜素代謝的中下游產物。對比白心和黃心的代謝產物，本研究發(fā)現，黃心球葉中，葉黃素的大量積累是導致球葉呈現黃色的主要原因，隨著黃色程度的加深，對應葉黃素（Lutein）的絕對質量也隨之增加；雖然白色球葉材料中含有的類胡蘿卜素種類相較于黃心材料更為豐富，但含量上的缺乏導致該球葉并不能呈現肉眼可見的色澤。由此可見，不同類胡蘿卜素種類和含量的積累差異造成不同的大白菜球葉顏色差異，其中，番茄紅素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、葉黃素、新黃質、紫黃質等物質提供了橙紅色和黃色組分，盡管類胡蘿卜素物質的呈色與細胞內pH值、外界環(huán)境刺激等因素有關聯，但總體而言，數量和含量上的優(yōu)勢讓黃色球葉比橘紅色和白色球葉擁有更優(yōu)秀的品質性狀。從單個代謝產物含量上對比分析，橘紅色球葉中番茄紅素和八氫番茄紅素的含量都很低，但呈現的橘紅色卻很明顯，白心和黃心中沒有發(fā)現番茄紅素和八氫番茄紅素，由此可以推斷，橘紅心大白菜球葉中的主要呈色物質是番茄紅素和八氫番茄紅素。

研究人員通過KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數據庫把代謝物含量、表達信息以及基因納入整體網絡進行研究。KEGG 提供的主要公共數據庫整合代謝途徑（pathway）查詢，不僅全面注解催化各步反應的酶，同時提供所有代謝途徑，包含有PDB 庫的鏈接、核苷、氨基酸序列、有機物的生物降解及碳水化合物等，是強有力工具進行生物體內代謝網絡研究、代謝分析。

利用KEGG 數據庫對差異代謝物進行注釋并展示，部分結果如圖3 所示。統計篩選出的差異顯著的代謝物中KEGG 數據庫的注釋情況，部分結果如表2 所示。

圖3 差異代謝物KEGG 通路Fig.3 Differential metabolite KEGG pathway map

表2 差異代謝物KEGG 注釋Tab.2 Differential metabolite KEGG annotation

由圖3、表2 可知，青雜三號（白心）相對于11-2-266（黃心），黃色球葉品種中花藥黃質、紫黃質、葉黃素的含量均出現大幅提高，尤其是葉黃素的絕對含量和差異倍數均大幅提高。在本試驗中明確了大白菜黃色主要是由于球葉積累葉黃素造成的；除此之外，黃色球葉材料還積累較多的花藥黃質、紫黃質等。

3 結論與討論

胡蘿卜素類在植物中以游離態(tài)存在[10]。葉黃素類在植物中會與不同脂肪酸結合形成類胡蘿卜素酯類物質，因此，在植物中既有游離形態(tài)，也有酯化形態(tài)。因此，本試驗建立了2 種類胡蘿卜素檢測方法，分別是常規(guī)類胡蘿卜素檢測和水解類胡蘿卜素酯的皂化類胡蘿卜素檢測。FENG 等[11]研究認為，大白菜球葉呈橘紅色由番茄紅素和β-胡蘿卜素積累造成。SEOHEE 等[12]研究認為，前番茄紅素的積累導致大白菜球葉呈現橘紅色。本試驗中采用LC-MS/MS 法，能夠很好地把歸屬于植物體中次級代謝物的類胡蘿卜素進行準確定性和定量。在大白菜中分離鑒定了44 種類胡蘿卜素成分，多于張寧[13]測定的類胡蘿卜素組分。李佩榮等[14]在試驗中僅在橘紅心材料中檢測到微量的葉黃素，而本試驗黃心和橘紅心大白菜內葉中都檢測到了較多的葉黃素，這或許與新品種中類胡蘿卜素ε-羥化酶（CHYE）[15]不斷得到加強及本試驗采取了全新的水解類胡蘿卜素酯的皂化類胡蘿卜素檢測方法有關。

本試驗明確了大白菜黃色球葉主要是由β-胡蘿卜素和葉黃素的大量積累造成的，而且根據青島農業(yè)大學園藝學院十字花科課題組前期積累發(fā)現，球葉顏色黃色越深，β-胡蘿卜素和葉黃素含量越高；大白菜橘紅色球葉主要是由于內葉積累番茄紅素造成的，橘紅心材料還積累較多的β-胡蘿卜素、少量的葉黃素和紫黃質等。同時研究發(fā)現，橘紅心球葉在切開見光后短時間內（5 min）即可由黃色變?yōu)殚偌t色，隨著時間推移，橘紅色逐漸加深，這個可能是由于光異構作用，使得黃色的前番茄紅素異構為紅色的番茄紅素。由于光不能直接和順式胡蘿卜素前體發(fā)生異構作用，這是否是影響PSⅡ中光捕獲色素蛋白復合體[16-17]的結構，還有待進一步研究。

本研究在部分引進日韓的大白菜黃心品種中檢測到了少量番茄紅素和八氫番茄紅素，由于極少量的番茄紅素和八氫番茄紅素就可在呈色初期呈現黃色，這或許是吉錦品種等日韓及國內晉白菜7 號[18]優(yōu)秀高抗黃心新品種短時間選育出來的可行性方法。同時，從市場商品品種分析，雖然在大白菜球葉顏色育種已經培育出了顏色多樣的品種，目前大白菜品種的球色也僅有黃色、紫色、橘紅色等5 種類型，仍然不能滿足顧客多樣化的市場消費需求，期待蔬菜育種家培育出更多球葉顏色的大白菜優(yōu)質品種。同時值得注意的是，南京農業(yè)大學培育的黃玫瑰形狀白菜[19]在特殊節(jié)日中影響較大。繼續(xù)深入研究，尤其是加強大白菜球葉中類胡蘿卜素的KEGG 通路等球葉顏色形成機制的研究，可為彩色大白菜育種奠定基礎。