吳茜茜，周金旺 (.合肥學(xué)院生物食品與環(huán)境學(xué)院，安徽合肥 3060；.安徽高哲信息技術(shù)有限公司，安徽合肥 30088)

鐮刀菌、黃曲霉菌等是糧油作物的主要病原真菌，在溫暖潮濕地區(qū)，發(fā)病嚴(yán)重時可降低小麥和玉米等作物品質(zhì)，對糧油生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。小麥作為我國三大主糧之一，其生產(chǎn)和品質(zhì)關(guān)系我國的經(jīng)濟發(fā)展和社會穩(wěn)定，近年來隨著小麥品種、種植方式的優(yōu)化和營養(yǎng)調(diào)控，2020年小麥單產(chǎn)提高2%，年產(chǎn)量高達13 425萬t，這給小麥倉儲帶來了挑戰(zhàn)。小麥倉儲時一旦環(huán)境溫度和濕度發(fā)生改變，易受到植物病原菌侵染發(fā)生霉變，有的還產(chǎn)生真菌毒素，如黃曲霉產(chǎn)生黃曲霉毒素B1(AFB1)，鐮孢菌屬真菌產(chǎn)生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)，儲色曲霉屬和青霉屬微生物產(chǎn)生赭曲霉毒素A(OTA)，這對小麥及小麥加工農(nóng)產(chǎn)品造成污染，影響糧飼安全，因此，不同國家制定上述4種毒素限量標(biāo)準(zhǔn)，國家標(biāo)準(zhǔn)方法中檢測真菌毒素對儀器條件要求較高，且操作復(fù)雜，牛偉偉等分別采用高效液相色譜法或酶聯(lián)免疫吸附法、快速試紙條法檢測小麥粉中玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素B1，證明真菌毒素快速檢測卡測定不僅操作簡單，結(jié)果也可靠。因此，筆者以尖孢鐮刀菌和黃曲霉為研究對象，模擬小麥的貯藏，采用快速試劑條法測定真菌毒素，即時準(zhǔn)確了解貯藏溫度和水分對真菌孢子和毒素的影響，為小麥的倉儲安全和食品安全提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

尖孢鐮刀菌()和黃曲霉()，由筆者所在課題組提供。

DON、AFB1、ZEN酶聯(lián)免疫定量試劑條，均為北京中檢葆泰生物技術(shù)有限公司提供。小麥籽粒由安徽省糧油研究所提供。

恒溫恒濕培養(yǎng)箱，真菌毒素快速定量檢測系統(tǒng)。

黃曲霉感染小麥：小麥用無菌水洗滌3次后，接入黃曲霉菌懸液(200個/mL，按照糧食原始量的50%比例加入到試驗小麥中，并攪拌均勻)，恒溫恒濕培養(yǎng)。

尖孢鐮刀菌感染小麥：小麥用無菌水洗滌3次后，接入尖孢鐮刀菌菌懸液(200個/mL，按照糧食原始量的50%比例加入試驗小麥中，并攪拌均勻)，恒溫恒濕培養(yǎng)。

小麥水分的測定。稱取30 g小麥樣品烘干至恒重，測得小麥原水分(水分=樣品小麥濕重—樣品小麥干重)。試驗需要小麥水分計算公式：

小麥水分=(樣品小麥含水量+外加水量)/加水后小麥重量×100%

孢子的計數(shù)。采用顯微血球計數(shù)板法計數(shù)。

孢子增長速率定義。指在孢子快速增長期單位質(zhì)量小麥在單位時間內(nèi)孢子平均增加量，單位：個/(g·d)。

2 結(jié)果與分析

貯藏溫度對小麥表皮尖孢鐮刀菌孢子數(shù)的影響。為了探究貯藏溫度對尖孢鐮刀菌孢子數(shù)的影響，分別在貯藏溫度20、25和30 ℃，水分15.0%的條件下貯藏，每7 d取樣，測定樣品中孢子數(shù)，結(jié)果見圖1、2。

圖1 不同貯藏溫度對小麥中尖孢鐮刀菌產(chǎn)孢量的影響Fig.1 Effects of different storage temperatures on spore yield of Fusarium oxysporum in wheat

圖2 不同貯藏溫度尖孢鐮刀菌孢子生長速率rxFig.2 Spore growth rate of Fusarium oxysporum at different storage temperatures

由圖1、2可知,貯藏前期(0～28 d)尖孢鐮刀菌孢子數(shù)增加緩慢；從第29天開始，孢子進入快速生長期。當(dāng)溫度為20 ℃時,尖孢鐮刀菌孢子增長速率為8.50個/(g·d),分別是25和30 ℃時的1.20和1.52倍,這表明20 ℃更有利于尖孢鐮刀菌孢子形成。溫度對尖孢鐮刀菌產(chǎn)孢量、孢子增長速率的影響依次是20 ℃>25 ℃>30 ℃。

水分含量對尖孢鐮刀菌孢子數(shù)的影響。為了探究水分對尖孢鐮刀菌小麥孢子數(shù)的影響，分別在水分含是15.0%、17.5%和20.0%、溫度25 ℃的條件下儲藏，對樣品孢子數(shù)進行計數(shù)，結(jié)果見圖3、4。

由圖3、4可知,在貯藏前期(0～28 d)尖孢鐮刀菌產(chǎn)孢量少,而后尖孢鐮刀菌進入快速產(chǎn)孢期；在快速產(chǎn)孢期，隨著小麥水分含量的提高，尖孢鐮刀菌產(chǎn)孢量也隨之增加，小麥水分含量對微生物產(chǎn)孢量的影響依次為20.0%>17.5%>15.0%。當(dāng)水分含量為20.0%時,尖孢鐮刀菌孢子增長速度為14.21個/(g·d),分別是水分含量15.0%和17.5%的2.00和1.26倍。

圖3 不同水分含量對尖孢鐮刀菌產(chǎn)孢量的影響Fig.3 Effects of different moisture contents on spore yield of Fusarium oxysporum

圖4 不同水分含量下尖孢鐮刀菌孢子生長速率rxFig.4 Spore growth rate of Fusarium oxysporum at different storage moisture content

環(huán)境因素對尖孢鐮刀菌產(chǎn)毒的影響。嘔吐毒素(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)是小麥需要同時檢測的食品安全指標(biāo)。由表1可知，在小麥水分含量為15.0%條件下，當(dāng)貯藏溫度從20 ℃提高到30 ℃時，此時尖孢鐮刀菌DON毒素開始合成時間則提前到第21天，且DON毒素量均低于國標(biāo)中DON限量標(biāo)準(zhǔn)，這說明貯藏溫度不僅影響DON毒素量，而且還影響其開始合成時間，這與熊科等研究結(jié)果一致;對于ZEN而言，當(dāng)水分含量為15.0%時，溫度變化對ZEN毒素量及合成時間的影響不明顯，且ZEN含量也低于國標(biāo)中ZEN限量標(biāo)準(zhǔn)。

表1 不同溫度對產(chǎn)毒的影響(水分15.0%)Table 1 Effects of different temperatures on toxin production(15.0% of moisture content) μg/kg

由表2可知，不同小麥水分含量下隨著小麥貯藏時間延長，DON、ZEN毒素積累量越高，到小麥貯藏49 d，DON、ZEN毒素量均未超過國標(biāo)中限量標(biāo)準(zhǔn)。這可能是因為尖孢鐮刀菌產(chǎn)毒素對濕度的要求較高，當(dāng)溫度為22～28 ℃且含水量為40%～50%時，DON、ZEN毒素才會大量積累。另外小麥貯藏后期(第35～49天)，小麥水分含量與DON、ZEN毒素積累量呈一定正相關(guān)性。

表2 不同水分含量對產(chǎn)毒的影響(25 ℃)Table 2 Effects of different moisture contents on toxin production(25 ℃) μg/kg

貯藏溫度對黃曲霉產(chǎn)孢量及AFB1毒素的影響。為了探究貯藏溫度對小麥中黃曲霉孢子數(shù)的影響，分別在貯藏溫度為20、25和30 ℃，水分為15.0%的條件下貯藏，每7 d取樣，測定樣品中孢子數(shù)，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，當(dāng)貯藏溫度為20 ℃時，在第0～35天黃曲霉產(chǎn)孢量少，第36天進入快速產(chǎn)孢期;當(dāng)貯藏溫度提高到25和30 ℃，則黃曲霉提前7 d進入快速產(chǎn)孢階段，此時孢子增長速率分別為10.56和12.65個/(g·d)，分別是20 ℃時孢子生長速率的1.63和1.95倍。

圖5 不同貯藏溫度對黃曲霉產(chǎn)孢量的影響Fig.5 Effects of different storage temperatures on spore yield of Aspergillus flavus

由圖6可知，溫度越高，越有利于AFB1毒素合成。當(dāng)貯藏溫度為20 ℃，在整個小麥貯藏期間(0～49 d)黃曲霉產(chǎn)AFB1毒素維持在較低水平，略高于國標(biāo)中AFB1的限量標(biāo)準(zhǔn)(5 μg/kg)；在25和30 ℃下小麥貯藏49 d，AFB1毒素分別為414和804 μg/kg，遠超過AFB1限量標(biāo)準(zhǔn)。

圖6 不同貯藏溫度對黃曲霉產(chǎn)AFB1毒素的影響Fig.6 Effects of different storage temperatures on AFB1 yield of Aspergillus flavus

水分含量對黃曲霉產(chǎn)孢量及AFB1毒素的影響。為了探究水分含量對黃曲霉孢子數(shù)的影響，分別在水分含量為15.0%和20.0%、溫度為25 ℃的條件下貯藏，對樣品的孢子數(shù)進行計數(shù)，結(jié)果見圖7、8。

圖7 不同水分含量對黃曲霉產(chǎn)孢量的影響Fig.7 Effects of different moisture contents on spore yield of Aspergillus flavus

由圖7可知，小麥水分含量影響黃曲霉快速產(chǎn)孢時間，當(dāng)小麥水分含量為15.0%時，黃曲霉第29天進入快速產(chǎn)孢期；當(dāng)水分含量提高到20.0%時，黃曲霉快速產(chǎn)孢時間提前了7 d，此時其孢子的增長速率為16.36個/(g·d)，分別是水分含量為15.0%和20.0%的1.55和1.20倍。

由圖8可知，在貯藏前期(第0～7天)，小麥的水分含量對黃曲霉產(chǎn)AFB1毒素的影響無明顯差異；隨著貯藏時間的延長，小麥水分含量越大，黃曲霉產(chǎn)AFB1毒素量越多，這表明高濕條件更有利于AFB1的合成。當(dāng)溫度為25 ℃，隨著小麥水分逐漸提高，AFB1在第8～14天陸續(xù)開始合成，此時黃曲霉孢子數(shù)維持在10/g數(shù)量級(<0.05)，因此，可以利用小麥中黃曲霉孢子數(shù)作為小麥產(chǎn)AFB1的預(yù)判方法之一。

圖8 不同水分含量對黃曲霉產(chǎn)AFB1毒素的影響Fig.8 Effects of different storage moisture content on AFB1 yield of Aspergillus flavus in wheat

3 結(jié)論

(1) 貯藏期間小麥水分含量及貯藏溫度的變化，影響黃曲霉()快速產(chǎn)孢期、孢子量和黃曲霉產(chǎn)AFB1毒素量；也影響尖孢鐮刀菌()產(chǎn)孢量、DON和ZEN毒素量。

(2)提高小麥的儲藏溫度和濕度,促進黃曲霉()AFB1的生成,遠超過國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的最低限量值(5 μg/kg);但對尖孢鐮刀菌 DON 和 ZEN 的生成影響較小,均低于國標(biāo)準(zhǔn)中DON最低限量值(1 000 μg/kg)和 ZEN 最低限量值(60 μg/kg)。