時昕曄

（南京師范大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，南京 210023）

在動物的進(jìn)化進(jìn)程中，相對低級的原核生物以及相對高級的動植物均逐漸進(jìn)化出較多應(yīng)對生存的適應(yīng)性機(jī)制，以益于自身在相對惡劣的生存環(huán)境中存活乃至繁衍生息。例如南極魚類可以長時期存活于零下的水域環(huán)境中，說明南極魚類進(jìn)化出了能抵御低水溫的生理策略來適應(yīng)相對嚴(yán)峻的自然環(huán)境［1］。自然界的生物體一直處于環(huán)境因素的作用下，而自然環(huán)境中的低溫因素是對其有影響力的一項(xiàng)重要因素，主要表現(xiàn)于對個體的生長、生物體的自體溫度調(diào)節(jié)、繁育后代等的一系列生命過程中。難以生長、存活與繁衍的低溫環(huán)境會干擾生物體的內(nèi)在機(jī)制，譬如會引發(fā)蛋白質(zhì)的異常折疊、抑制胞內(nèi)酶的活性表達(dá)、致使細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞膜流動性變?nèi)跻约凹?xì)胞表面冰晶的形成等。因此，探究低溫適應(yīng)性的相關(guān)機(jī)制有利于掌握生物體適應(yīng)多變環(huán)境的特性。

溫度作為重要的生態(tài)因子之一，在水產(chǎn)動物養(yǎng)殖中發(fā)揮重要的作用。已有大量水產(chǎn)物種例如南美白對蝦、雜色鮑、硬骨魚綱等水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的相關(guān)低溫馴化以及冷應(yīng)激的研究，注重分析低溫對諸如此類水產(chǎn)動物的生理和生化影響，并鑒定抗凍的有關(guān)基因等［2］。低溫會影響水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類的自然生長發(fā)育，過低的水域溫度致使養(yǎng)殖魚類大批死亡，造成水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失。低溫會致使魚類的覓食量減少、基礎(chǔ)代謝率降低、限制抗體的生成和免疫功能，降低其生長速率以及孵育率，妨礙魚類的生理、生長與繁殖等多方面的正常功能發(fā)揮［3］。基因家族是指來源于同一個祖先，由1個基因通過基因重復(fù)而產(chǎn)生2個或更多的拷貝而構(gòu)成的一組基因。它們在結(jié)構(gòu)和功能上具有明顯的相似性，編碼相似的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。同一基因家族中存在的不同亞型的功能作用及其表達(dá)的位置都會有所差異，對于基因家族的研究有助于依據(jù)其具體功能和目標(biāo)性狀縮小研究范圍。AKT/PI3K信號通路主要與細(xì)胞的增殖發(fā)育以及免疫功能有關(guān)，在低溫脅迫中對抑制細(xì)胞凋亡起關(guān)鍵作用，其中的關(guān)鍵基因AKT、PI3K、GSK3相繼在斑馬魚、黃顙魚、牙鲆中都有研究，與抗凍及AKT/PI3K信號通路相關(guān)的基因CK在鯉魚和斑馬魚中都有較全面的研究［4，5］。

本研究為黑鯛抗凍關(guān)鍵基因家族鑒定，基于已有的基因家族成員，從黑鯛的基因組中篩選了AKT、CK的基因家族成員，對其分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、motif結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域等基本信息進(jìn)行分析，與近緣物種構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，有助于進(jìn)一步了解魚類相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)及功能，為后續(xù)研究PI3K/AKT信號通路及其中的關(guān)鍵基因奠定基礎(chǔ)。

1 研究方法

1.1 研究樣本的選擇

從已有的黑鯛基因組及注釋（https：//ftp.cngb.org/pub/gigadb/pub/10.5524/100001_1）數(shù)據(jù)中比對篩選獲得目的基因的基因家族氨基酸序列。選取黑鯛的近緣物種金頭鯛、大黃魚的目的基因序列，以常見的模式生物斑馬魚、人類、小鼠的目的基因序列作參考。相關(guān)的氨基酸序列來源于Ensembl數(shù)據(jù)庫（http：//www.ensembl.org）和NCBI數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。

1.2 基因家族序列的獲得

使用TBtools軟件從黑鯛基因組數(shù)據(jù)中篩選出目的基因序列，并基于其保守結(jié)構(gòu)域和親緣關(guān)系對篩選的基因進(jìn)行分類和命名。分析步驟如下。

1）黑鯛基因組數(shù)據(jù)中心的蛋白質(zhì)序列的提?。夯诨蚪M數(shù)據(jù)的注釋信息，使用TBtools軟件提取CDS序列，將其翻譯為氨基酸序列，并簡化其序列ID。

2）雙向比對獲取備選的序列：使用Blast Wrapper功能，以已經(jīng)獲取的序列作為查詢序列，比對獲得黑鯛中可能的序列，作為備選。上傳至NCBI使用Swissprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，下載獲取的備選序列信息，查看其基本特征，進(jìn)行初步篩選。

3）基于保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行進(jìn)一步篩選：將備選基因的氨基酸序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫的在線結(jié)構(gòu)域分 析 網(wǎng) 頁（http：//www.ncbi.nlm.nih.gw/structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi），下載得到備選序列的保守結(jié)構(gòu)域，并基于保守結(jié)構(gòu)域?qū)溥x序列進(jìn)行2次篩選，確認(rèn)基因家族的成員。

4）根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域的類型、系統(tǒng)進(jìn)化樹的聚類情況，對相應(yīng)的序列進(jìn)行分類和命名，含有多個直系同源基因的基因，在后面加數(shù)字以區(qū)分基因的不同拷貝。

1.3 氨基酸序列基本信息分析

借助網(wǎng)絡(luò)在線工具，分析獲取的目的基因序列的理化性質(zhì)及保守結(jié)構(gòu)域等基本信息。

1）使用Compute pI/Mw工具（http：//web.expasy.org/compute_pi/）計(jì)算氨基酸序列的等電點(diǎn)（PI）和分子質(zhì)量（MW）。

2）使 用MEME 4.12.0（http：//meme-suite.org/tools/meme）在線程序，對所鑒定的序列中Motifs的保守性進(jìn)行預(yù)測分析。

3）使用NCBI保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）分析預(yù)測AKT基因的domain結(jié)構(gòu)域的保守性。

4）借助TBtools本地軟件對分析結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.4 基因家族成員的進(jìn)化分析

利用ClustalX對鑒定的基因家族成員序列和其他選定物種的序列進(jìn)行比對，獲取的結(jié)果使用MEGA 7軟件應(yīng)用最大似然法（ML）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。借助MEGA 7軟件分析最合適的進(jìn)化模型，自展值設(shè)為1 000。

2 結(jié)果與分析

將從Ensembl數(shù)據(jù)庫下載的斑馬魚、大黃魚、金頭鯛、人類、小鼠的AKT基因家族作為參考序列，以黑鯛基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，篩選出AKT、CK基因家族序列，并對其進(jìn)行基本的分析。

2.1 AKT基因家族序列的鑒定和基本信息

從黑鯛基因組中篩選出了的3個不同亞型的AKT基因，分別為akt1、akt2、akt3（表1）。其長度分別為619、481、555 bp，分子質(zhì)量分別為70.5、55.9、64.4 kDa。理論等電點(diǎn)為5～6，說明序列偏酸性。通過對序列的蛋白序列的保守基序進(jìn)行分析（圖1），發(fā)現(xiàn)AKT基因家族序列均含有10個保守基序，數(shù)目和順序基本一致，表明AKT基因家族蛋白保守性較高。對序列的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，AKT1含有STKc_PKB_alpha結(jié)構(gòu)域，AKT2、AKT3含有PKc結(jié)構(gòu)域，三者均含有PH_PKB結(jié)構(gòu)域。

圖1 黑鯛AKT基因家族成員保守基序motif和結(jié)構(gòu)域分析

表1 AKT基因家族序列基本信息

自NCBI數(shù)據(jù)庫和Ensembl數(shù)據(jù)庫下載金頭鯛、大黃魚、虹鱒、尼羅羅非魚、大西洋鮭、斑馬魚、雞、人類、小鼠、多疣壁虎的AKT序列，并與黑鯛的AKT序列構(gòu)建進(jìn)化樹（圖2）。從進(jìn)化樹中可以看出，魚類的AKT序列單獨(dú)聚為一支，其中AKT1、AKT3和同為鯛科的金頭鯛親緣關(guān)系最近，二者又和同為鱸形目的大黃魚聚為一支。AKT2雖然和魚類聚為一支，但是和其他魚類的親緣關(guān)系都較遠(yuǎn)。

圖2 黑鯛和其他物種AKT基因家族進(jìn)化樹

2.2 CK基因家族序列的鑒定和基本信息

CK的2個同功酶在在黑鯛基因組中均鑒定出來（表2），分別為mck和bck，序列長度均為382 bp，長度一致。mck理論等電點(diǎn)為6.44，bck為5.30，均偏酸性；分子質(zhì)量基本一致，為42.9 kDa。黑鯛CK基因家族成員保守基序motif和結(jié)構(gòu)域分析如圖3所示，二者的motif數(shù)目及順序均一致，具有較高的保守型，含有1個creatine kinase結(jié)構(gòu)域。

圖3 黑鯛CK基因家族成員保守基序motif和結(jié)構(gòu)域分析

表2 CK基因家族成序列基本信息

將黑鯛的2個CK序列與獲取的金頭鯛、大黃魚、虹鱒、尼羅羅非魚、大西洋鮭、青鳉、斑馬魚、人類、小鼠的CK序列進(jìn)行比對，構(gòu)建基因家族進(jìn)化樹（圖4）。其中哺乳動物的mck和bck均與魚類的bck親緣關(guān)系較近，但是和魚類相比，又自成一支。在mck中，黑鯛與金頭鯛具有較緊密的親緣關(guān)系，二者又與其他物種聚為一類，除了大西洋鮭和斑馬魚；而bck中，黑鯛與大黃魚親緣關(guān)系最近，相比于其他魚類又單獨(dú)聚為另一支。

圖4 黑鯛和其他物種CK基因家族進(jìn)化樹

3 討論

3.1 低溫下的分子、細(xì)胞與組織受損

魚類面臨急性的低溫脅迫會出現(xiàn)分子、細(xì)胞與組織等較多水平的受損表現(xiàn)。溫度對細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)等的組分結(jié)構(gòu)及功能狀態(tài)具有決定性的作用力。在生理溫度下，細(xì)胞能夠表達(dá)與其環(huán)境的溫度相適應(yīng)的酶與蛋白，構(gòu)成益于實(shí)現(xiàn)一系列的生物學(xué)功能的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定狀態(tài)［6］。當(dāng)魚體面臨低溫脅迫情況時，細(xì)胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)等分子會錯誤折疊、組裝，降低其活性。低溫脅迫也可以誘發(fā)產(chǎn)生活性氧（ROS），引起DNA和蛋白質(zhì)的氧化受損。在細(xì)胞層面，低溫刺激能夠抑制生物膜（細(xì)胞膜與細(xì)胞器膜）的流動性，使膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，降低膜和膜結(jié)合蛋白的原有功能。在低溫下，魚類生成能量的速率受到影響，引發(fā)細(xì)胞的能量供應(yīng)短缺。低溫也會干擾微管蛋白的多聚化過程，使其穩(wěn)定性下降，使細(xì)胞骨架受損，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。而且，低溫能激發(fā)線粒體的超極化，并且提升溶酶體膜的通透性。魚類的低溫暴露還能造成脂肪的過氧化現(xiàn)象發(fā)生，使細(xì)胞衰亡通路被激發(fā)［7］。

3.2 魚類的低溫應(yīng)激和相應(yīng)的調(diào)控機(jī)制

3.2.1 感知與傳遞低溫刺激信號 魚體會對低溫刺激形成應(yīng)激反應(yīng)，逐步形成新的生理、生化與代謝穩(wěn)態(tài)來提升抗寒抗凍能力，此過程為低溫適應(yīng)。魚類的機(jī)體和細(xì)胞需要感受到水域低溫的刺激，并將此信號向細(xì)胞核傳遞，啟動低溫應(yīng)激的反應(yīng)。在魚類感知低溫信號中，真核細(xì)胞對低溫信息的傳遞主要借助鈣離子（Ca2+）信號傳遞系統(tǒng)，低溫刺激會激發(fā)細(xì)胞外Ca2+的內(nèi)流，逐漸激活有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子以及蛋白激酶。離體培養(yǎng)的昆蟲研究中，利用Ca2+信號使組織感知低溫的刺激并且激活“快速低溫強(qiáng)化（RCH）”機(jī)制，借助特異性抑制劑對Ca2+的內(nèi)流進(jìn)行抑制，發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)蛋白的激活作用和鈣調(diào)蛋白依賴激酶Ⅱ的活性均可以去除RCH的抗寒效應(yīng)［8］。魚類的中樞神經(jīng)也在對低溫刺激信號的感知和低溫信號的傳遞過程中發(fā)揮一定作用。例如鯉，其下丘腦的視前區(qū)在接收到降溫的刺激后在半分鐘之內(nèi)就可以被激活，其鄰近的內(nèi)分泌神經(jīng)元在被激活之后能夠產(chǎn)生促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH），激發(fā)下游的生理反應(yīng)。通過遺傳研究得出線蟲類的GLR-3基因也擁有低溫感受器的作用，該基因可以對谷氨酸受體進(jìn)行編碼，其在斑馬魚的同源基因gluk2中也擁有低溫信號的傳遞作用［9］。進(jìn)行體外培養(yǎng)的組織與細(xì)胞也可以感知低溫的刺激以及對低溫信號進(jìn)行傳遞并且啟動機(jī)體的低溫應(yīng)激，反映出不依賴神經(jīng)以及細(xì)胞的自主低溫感受器為真實(shí)存在。關(guān)于魚類的低溫感受器尚需要深入的研究和鑒定，Ca2+信號系統(tǒng)在魚類的低溫信號傳遞期間功效也需要深入的研究佐證。

3.2.2 低溫下的轉(zhuǎn)錄及有關(guān)調(diào)控機(jī)制 細(xì)胞在收到低溫的刺激信號后，借助對基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)調(diào)控，逐步建立起胞內(nèi)新穩(wěn)態(tài)，對低溫應(yīng)激下的分子受損進(jìn)行修復(fù)作用，將嚴(yán)重受損的細(xì)胞清除體外，提升機(jī)體的抗寒抗凍能力。在遇到低溫刺激時，魚類的中樞神經(jīng)會接收到來自低溫的刺激，離子通道（低溫感受器）因此被激活，使Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。胞內(nèi)游離狀態(tài)的Ca2+含量升高，有關(guān)的激酶也被激活，使特定的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生磷酸化與活化；活化后的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，并且對下游基因的轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)激活作用，此為低溫信號的傳遞過程［10］。

近年以來，借助基因芯片、small RNA-seq等技術(shù)對較多種類的魚展開了研究，并對調(diào)控低溫的基因等進(jìn)行了篩選［11］。研究的種類包括模式魚、經(jīng)濟(jì)魚、暖水性魚、冷水性魚等；低溫處理的手段有急性或者慢性暴露；刺激的處理程度包括溫和、非致死、致死的低溫暴露等；樣品的組織同樣具有豐富的來源。盡管種類的不同對低溫刺激的反應(yīng)性差異較大，然而低溫應(yīng)激反應(yīng)的相關(guān)核心基因得到了鑒定，例如RNA結(jié)合蛋白cirbp、硬脂酰輔酶A去飽和酶（scd）等，此類的基因在較多的情況下均可以被低溫刺激誘導(dǎo)而進(jìn)行表達(dá)。通過富集分析低溫響應(yīng)基因（CRG）的基因本體（GO）和信號通路得出，RNA的剪接、轉(zhuǎn)錄、生物鐘的節(jié)律性、蛋白質(zhì)的分解代謝等是最具核心的受低溫調(diào)節(jié)與控制的生物學(xué)過程，F(xiàn)oxO信號通路在魚類的抗寒抗凍能力形成期間發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。不同組織細(xì)胞對低溫刺激的反應(yīng)性既有相同之處，又存在較大的特異性。某些組織的低溫應(yīng)激反應(yīng)和其功能存在緊密的關(guān)系，例如肝臟的CRG著重在能量和脂肪酸的代謝中發(fā)揮作用，肌肉的CRG關(guān)鍵在能量代謝和肌肉的萎縮中起作用，鰓的CRG主要在離子調(diào)控中起作用［12］。

3.2.3 低溫下的蛋白質(zhì)組學(xué) 低溫刺激下，細(xì)胞率先翻譯含有特定序列的mRNA，從而對細(xì)胞的蛋白質(zhì)組成展開調(diào)節(jié)；低溫還刺激蛋白質(zhì)的乙酰化、磷酸化等反應(yīng)的翻譯后修飾作用，其會出現(xiàn)化學(xué)性質(zhì)的變化，益于在低溫下進(jìn)行功能發(fā)揮。立足于質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)組學(xué)顯著激發(fā)了低溫調(diào)控的蛋白質(zhì)和其翻譯后修飾的鑒定工作。在蝦虎魚的相關(guān)低溫應(yīng)激研究中，從其心臟中鑒定到37個受溫度作用的蛋白質(zhì)，此類的蛋白質(zhì)在能量的代謝、線粒體的調(diào)控等生物學(xué)的過程中起著關(guān)鍵作用；在低溫適應(yīng)之后，其心臟肌酐激酶的表達(dá)明顯提升，反映出磷酸肌酐的能量系統(tǒng)在9℃低溫應(yīng)激下對心臟的功能發(fā)揮起著較大效用［13］。一項(xiàng)研究在暗紋東方鲀的肝臟中鑒定出160個受低溫影響的蛋白質(zhì)，低溫激發(fā)的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、RNA結(jié)合蛋白（CIRBP）等為核心的低溫誘導(dǎo)蛋白種類；此類的蛋白質(zhì)富集的過程例如氧化應(yīng)激以及信號傳遞等；對金頭鯛的低溫應(yīng)激相關(guān)研究中，其肝臟的蛋白質(zhì)組學(xué)分析得出，低溫調(diào)控相關(guān)蛋白著重在分解代謝中發(fā)揮作用［14］。

3.2.4 低溫下的“多組學(xué)”機(jī)體與細(xì)胞的抗寒抗凍能力由類型不同的生物分子的相互作用網(wǎng)絡(luò)共同決定。所以，實(shí)施“多組學(xué)”的系統(tǒng)分析有利于相對完整獲得和抗寒有關(guān)的效應(yīng)基因，更完整地解析魚類的低溫適應(yīng)以及抗寒抗凍能力形成的細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制。在關(guān)于暗紋東方鲀的肝臟“多組學(xué)”（轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)與代謝）研究中，可見36個共表達(dá)的差異表達(dá)基因（DEG）-差異表達(dá)蛋白（DEP）對，19個變化方向截然相反的DEGDEP對；其中有17個DEM和共表達(dá)的14個DEG-DEP對均在脂肪酸的代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)等的過程中起作用［15］。

3.2.5 表觀遺傳修飾的功效 低溫可刺激組蛋白出現(xiàn)乙酰化等反應(yīng)的翻譯后修飾作用，基因組DNA出現(xiàn)甲基化以及去甲基化等。諸多的研究分析魚類的“熱印記”現(xiàn)象，也即發(fā)育早期的溫度環(huán)境對魚類應(yīng)對溫度脅迫時反應(yīng)的作用力。斑馬魚的胚胎期培養(yǎng)溫度刺激會對成魚在低溫應(yīng)激下的游泳能力、類型不同的肌纖維構(gòu)成與肌肉對低溫應(yīng)激的轉(zhuǎn)錄形成影響；金頭鯛的胚胎期和仔魚期應(yīng)對的“熱印記”會對成魚在低溫脅迫的反應(yīng)形成影響；在低溫培養(yǎng)后，金頭鯛的血漿皮質(zhì)內(nèi)的鈉離子（Na+）、鉀離子（K+）和葡萄糖濃度、骨骼的代謝均會受到早期發(fā)育時培養(yǎng)溫度的明顯影響；研究還證實(shí)胚胎期的培養(yǎng)溫度會對塞內(nèi)加爾鰨和大西洋鱈的幼魚期較多組織中的miRNA表達(dá)形成影響［16］。

3.3 魚類抗寒抗凍重要基因研究

3.3.1AKT、CK基因 對AKT信號通路的關(guān)鍵基因進(jìn)行基因家族的篩選，并對序列進(jìn)行基本分析。研究表明，這些基因并不只在AKT信號通路發(fā)揮作用，其具有多方面的調(diào)控功能。但是在低溫脅迫下，魚類的主要致死原因是細(xì)胞在低溫下凋亡，因此本研究重點(diǎn)關(guān)注目的基因在細(xì)胞的增殖、生長及凋亡相關(guān)的功能。

黑鯛AKT基因共3個亞型，分別為akt1、akt2、akt3，三者均含有PH_PKB結(jié)構(gòu)域，另外AKT1含有STKc_PKB_alpha結(jié)構(gòu)域，AKT2、AKT3含有PKc結(jié)構(gòu)域。說明其激酶催化結(jié)構(gòu)域有一定不同，表明其功能上有一定的不同。已有研究表明，akt主要與斑馬魚的生長有關(guān)，其中akt1和akt2都和脂肪的代謝有關(guān)［17］。

在黑鯛中鑒定出肌型肌酸激酶和腦型肌酸激酶2種同功酶，二者長度和分子質(zhì)量基本一致，且都包含creatine kinase結(jié)構(gòu)域。在本研究中，由于魚類在低溫脅迫中，肌肉會出現(xiàn)顫抖等行為，所以主要以mck為主。

3.3.2 其他基因 應(yīng)激顆粒實(shí)為生物體內(nèi)的細(xì)胞面對外界環(huán)境的惡劣變化時產(chǎn)生的無膜包裹的一種細(xì)胞顆粒物質(zhì)，大小0.10～2.00μm，是由未經(jīng)翻譯環(huán)節(jié)的信使核苷酸蛋白復(fù)合體（mRNPs）積聚而形成，其組裝可被環(huán)境壓力進(jìn)行激發(fā)，例如：氧化、高滲透壓或者病毒的感染等，此種環(huán)境壓力排除X-射線的作用。應(yīng)激顆粒對其的mRNA成分擁有選擇性，其含有一部分的編碼管家基因的轉(zhuǎn)錄本，然而需要排除壓力誘導(dǎo)下編碼的基因。在培養(yǎng)細(xì)胞和完整組織內(nèi)均可以發(fā)現(xiàn)應(yīng)激顆粒［18］。

南極海洋的大環(huán)境影響下，較多的魚種面臨巨大的生存挑戰(zhàn)，部分逐步進(jìn)化出了抗寒抗凍的內(nèi)在機(jī)制。盡管北極熊棲息生存于北極的海域，以及部分的南極海域魚種，其體內(nèi)均可以合成Ⅲ型抗凍蛋白（AFPⅢ）。研究指出，AFPⅢ的抗凍活性和其分子量間有正相關(guān)關(guān)系，南極魚體內(nèi)原有的14 kD的AFPⅢ抗凍活性為7 kD蛋白的近2倍，而ld4分子源自于南極魚的多聚AFPⅢ基因中的經(jīng)過克隆所得的AFPⅢ蛋白四聚體，研究也指出，在低溫的應(yīng)激下，將ld4基因轉(zhuǎn)至煙草葉片的內(nèi)部，能強(qiáng)化植物的抗寒抗凍性能［19］。盡管ld4在結(jié)構(gòu)與功能上均可以實(shí)現(xiàn)限制冰晶的生長作用，然而對ld4在生物體中的信號傳導(dǎo)通路和其生物學(xué)的完整功能有關(guān)研究尚且沒有掌握。立足于生物學(xué)功能的相似性特征，將細(xì)胞應(yīng)激顆粒的自身保護(hù)力作為研究出發(fā)點(diǎn)，有必要深入探究ld4等特異性的功能基因、細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制和應(yīng)激顆粒間的相互關(guān)系。

應(yīng)激顆粒作為生物體面對惡變環(huán)境時的細(xì)胞所適應(yīng)性形成的自我保護(hù)機(jī)制之一，其文獻(xiàn)研究主要集中于組分或抗氧化等的調(diào)控方面，而也有部分文獻(xiàn)總結(jié)出低溫應(yīng)激也可促進(jìn)細(xì)胞生成SG物質(zhì)，然而沒有出現(xiàn)抗凍基因的功能與SG物質(zhì)對生物體在低溫環(huán)境下影響力的文獻(xiàn)研究。國內(nèi)研究體現(xiàn)出ld4基因的表達(dá)能明顯阻礙低溫下細(xì)胞中應(yīng)激顆粒的合成，ld4基因的導(dǎo)入處理下提升了細(xì)胞應(yīng)激顆粒的形成閾值，也即為ld4基因的導(dǎo)入下強(qiáng)化了生物體細(xì)胞的抗寒抗凍性能，使生物體細(xì)胞在低溫的應(yīng)激下不容易生成應(yīng)激顆粒，對于耐寒魚類的篩選育種方面具有較大的借鑒意義［20］。

低溫應(yīng)激的環(huán)境下有l(wèi)d4攜帶的斑馬魚存活率超出無ld4攜帶的斑馬魚，由此可鑒定出ld4在斑馬魚細(xì)胞中的存在可以顯著促進(jìn)細(xì)胞的抗寒抗凍性能的提升［21］。對低溫處理過的細(xì)胞系以高通量測序的方式實(shí)施轉(zhuǎn)錄組的對比探究，分析ld4轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系以及非轉(zhuǎn)化細(xì)胞在低溫刺激激發(fā)基因轉(zhuǎn)錄層面的不同之處，從而獲得ld4基因帶來的基因表達(dá)譜的變化情況，找到可能的信號傳導(dǎo)通路，并對其實(shí)施科學(xué)驗(yàn)證?，F(xiàn)初步排除了ld4是憑借凋亡途徑來對抗低溫應(yīng)激的可能性，日后的研究有望通過ld4抗體對低溫影響下的和非低溫影響的ld4細(xì)胞系實(shí)施免疫共沉淀，運(yùn)用蛋白質(zhì)譜來測定與ld4互為作用的蛋白類型，且利用熒光共定位/酵母雙雜交等方法驗(yàn)證和ld4互為作用的蛋白類型；在此前提下明確掌握限制低溫下細(xì)胞凋亡可能的信號傳導(dǎo)通路，研究其作用通路后益于運(yùn)用到漁業(yè)養(yǎng)殖或其他的農(nóng)作物品種育種篩選工作中。