邱錦鳴，吳佳佳，劉 哲，薛陳杰，劉雪梅

（淮陰工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003）

貧營養(yǎng)微生物又稱寡營養(yǎng)微生物，大部分生長在有機(jī)質(zhì)匱乏的環(huán)境中，如土壤、湖泊河水、地下水、沙表土等地。將貧營養(yǎng)微生物從環(huán)境中分離提取出來，用于自來水工藝中低濃度溶解性污染物的去除，這是近年來在給水處理領(lǐng)域形成的一個(gè)新思路。目前，在貧營養(yǎng)凈水微生物篩選方面已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展。從不同介質(zhì)中篩選的高效貧營養(yǎng)細(xì)菌在碳、氮營養(yǎng)元素去除方面均展現(xiàn)了良好的性能［1-3］。由于貧營養(yǎng)細(xì)菌增殖速度較慢，擴(kuò)大化培養(yǎng)成為貧營養(yǎng)微生物凈水技術(shù)應(yīng)用的重要制約因素。部分國內(nèi)外學(xué)者開展了貧營養(yǎng)微生物富集培養(yǎng)方法的相關(guān)研究，已見報(bào)道的技術(shù)方法包括滅絕稀釋培養(yǎng)法、擴(kuò)散箱培養(yǎng)法以及各種不可培養(yǎng)細(xì)菌的富集方法［4-6］。然而，現(xiàn)有成果大多局限于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，距離規(guī)?；a(chǎn)、使用還有一定差距。

兼性營養(yǎng)細(xì)菌既能在貧營養(yǎng)基上培養(yǎng)，也能在富營養(yǎng)環(huán)境下生長，易于擴(kuò)大化培養(yǎng)。本研究采用梯度營養(yǎng)稀釋法進(jìn)行貧營養(yǎng)微生物的篩選，從而獲得兼性貧營養(yǎng)凈水菌株，有效克服貧營養(yǎng)凈水微生物難以富集培養(yǎng)的難題。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集淮安市二河水源地水樣和表層底泥。水樣用脫脂棉過濾，除去水中的懸浮物，得到有機(jī)質(zhì)均一的水作為試驗(yàn)用水；底泥溶于滅菌蒸餾水，搖勻后靜置，取上層清液，同樣經(jīng)脫脂棉過濾后得到試驗(yàn)用水。

1.2 培養(yǎng)基的制備

牛肉膏0.5 g、蛋白胨1 g和氯化鈉0.5 g溶解于100 mL無菌水中，得到富營養(yǎng)培養(yǎng)基，依次稀釋10倍、100倍、1 000倍和10 000倍，得到不同濃度水平的貧營養(yǎng)液態(tài)培養(yǎng)基。將瓊脂按1∶50加入液態(tài)培養(yǎng)基，制備固體培養(yǎng)基。

1.3 菌株的分離

利用平板劃線法在富營養(yǎng)培養(yǎng)基上劃線分離菌株，28℃培養(yǎng)。待長出群落后，不同形態(tài)菌落劃線分離，直到純化至單菌落為止。將純化后的菌株依次接種于10倍、100倍、1 000倍和10 000倍稀釋培養(yǎng)基中培養(yǎng)，留取在1 000倍和10 000倍的培養(yǎng)基中能夠生長的菌落，轉(zhuǎn)入斜面保存。

1.4 高效凈水兼性貧營養(yǎng)細(xì)菌的篩選

將經(jīng)分離純化的兼性貧營養(yǎng)菌株接種到液態(tài)富營養(yǎng)培養(yǎng)基中，28℃200 r/min過夜培養(yǎng)，獲得含大量菌體的菌液。將菌液在5 000 r/min離心2 min，用滅菌蒸餾水洗滌3次，得到只含有菌體而無培養(yǎng)基的菌液。將富集培養(yǎng)的純化菌液接種到微污染水體以及無菌水中，投菌量保持在105～106cfu/mL，在28℃下靜置培養(yǎng)7 d。通過投菌前后總有機(jī)碳（TOC）的變化篩選高效凈水菌株。其中TOC采用紅外吸收法測(cè)定。

1.5 菌株鑒定

采用革蘭氏染色進(jìn)行菌株形態(tài)和類別的識(shí)別。采用16SrDNA基因法對(duì)菌株進(jìn)行分子鑒定。按照細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒說明書提取分離菌的DNA作為PCR模板。PCR體系為上、下游引物和模板各1μL，ddH2O 22μL，2×Taq MasterMix 25μL，總體積為50μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃修復(fù)延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳純化擴(kuò)增，送上海生工生物工程公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI的BLAST分區(qū)檢索并比對(duì)分析，鑒定菌株類別。

1.6 菌株生長曲線的測(cè)定

采用光密度法測(cè)定菌株的生長曲線。將篩選出的高效貧營養(yǎng)細(xì)菌分別接種在富營養(yǎng)以及稀釋1 000倍和10 000倍的液態(tài)培養(yǎng)基中，28℃200 r/min搖床培養(yǎng)，測(cè)量不同時(shí)間菌液的光密度（OD），繪出各菌株在不同營養(yǎng)條件下的生長曲線。

1.7 菌株理化特性分析

對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行碳、氮營養(yǎng)元素利用特性、耐鹽性分析以及雙氧水和乙醇的抗性分析。碳源4 g、氮源1.2 g、磷源0.24 g以及200 mL無菌水配置液態(tài)培養(yǎng)基，按照“1.5”方法進(jìn)行菌株接種，初始濃度保持106cfu/mL左右。調(diào)整碳源及氮源類別，比較培養(yǎng)基的渾濁程度來觀察菌體的生長情況。在液態(tài)培養(yǎng)基中添加不同濃度的氯化鈉、雙氧水以及乙醇，根據(jù)培養(yǎng)基的渾濁程度判斷菌株的耐鹽性、雙氧水抗性及乙醇抗性。

2 結(jié)果與分析

2.1 兼性凈水貧營養(yǎng)微生物的分離和篩選

2.1.1 兼性貧營養(yǎng)細(xì)菌的分離 本研究共分離出36種細(xì)菌，其中從水樣中分離出15種細(xì)菌，編號(hào)分別為A1～A15，從底泥中分離出21種細(xì)菌，編號(hào)分別為B1～B21。將分離出的菌株依次接種到貧營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到8株兼性貧營養(yǎng)細(xì)菌，分別為A3、A5、A6、A9、A10、B2、B4、B6。

2.1.2 高效貧營養(yǎng)細(xì)菌的篩選 選取水源地微污染水體，初始TOC濃度為25.06 mg/L。分別向水體中投放8種兼性貧營養(yǎng)細(xì)菌，同時(shí)設(shè)置2份未投加菌株的水樣作為空白對(duì)照。每日測(cè)定TOC濃度。TOC濃度變化曲線和7日降解率分別見圖1和圖2。

圖1 投放凈水菌株后微污染水體TOC濃度變化曲線

由圖1、圖2可知，菌株投加后，均可不同程度地降低水體中TOC的濃度，且濃度下降趨勢(shì)逐步趨緩。未加入菌株的空白對(duì)照組TOC也有一定程度的下降，分別為19.52%、25.81%，推測(cè)是水體本身含有的微生物發(fā)揮的凈水效應(yīng)。在8組菌株投加的水樣中，除B2組，其他7個(gè)組別第7日TOC濃度均低于空白組。處理效果相對(duì)較好的是A6和A9，降解率分別達(dá)71.52%和63.80%。該降解率與顧祖宜［7］及田興華［8］篩選的高效營養(yǎng)凈水微生物對(duì)有機(jī)碳的降解率大體相當(dāng)。

圖2 不同菌株所在微污染水體中TOC的7日降解率

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)特征 菌株經(jīng)革蘭氏染色后，在油鏡下觀測(cè)各菌株形態(tài)如圖3所示。從圖3可以看出，A6和A9均為革蘭氏陽性菌。就外觀形態(tài)而言，A6近似球狀，A9為桿狀。

圖3 高效兼性凈水貧營養(yǎng)細(xì)菌的油鏡觀測(cè)

2.2.2 菌株分子鑒定 用16SrDNA基因法對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定。本試驗(yàn)提取了A6和A9的基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增后DNA的1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)如圖4所示，2個(gè)菌株的DNA抽提效果較好，條帶單一，清晰明亮，A6大小位于Marker 1 kb和3 kb條帶之間，A9位于Marker 0.5 kb和1 kb條帶之間。

圖4 菌株DNA凝膠電泳

篩選出的高效凈水細(xì)菌分別為短小芽孢桿菌（Bacilluspumlus）和蠟狀芽孢桿菌（Bacilluscereus）。由于芽孢桿菌具有極強(qiáng)的生命力，能在惡劣的環(huán)境中利用有機(jī)質(zhì)，其作為微生物凈水劑已經(jīng)在污染處理、養(yǎng)殖水體凈化中得到應(yīng)用［9，10］。本研究凈水試驗(yàn)表明，短小芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌TOC的降解率也高于其他菌株。

2.3 菌株生長特性曲線

由生長曲線（圖5）可以看出，無論是短小芽孢桿菌還是蠟狀芽孢桿菌，其對(duì)數(shù)期啟動(dòng)均隨著培養(yǎng)基濃度的降低而呈滯后趨勢(shì)，光密度最大值隨著培養(yǎng)基濃度的降低而依次減小。其中，短小芽孢桿菌在富營養(yǎng)、稀釋1 000倍和稀釋10 000倍培養(yǎng)基中光密度最大值分別為4.51、2.71和1.39；而蠟狀芽孢桿菌在富營養(yǎng)、稀釋1 000倍和稀釋10 000倍培養(yǎng)基中的光密度最大值分別為3.86、1.45和1.11。由此可見，通過提高培養(yǎng)基的濃度水平，可以顯著提高兼性貧營養(yǎng)凈水微生物的富集效率。

圖5 短小芽孢桿菌（A）和蠟狀芽孢桿菌（B）在不同濃度培養(yǎng)基下的生長曲線

2.4 菌株理化特性分析

2.4.1 碳源利用特性分析 不同種類的微生物利用碳源的能力存在差別，微生物利用的碳源物質(zhì)主要有糖類、有機(jī)酸、醇、脂類、烴及碳酸鹽等。選用凈水能力較好的A6和A9菌株進(jìn)行多種碳源利用能力試驗(yàn)，空白組中無碳源添加。恒溫?fù)u床上過夜培養(yǎng)后出現(xiàn)渾濁，說明菌株有生長，能對(duì)相應(yīng)碳源物質(zhì)加以利用，未出現(xiàn)渾濁的，說明菌株無生長。從表1可以看出，A6和A9菌株無法在無碳源和碳酸鈉作為碳源的情況下生存，可在葡萄糖和乙醇的環(huán)境下生存。A9無法利用甲醇作為碳源生長，而A6則可以利用甲醇生長。

表1 菌株對(duì)碳源物質(zhì)的利用

2.4.2 氮源利用特性分析 試驗(yàn)選取作為氮源的物質(zhì)有NH4Cl、（NH4）2SO4、KNO3和肌苷。從表2可以看出，A6和A9株菌無法在無氮源的情況下生存，可在NH4Cl、（NH4）2SO4、KNO3等作為氮源的培養(yǎng)基中生長，說明2種菌株都可以利用自然界中的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮等無機(jī)氮。此外，A6也可以利用肌苷作為氮源，而A9則不能利用肌苷作為氮源。

表2 菌株對(duì)氮源物質(zhì)的利用

2.4.3 菌株耐鹽性試驗(yàn) 對(duì)營養(yǎng)液中無機(jī)鹽的有無進(jìn)行生長分析。從表3可以看出，當(dāng)NaCl的濃度為0.5%時(shí)，2個(gè)菌株均生長良好。隨著NaCl濃度的升高，菌株生長狀況逐漸變差。當(dāng)NaCl的濃度達(dá)3%時(shí)，A9菌株停止生長；當(dāng)NaCl的濃度達(dá)5%時(shí)，A6菌株培養(yǎng)72 h仍未見生長。

表3 菌株對(duì)無機(jī)鹽的利用

2.4.4 菌株對(duì)雙氧水的抗性試驗(yàn) H2O2作為強(qiáng)氧化劑，可以產(chǎn)生能破壞細(xì)胞核酸、蛋白和磷脂的羥基自由基，從而達(dá)到殺菌的目的。用雙氧水對(duì)A6和A9菌株進(jìn)行抗性試驗(yàn)（表4），當(dāng)雙氧水濃度為0.03%和0.3%時(shí)，A6和A9菌株均可以生長，當(dāng)雙氧水濃度達(dá)3%時(shí)，2種菌株均難以生長。由此可見，濃度為3%的雙氧水可以破壞上述細(xì)菌的細(xì)胞核酸、蛋白質(zhì)和磷脂等，從而達(dá)到殺菌的目的。

表4 H 2O2濃度對(duì)菌株生長情況的影響

2.4.5 菌株對(duì)乙醇的抗性試驗(yàn) 75%乙醇是常用的皮膚消毒劑，它能溶解細(xì)胞脂類物質(zhì)，同時(shí)也可以使蛋白質(zhì)變性。本試驗(yàn)采用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)菌株進(jìn)行抗性試驗(yàn)。從表5可知，較低體積分?jǐn)?shù)的乙醇可以成為菌株的碳源。但是當(dāng)體積分?jǐn)?shù)達(dá)10%時(shí)，乙醇就會(huì)對(duì)菌株產(chǎn)生毒害作用，這可能與乙醇達(dá)到一定的體積分?jǐn)?shù)會(huì)破壞細(xì)菌的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)，導(dǎo)致菌株難以生長，從而起到殺菌的目的。

表5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株生長情況的影響

3 結(jié)論

本研究采用梯度營養(yǎng)稀釋法從水源地水體及底泥中篩選兼性貧營養(yǎng)微生物。通過培養(yǎng)基接種試驗(yàn)以及凈水試驗(yàn)，篩選出2株高效的凈水貧營養(yǎng)微生物，分別為短小芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌，兩者對(duì)TOC的7日去除率分別達(dá)71.52%、63.80%。生長曲線試驗(yàn)表明，提高培養(yǎng)基的濃度可以顯著提高細(xì)菌的富集效率。理化特性分析表明，2種兼性貧營養(yǎng)細(xì)菌生長均利用多種碳源和氮源，但在具體種類上存在一定差別，表明使用多種凈水微生物復(fù)配可能優(yōu)于單一微生物菌株的使用。耐鹽及抗性試驗(yàn)表明，高鹽環(huán)境對(duì)微生物生長具有一定抑制作用，濃度為3%的雙氧水和體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇均能將A6和A9殺死，因此2種菌株能安全地用于自來水凈水工藝中。