時昕曄

（南京師范大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，南京 210023）

在動物的進化進程中，相對低級的原核生物以及相對高級的動植物均逐漸進化出較多應(yīng)對生存的適應(yīng)性機制，以益于自身在相對惡劣的生存環(huán)境中存活乃至繁衍生息。例如南極魚類可以長時期存活于零下的水域環(huán)境中，說明南極魚類進化出了能抵御低水溫的生理策略來適應(yīng)相對嚴(yán)峻的自然環(huán)境［1］。自然界的生物體一直處于環(huán)境因素的作用下，而自然環(huán)境中的低溫因素是對其有影響力的一項重要因素，主要表現(xiàn)于對個體的生長、生物體的自體溫度調(diào)節(jié)、繁育后代等的一系列生命過程中。難以生長、存活與繁衍的低溫環(huán)境會干擾生物體的內(nèi)在機制，譬如會引發(fā)蛋白質(zhì)的異常折疊、抑制胞內(nèi)酶的活性表達、致使細胞內(nèi)的細胞膜流動性變?nèi)跻约凹毎砻姹У男纬傻?。因此，探究低溫適應(yīng)性的相關(guān)機制有利于掌握生物體適應(yīng)多變環(huán)境的特性。

溫度作為重要的生態(tài)因子之一，在水產(chǎn)動物養(yǎng)殖中發(fā)揮重要的作用。已有大量水產(chǎn)物種例如南美白對蝦、雜色鮑、硬骨魚綱等水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的相關(guān)低溫馴化以及冷應(yīng)激的研究，注重分析低溫對諸如此類水產(chǎn)動物的生理和生化影響，并鑒定抗凍的有關(guān)基因等［2］。低溫會影響水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類的自然生長發(fā)育，過低的水域溫度致使養(yǎng)殖魚類大批死亡，造成水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的巨大經(jīng)濟損失。低溫會致使魚類的覓食量減少、基礎(chǔ)代謝率降低、限制抗體的生成和免疫功能，降低其生長速率以及孵育率，妨礙魚類的生理、生長與繁殖等多方面的正常功能發(fā)揮［3］?；蚣易迨侵竵碓从谕粋€祖先，由1個基因通過基因重復(fù)而產(chǎn)生2個或更多的拷貝而構(gòu)成的一組基因。它們在結(jié)構(gòu)和功能上具有明顯的相似性，編碼相似的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。同一基因家族中存在的不同亞型的功能作用及其表達的位置都會有所差異，對于基因家族的研究有助于依據(jù)其具體功能和目標(biāo)性狀縮小研究范圍。AKT/PI3K信號通路主要與細胞的增殖發(fā)育以及免疫功能有關(guān)，在低溫脅迫中對抑制細胞凋亡起關(guān)鍵作用，其中的關(guān)鍵基因AKT、PI3K、GSK3相繼在斑馬魚、黃顙魚、牙鲆中都有研究，與抗凍及AKT/PI3K信號通路相關(guān)的基因CK在鯉魚和斑馬魚中都有較全面的研究［4，5］。

本研究為黑鯛抗凍關(guān)鍵基因家族鑒定，基于已有的基因家族成員，從黑鯛的基因組中篩選了AKT、CK的基因家族成員，對其分子質(zhì)量、等電點、motif結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域等基本信息進行分析，與近緣物種構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，有助于進一步了解魚類相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)及功能，為后續(xù)研究PI3K/AKT信號通路及其中的關(guān)鍵基因奠定基礎(chǔ)。

1 研究方法

1.1 研究樣本的選擇

從已有的黑鯛基因組及注釋（https：//ftp.cngb.org/pub/gigadb/pub/10.5524/100001_1）數(shù)據(jù)中比對篩選獲得目的基因的基因家族氨基酸序列。選取黑鯛的近緣物種金頭鯛、大黃魚的目的基因序列，以常見的模式生物斑馬魚、人類、小鼠的目的基因序列作參考。相關(guān)的氨基酸序列來源于Ensembl數(shù)據(jù)庫（http：//www.ensembl.org）和NCBI數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。

1.2 基因家族序列的獲得

使用TBtools軟件從黑鯛基因組數(shù)據(jù)中篩選出目的基因序列，并基于其保守結(jié)構(gòu)域和親緣關(guān)系對篩選的基因進行分類和命名。分析步驟如下。

1）黑鯛基因組數(shù)據(jù)中心的蛋白質(zhì)序列的提?。夯诨蚪M數(shù)據(jù)的注釋信息，使用TBtools軟件提取CDS序列，將其翻譯為氨基酸序列，并簡化其序列ID。

2）雙向比對獲取備選的序列：使用Blast Wrapper功能，以已經(jīng)獲取的序列作為查詢序列，比對獲得黑鯛中可能的序列，作為備選。上傳至NCBI使用Swissprot數(shù)據(jù)庫進行比對，下載獲取的備選序列信息，查看其基本特征，進行初步篩選。

3）基于保守結(jié)構(gòu)域進行進一步篩選：將備選基因的氨基酸序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫的在線結(jié)構(gòu)域分 析 網(wǎng) 頁（http：//www.ncbi.nlm.nih.gw/structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi），下載得到備選序列的保守結(jié)構(gòu)域，并基于保守結(jié)構(gòu)域?qū)溥x序列進行2次篩選，確認基因家族的成員。

4）根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域的類型、系統(tǒng)進化樹的聚類情況，對相應(yīng)的序列進行分類和命名，含有多個直系同源基因的基因，在后面加數(shù)字以區(qū)分基因的不同拷貝。

1.3 氨基酸序列基本信息分析

借助網(wǎng)絡(luò)在線工具，分析獲取的目的基因序列的理化性質(zhì)及保守結(jié)構(gòu)域等基本信息。

1）使用Compute pI/Mw工具（http：//web.expasy.org/compute_pi/）計算氨基酸序列的等電點（PI）和分子質(zhì)量（MW）。

2）使 用MEME 4.12.0（http：//meme-suite.org/tools/meme）在線程序，對所鑒定的序列中Motifs的保守性進行預(yù)測分析。

3）使用NCBI保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）分析預(yù)測AKT基因的domain結(jié)構(gòu)域的保守性。

4）借助TBtools本地軟件對分析結(jié)果進行可視化。

1.4 基因家族成員的進化分析

利用ClustalX對鑒定的基因家族成員序列和其他選定物種的序列進行比對，獲取的結(jié)果使用MEGA 7軟件應(yīng)用最大似然法（ML）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。借助MEGA 7軟件分析最合適的進化模型，自展值設(shè)為1 000。

2 結(jié)果與分析

將從Ensembl數(shù)據(jù)庫下載的斑馬魚、大黃魚、金頭鯛、人類、小鼠的AKT基因家族作為參考序列，以黑鯛基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，篩選出AKT、CK基因家族序列，并對其進行基本的分析。

2.1 AKT基因家族序列的鑒定和基本信息

從黑鯛基因組中篩選出了的3個不同亞型的AKT基因，分別為akt1、akt2、akt3（表1）。其長度分別為619、481、555 bp，分子質(zhì)量分別為70.5、55.9、64.4 kDa。理論等電點為5～6，說明序列偏酸性。通過對序列的蛋白序列的保守基序進行分析（圖1），發(fā)現(xiàn)AKT基因家族序列均含有10個保守基序，數(shù)目和順序基本一致，表明AKT基因家族蛋白保守性較高。對序列的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行分析，AKT1含有STKc_PKB_alpha結(jié)構(gòu)域，AKT2、AKT3含有PKc結(jié)構(gòu)域，三者均含有PH_PKB結(jié)構(gòu)域。

圖1 黑鯛AKT基因家族成員保守基序motif和結(jié)構(gòu)域分析

表1 AKT基因家族序列基本信息

自NCBI數(shù)據(jù)庫和Ensembl數(shù)據(jù)庫下載金頭鯛、大黃魚、虹鱒、尼羅羅非魚、大西洋鮭、斑馬魚、雞、人類、小鼠、多疣壁虎的AKT序列，并與黑鯛的AKT序列構(gòu)建進化樹（圖2）。從進化樹中可以看出，魚類的AKT序列單獨聚為一支，其中AKT1、AKT3和同為鯛科的金頭鯛親緣關(guān)系最近，二者又和同為鱸形目的大黃魚聚為一支。AKT2雖然和魚類聚為一支，但是和其他魚類的親緣關(guān)系都較遠。

圖2 黑鯛和其他物種AKT基因家族進化樹

2.2 CK基因家族序列的鑒定和基本信息

CK的2個同功酶在在黑鯛基因組中均鑒定出來（表2），分別為mck和bck，序列長度均為382 bp，長度一致。mck理論等電點為6.44，bck為5.30，均偏酸性；分子質(zhì)量基本一致，為42.9 kDa。黑鯛CK基因家族成員保守基序motif和結(jié)構(gòu)域分析如圖3所示，二者的motif數(shù)目及順序均一致，具有較高的保守型，含有1個creatine kinase結(jié)構(gòu)域。

圖3 黑鯛CK基因家族成員保守基序motif和結(jié)構(gòu)域分析

表2 CK基因家族成序列基本信息

將黑鯛的2個CK序列與獲取的金頭鯛、大黃魚、虹鱒、尼羅羅非魚、大西洋鮭、青鳉、斑馬魚、人類、小鼠的CK序列進行比對，構(gòu)建基因家族進化樹（圖4）。其中哺乳動物的mck和bck均與魚類的bck親緣關(guān)系較近，但是和魚類相比，又自成一支。在mck中，黑鯛與金頭鯛具有較緊密的親緣關(guān)系，二者又與其他物種聚為一類，除了大西洋鮭和斑馬魚；而bck中，黑鯛與大黃魚親緣關(guān)系最近，相比于其他魚類又單獨聚為另一支。

圖4 黑鯛和其他物種CK基因家族進化樹

3 討論

3.1 低溫下的分子、細胞與組織受損

魚類面臨急性的低溫脅迫會出現(xiàn)分子、細胞與組織等較多水平的受損表現(xiàn)。溫度對細胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)等的組分結(jié)構(gòu)及功能狀態(tài)具有決定性的作用力。在生理溫度下，細胞能夠表達與其環(huán)境的溫度相適應(yīng)的酶與蛋白，構(gòu)成益于實現(xiàn)一系列的生物學(xué)功能的細胞內(nèi)穩(wěn)定狀態(tài)［6］。當(dāng)魚體面臨低溫脅迫情況時，細胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)等分子會錯誤折疊、組裝，降低其活性。低溫脅迫也可以誘發(fā)產(chǎn)生活性氧（ROS），引起DNA和蛋白質(zhì)的氧化受損。在細胞層面，低溫刺激能夠抑制生物膜（細胞膜與細胞器膜）的流動性，使膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，降低膜和膜結(jié)合蛋白的原有功能。在低溫下，魚類生成能量的速率受到影響，引發(fā)細胞的能量供應(yīng)短缺。低溫也會干擾微管蛋白的多聚化過程，使其穩(wěn)定性下降，使細胞骨架受損，細胞形態(tài)發(fā)生改變。而且，低溫能激發(fā)線粒體的超極化，并且提升溶酶體膜的通透性。魚類的低溫暴露還能造成脂肪的過氧化現(xiàn)象發(fā)生，使細胞衰亡通路被激發(fā)［7］。

3.2 魚類的低溫應(yīng)激和相應(yīng)的調(diào)控機制

3.2.1 感知與傳遞低溫刺激信號 魚體會對低溫刺激形成應(yīng)激反應(yīng)，逐步形成新的生理、生化與代謝穩(wěn)態(tài)來提升抗寒抗凍能力，此過程為低溫適應(yīng)。魚類的機體和細胞需要感受到水域低溫的刺激，并將此信號向細胞核傳遞，啟動低溫應(yīng)激的反應(yīng)。在魚類感知低溫信號中，真核細胞對低溫信息的傳遞主要借助鈣離子（Ca2+）信號傳遞系統(tǒng)，低溫刺激會激發(fā)細胞外Ca2+的內(nèi)流，逐漸激活有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子以及蛋白激酶。離體培養(yǎng)的昆蟲研究中，利用Ca2+信號使組織感知低溫的刺激并且激活“快速低溫強化（RCH）”機制，借助特異性抑制劑對Ca2+的內(nèi)流進行抑制，發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)蛋白的激活作用和鈣調(diào)蛋白依賴激酶Ⅱ的活性均可以去除RCH的抗寒效應(yīng)［8］。魚類的中樞神經(jīng)也在對低溫刺激信號的感知和低溫信號的傳遞過程中發(fā)揮一定作用。例如鯉，其下丘腦的視前區(qū)在接收到降溫的刺激后在半分鐘之內(nèi)就可以被激活，其鄰近的內(nèi)分泌神經(jīng)元在被激活之后能夠產(chǎn)生促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH），激發(fā)下游的生理反應(yīng)。通過遺傳研究得出線蟲類的GLR-3基因也擁有低溫感受器的作用，該基因可以對谷氨酸受體進行編碼，其在斑馬魚的同源基因gluk2中也擁有低溫信號的傳遞作用［9］。進行體外培養(yǎng)的組織與細胞也可以感知低溫的刺激以及對低溫信號進行傳遞并且啟動機體的低溫應(yīng)激，反映出不依賴神經(jīng)以及細胞的自主低溫感受器為真實存在。關(guān)于魚類的低溫感受器尚需要深入的研究和鑒定，Ca2+信號系統(tǒng)在魚類的低溫信號傳遞期間功效也需要深入的研究佐證。

3.2.2 低溫下的轉(zhuǎn)錄及有關(guān)調(diào)控機制 細胞在收到低溫的刺激信號后，借助對基因的表達而實現(xiàn)精準(zhǔn)調(diào)控，逐步建立起胞內(nèi)新穩(wěn)態(tài)，對低溫應(yīng)激下的分子受損進行修復(fù)作用，將嚴(yán)重受損的細胞清除體外，提升機體的抗寒抗凍能力。在遇到低溫刺激時，魚類的中樞神經(jīng)會接收到來自低溫的刺激，離子通道（低溫感受器）因此被激活，使Ca2+進入細胞內(nèi)部。胞內(nèi)游離狀態(tài)的Ca2+含量升高，有關(guān)的激酶也被激活，使特定的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生磷酸化與活化；活化后的轉(zhuǎn)錄因子進入到細胞核內(nèi)，并且對下游基因的轉(zhuǎn)錄實現(xiàn)激活作用，此為低溫信號的傳遞過程［10］。

近年以來，借助基因芯片、small RNA-seq等技術(shù)對較多種類的魚展開了研究，并對調(diào)控低溫的基因等進行了篩選［11］。研究的種類包括模式魚、經(jīng)濟魚、暖水性魚、冷水性魚等；低溫處理的手段有急性或者慢性暴露；刺激的處理程度包括溫和、非致死、致死的低溫暴露等；樣品的組織同樣具有豐富的來源。盡管種類的不同對低溫刺激的反應(yīng)性差異較大，然而低溫應(yīng)激反應(yīng)的相關(guān)核心基因得到了鑒定，例如RNA結(jié)合蛋白cirbp、硬脂酰輔酶A去飽和酶（scd）等，此類的基因在較多的情況下均可以被低溫刺激誘導(dǎo)而進行表達。通過富集分析低溫響應(yīng)基因（CRG）的基因本體（GO）和信號通路得出，RNA的剪接、轉(zhuǎn)錄、生物鐘的節(jié)律性、蛋白質(zhì)的分解代謝等是最具核心的受低溫調(diào)節(jié)與控制的生物學(xué)過程，F(xiàn)oxO信號通路在魚類的抗寒抗凍能力形成期間發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。不同組織細胞對低溫刺激的反應(yīng)性既有相同之處，又存在較大的特異性。某些組織的低溫應(yīng)激反應(yīng)和其功能存在緊密的關(guān)系，例如肝臟的CRG著重在能量和脂肪酸的代謝中發(fā)揮作用，肌肉的CRG關(guān)鍵在能量代謝和肌肉的萎縮中起作用，鰓的CRG主要在離子調(diào)控中起作用［12］。

3.2.3 低溫下的蛋白質(zhì)組學(xué) 低溫刺激下，細胞率先翻譯含有特定序列的mRNA，從而對細胞的蛋白質(zhì)組成展開調(diào)節(jié)；低溫還刺激蛋白質(zhì)的乙酰化、磷酸化等反應(yīng)的翻譯后修飾作用，其會出現(xiàn)化學(xué)性質(zhì)的變化，益于在低溫下進行功能發(fā)揮。立足于質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)組學(xué)顯著激發(fā)了低溫調(diào)控的蛋白質(zhì)和其翻譯后修飾的鑒定工作。在蝦虎魚的相關(guān)低溫應(yīng)激研究中，從其心臟中鑒定到37個受溫度作用的蛋白質(zhì)，此類的蛋白質(zhì)在能量的代謝、線粒體的調(diào)控等生物學(xué)的過程中起著關(guān)鍵作用；在低溫適應(yīng)之后，其心臟肌酐激酶的表達明顯提升，反映出磷酸肌酐的能量系統(tǒng)在9℃低溫應(yīng)激下對心臟的功能發(fā)揮起著較大效用［13］。一項研究在暗紋東方鲀的肝臟中鑒定出160個受低溫影響的蛋白質(zhì)，低溫激發(fā)的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、RNA結(jié)合蛋白（CIRBP）等為核心的低溫誘導(dǎo)蛋白種類；此類的蛋白質(zhì)富集的過程例如氧化應(yīng)激以及信號傳遞等；對金頭鯛的低溫應(yīng)激相關(guān)研究中，其肝臟的蛋白質(zhì)組學(xué)分析得出，低溫調(diào)控相關(guān)蛋白著重在分解代謝中發(fā)揮作用［14］。

3.2.4 低溫下的“多組學(xué)”機體與細胞的抗寒抗凍能力由類型不同的生物分子的相互作用網(wǎng)絡(luò)共同決定。所以，實施“多組學(xué)”的系統(tǒng)分析有利于相對完整獲得和抗寒有關(guān)的效應(yīng)基因，更完整地解析魚類的低溫適應(yīng)以及抗寒抗凍能力形成的細胞內(nèi)分子機制。在關(guān)于暗紋東方鲀的肝臟“多組學(xué)”（轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)與代謝）研究中，可見36個共表達的差異表達基因（DEG）-差異表達蛋白（DEP）對，19個變化方向截然相反的DEGDEP對；其中有17個DEM和共表達的14個DEG-DEP對均在脂肪酸的代謝、膜轉(zhuǎn)運等的過程中起作用［15］。

3.2.5 表觀遺傳修飾的功效 低溫可刺激組蛋白出現(xiàn)乙?；确磻?yīng)的翻譯后修飾作用，基因組DNA出現(xiàn)甲基化以及去甲基化等。諸多的研究分析魚類的“熱印記”現(xiàn)象，也即發(fā)育早期的溫度環(huán)境對魚類應(yīng)對溫度脅迫時反應(yīng)的作用力。斑馬魚的胚胎期培養(yǎng)溫度刺激會對成魚在低溫應(yīng)激下的游泳能力、類型不同的肌纖維構(gòu)成與肌肉對低溫應(yīng)激的轉(zhuǎn)錄形成影響；金頭鯛的胚胎期和仔魚期應(yīng)對的“熱印記”會對成魚在低溫脅迫的反應(yīng)形成影響；在低溫培養(yǎng)后，金頭鯛的血漿皮質(zhì)內(nèi)的鈉離子（Na+）、鉀離子（K+）和葡萄糖濃度、骨骼的代謝均會受到早期發(fā)育時培養(yǎng)溫度的明顯影響；研究還證實胚胎期的培養(yǎng)溫度會對塞內(nèi)加爾鰨和大西洋鱈的幼魚期較多組織中的miRNA表達形成影響［16］。

3.3 魚類抗寒抗凍重要基因研究

3.3.1AKT、CK基因 對AKT信號通路的關(guān)鍵基因進行基因家族的篩選，并對序列進行基本分析。研究表明，這些基因并不只在AKT信號通路發(fā)揮作用，其具有多方面的調(diào)控功能。但是在低溫脅迫下，魚類的主要致死原因是細胞在低溫下凋亡，因此本研究重點關(guān)注目的基因在細胞的增殖、生長及凋亡相關(guān)的功能。

黑鯛AKT基因共3個亞型，分別為akt1、akt2、akt3，三者均含有PH_PKB結(jié)構(gòu)域，另外AKT1含有STKc_PKB_alpha結(jié)構(gòu)域，AKT2、AKT3含有PKc結(jié)構(gòu)域。說明其激酶催化結(jié)構(gòu)域有一定不同，表明其功能上有一定的不同。已有研究表明，akt主要與斑馬魚的生長有關(guān)，其中akt1和akt2都和脂肪的代謝有關(guān)［17］。

在黑鯛中鑒定出肌型肌酸激酶和腦型肌酸激酶2種同功酶，二者長度和分子質(zhì)量基本一致，且都包含creatine kinase結(jié)構(gòu)域。在本研究中，由于魚類在低溫脅迫中，肌肉會出現(xiàn)顫抖等行為，所以主要以mck為主。

3.3.2 其他基因 應(yīng)激顆粒實為生物體內(nèi)的細胞面對外界環(huán)境的惡劣變化時產(chǎn)生的無膜包裹的一種細胞顆粒物質(zhì)，大小0.10～2.00μm，是由未經(jīng)翻譯環(huán)節(jié)的信使核苷酸蛋白復(fù)合體（mRNPs）積聚而形成，其組裝可被環(huán)境壓力進行激發(fā)，例如：氧化、高滲透壓或者病毒的感染等，此種環(huán)境壓力排除X-射線的作用。應(yīng)激顆粒對其的mRNA成分擁有選擇性，其含有一部分的編碼管家基因的轉(zhuǎn)錄本，然而需要排除壓力誘導(dǎo)下編碼的基因。在培養(yǎng)細胞和完整組織內(nèi)均可以發(fā)現(xiàn)應(yīng)激顆粒［18］。

南極海洋的大環(huán)境影響下，較多的魚種面臨巨大的生存挑戰(zhàn)，部分逐步進化出了抗寒抗凍的內(nèi)在機制。盡管北極熊棲息生存于北極的海域，以及部分的南極海域魚種，其體內(nèi)均可以合成Ⅲ型抗凍蛋白（AFPⅢ）。研究指出，AFPⅢ的抗凍活性和其分子量間有正相關(guān)關(guān)系，南極魚體內(nèi)原有的14 kD的AFPⅢ抗凍活性為7 kD蛋白的近2倍，而ld4分子源自于南極魚的多聚AFPⅢ基因中的經(jīng)過克隆所得的AFPⅢ蛋白四聚體，研究也指出，在低溫的應(yīng)激下，將ld4基因轉(zhuǎn)至煙草葉片的內(nèi)部，能強化植物的抗寒抗凍性能［19］。盡管ld4在結(jié)構(gòu)與功能上均可以實現(xiàn)限制冰晶的生長作用，然而對ld4在生物體中的信號傳導(dǎo)通路和其生物學(xué)的完整功能有關(guān)研究尚且沒有掌握。立足于生物學(xué)功能的相似性特征，將細胞應(yīng)激顆粒的自身保護力作為研究出發(fā)點，有必要深入探究ld4等特異性的功能基因、細胞的保護機制和應(yīng)激顆粒間的相互關(guān)系。

應(yīng)激顆粒作為生物體面對惡變環(huán)境時的細胞所適應(yīng)性形成的自我保護機制之一，其文獻研究主要集中于組分或抗氧化等的調(diào)控方面，而也有部分文獻總結(jié)出低溫應(yīng)激也可促進細胞生成SG物質(zhì)，然而沒有出現(xiàn)抗凍基因的功能與SG物質(zhì)對生物體在低溫環(huán)境下影響力的文獻研究。國內(nèi)研究體現(xiàn)出ld4基因的表達能明顯阻礙低溫下細胞中應(yīng)激顆粒的合成，ld4基因的導(dǎo)入處理下提升了細胞應(yīng)激顆粒的形成閾值，也即為ld4基因的導(dǎo)入下強化了生物體細胞的抗寒抗凍性能，使生物體細胞在低溫的應(yīng)激下不容易生成應(yīng)激顆粒，對于耐寒魚類的篩選育種方面具有較大的借鑒意義［20］。

低溫應(yīng)激的環(huán)境下有l(wèi)d4攜帶的斑馬魚存活率超出無ld4攜帶的斑馬魚，由此可鑒定出ld4在斑馬魚細胞中的存在可以顯著促進細胞的抗寒抗凍性能的提升［21］。對低溫處理過的細胞系以高通量測序的方式實施轉(zhuǎn)錄組的對比探究，分析ld4轉(zhuǎn)基因細胞系以及非轉(zhuǎn)化細胞在低溫刺激激發(fā)基因轉(zhuǎn)錄層面的不同之處，從而獲得ld4基因帶來的基因表達譜的變化情況，找到可能的信號傳導(dǎo)通路，并對其實施科學(xué)驗證。現(xiàn)初步排除了ld4是憑借凋亡途徑來對抗低溫應(yīng)激的可能性，日后的研究有望通過ld4抗體對低溫影響下的和非低溫影響的ld4細胞系實施免疫共沉淀，運用蛋白質(zhì)譜來測定與ld4互為作用的蛋白類型，且利用熒光共定位/酵母雙雜交等方法驗證和ld4互為作用的蛋白類型；在此前提下明確掌握限制低溫下細胞凋亡可能的信號傳導(dǎo)通路，研究其作用通路后益于運用到漁業(yè)養(yǎng)殖或其他的農(nóng)作物品種育種篩選工作中。