唐秀文

【關(guān)鍵詞】肺炎;耶氏肺孢子菌;聚合酶鏈式反應(yīng);宏基因組二代測序技術(shù)

中圖分類號：R563.1+1 文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.06.015

耶氏肺孢子菌肺炎（PJP）是一種由耶氏肺孢子菌（PJ）引起的呼吸系統(tǒng)機會性感染，常見于免疫功能低下或缺陷者。近年來，接受高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（HAART）和肺孢子菌肺炎預(yù)防措施的HIV感染患者發(fā)生PJP的概率明顯減少，但隨著癌癥患者、器官移植者、老年患者、先天性或獲得性免疫缺陷及因其他疾病而接受免疫抑制劑等肺孢子菌肺炎高危人群的擴大，臨床肺孢子菌肺炎患者日趨增多，年病死率達30%～50%[1～2]。PJP患者的臨床癥狀、體征、X線胸片及常規(guī)實驗室檢查均無特異性，易漏診和誤診。目前耶氏肺孢子菌缺乏穩(wěn)定、可靠的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，無法從培養(yǎng)方法獲得;血清β-D-葡聚糖（BDG）檢測敏感度高，但缺乏特異性[3～4];只能作為輔助診斷指標。目前診斷PJP的檢查“金標準”仍然是下呼吸道標本通過染色鏡檢發(fā)現(xiàn)特征性包囊和滋養(yǎng)體，推薦的GMS染色對包囊染色特異性好，對比性強，菌體容易辨認，故在臨床得到廣泛應(yīng)用，但受限于標本質(zhì)量、肺孢子菌的載量、檢驗師的從業(yè)經(jīng)驗以及耶氏肺孢子菌的形態(tài)多形性，檢出率較低，因此孢子菌肺炎的早期診斷比較困難?？茖W家們用分子生物學方法探求PJP的病原體，使用分子生物學方法檢測耶氏肺孢子菌采用的基因序列有：肺孢子菌線粒體大亞基核糖體核糖核酸（mitochondrial partial LSU rRNA gene，mtLSU rRNA）、內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（internally transcribed spacer，ITS）、主要表面糖蛋白（the major surface glycoproteins，MSG）及二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）等。本文主要綜述不同分子生物學診斷方法檢測耶氏肺孢子菌的研究進展。

1耶氏肺孢子菌分子生物學檢測方法

1.1普通聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）聚合酶鏈式反應(yīng)是美國科學家Kary Mullis在20世紀80年代發(fā)明的一種用于擴增特定DNA片段的分子生物學技術(shù)，并以此獲得諾貝爾化學獎。國外在1990年首次報道應(yīng)用PCR技術(shù)從宿主肺泡灌洗液（BALF）中檢出PJ-DNA，2006年，將PCR與免疫熒光法（IFA）兩種方法對比，結(jié)果顯示PCR方法敏感性更好。而GMS染色鏡檢法與PCR兩種方法相比則PCR的敏感性更高，更適合于臨床無創(chuàng)性標本的檢測。國內(nèi)有關(guān) PCR方法用于肺孢子菌肺炎（PCP）的文獻薈萃分析，大部分文獻證明PCR檢測法診斷PCP的敏感性和特異性明顯高于其他檢測法，但普通的PCR易受環(huán)境污染，具有一定的假陽性，可以用于臨床PCP患者的篩選，還可用于臨床治療效果評價[5]。

1.2巢式聚合酶鏈式反應(yīng)（nested polymerase chain reaction，Nested-PCR）巢式PCR 方法是在常規(guī)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新方法，通過兩輪PCR反應(yīng)，先后使用兩對引物，從極少量的模板擴增特異性DNA片段。1990年，相關(guān)研究以 pAZ102-E和pAZ102-H為引物，在患者支氣管肺泡灌洗液標本中擴增出肺孢子菌mtLSUrRNA片段，并證實PCR技術(shù)可以識別臨床數(shù)據(jù)和銀染色的假陽性及假陰性診斷，檢出率遠高于GMS染色法，可以用于早期診斷，漏診率和假陽性發(fā)生率低。國內(nèi)有研究通過mtLSU巢式PCR對98例呼吸疾病急性發(fā)作期患者的103 份標本進行檢測，發(fā)現(xiàn)mtLSU巢式PCR可以擴增出最低含量為366 fg的肺孢子菌基因，具有很高的靈敏性，8種其他真菌和細菌的DNA樣本均未擴增出目的片段，具有高度的特異性[6]。極大地提高了病原微生物檢測的敏感性和特異性，但其延長了檢測時間，也增加了檢測成本。

1.3實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（quantitative real-time PCR，qPCR）qPCR是對樣品特定的DNA進行定性及定量分析的PCR。通常使用熒光標記引物，通過儀器連續(xù)監(jiān)測每一次擴增反應(yīng)后的產(chǎn)物含量，獲得反應(yīng)動力學曲線，得出樣品中的起始濃度。qPCR與普通PCR相比在檢測疑診PJP患者的陽性率方面更節(jié)約時間，同時保持著較高的敏感性。而直接免疫熒光測定法（DFA）和qPCR兩種檢測方法檢測宿主PCP感染率的結(jié)果表明，qPCR特異性和敏感性顯著高于DFA。國內(nèi)有學者應(yīng)用qPCR技術(shù)與GMS染色對艾滋病合并肺部感染患者的BALF標本進行肺孢子菌檢測，發(fā)現(xiàn)在標本量少的情況下，qPCR法檢測肺孢子菌陽性率為53.8%（21/39），GMS染色法陽性率僅為2.5%（1/18）。RUIZ-RUIZ等[7]發(fā)明了一種新的實時PCR方法檢測肺孢子菌，即設(shè)計了Msg和mtLSUrRNA兩套引物，加入SYBR Green為熒光染料，與基于肺孢子蟲mtLSUrRNA序列的巢式PCR方法進行比較，發(fā)現(xiàn)巢式PCR檢測結(jié)果為陽性的70例標本，實時PCR檢測均為陽性;3例巢式PCR檢測為陰性的樣本經(jīng)實時定量PCR法檢測為陽性。此方法使用多重PCR，并用SYBR Green染料替代熒光探針，增加了檢測樣本中靶基因數(shù)，提高了檢測靈敏度，節(jié)約了檢測時間和成本。用qPCR檢測肺孢子菌可為臨床區(qū)分患者定植和感染，選擇治療方案提供參考，并且其檢測過程均在封閉條件下進行，可有效防止樣本污染。

1.4環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）LAMP是2000年日本科學家Notomi發(fā)明的一種核酸擴增技術(shù)，該方法采用了一種具有鏈置換功能的BstDNA聚合酶和四種專門設(shè)計的引物，可以識別目標DNA上的6個不同的序列，只有6個序列全部匹配時才能繼續(xù)擴增，因此大大提高了特異性。該方法很好地結(jié)合兩種技術(shù)的優(yōu)點，既能縮短報告時間，操作簡便，還能區(qū)分定植和感染。XUE等[8]也在LAMP的基礎(chǔ)上增加了實時檢測，改良的LAMP檢測方法與其他常見的肺微生物無交叉反應(yīng)性，其敏感性是常規(guī)PCR的1000倍。使用該方法檢測403例患者，其中281例（69.7%）檢測到肺孢子菌的定植，且間質(zhì)性肺疾病比在慢性阻塞性肺疾?。–OPD）中更常見，與穩(wěn)定的COPD患者相比，COPD急性加重患者的吉氏桿菌定植患病率更高。HUBER等[9]將LAMP反應(yīng)與熒光實時檢測相結(jié)合，將報告時間縮短至10分45秒至31分15秒，其中平均動手時間為2分45秒，測試運行的平均時間為9分38秒。該方法很好地結(jié)合兩種技術(shù)的優(yōu)點，既能縮短報告時間，操作簡便，還能區(qū)分定植和感染。2015年，張楠等人[10]在肺孢子菌16s rRNA保守序列設(shè)計引物，建立了LAMP法檢測肺孢子菌基因，最低檢出拷貝數(shù)為50 copies/mL，敏感性高于普通PCR最低檢出拷貝數(shù)（104 copies/mL），并且與其他病原體無交叉反應(yīng)，具有較高特異度。LAMP檢測對抑制劑的敏感性較低，因此可以直接在呼吸標本中進行，既能縮短報告時間，操作簡便，還能區(qū)分定植和感染。缺點是引物設(shè)計復(fù)雜，反應(yīng)涉及多種酶，不能進行長鏈DNA擴增，易出現(xiàn)假陽性。

1.5熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）FISH是一種非放射性原位雜交技術(shù)，原理是利用報告分子（如生物素、地高辛等）標記核酸探針，然后將探針與靶DNA雜交而形成探針及DNA雜交體，利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測體系對靶DNA進行定性、定量及定位分析。免疫功能低下的患者難以利用痰液及肺泡灌洗液標本診斷肺孢子菌肺炎，因此人體組織樣本更具診斷價值。DE SOUSA等[11]對30個石蠟包埋組織樣本進行熒光原位雜交試驗，以Grocott染色作為參考標準，并用呼吸道分泌物的實時PCR進行評估，證實FISH是一種肺組織中的肺孢子菌檢測高度敏感的篩查方法;而石蠟包埋活檢的特異性不理想，在FISH篩查結(jié)果呈陽性的情況下，需要使用其他技術(shù)進行驗證性檢測。在呼吸道分泌物中，吉氏梭菌特異性FISH檢測的診斷應(yīng)用具有可接受的敏感性和良好的特異性。

1.6其他聚合酶鏈反應(yīng)

1.6.1降落聚合酶鏈反應(yīng)（touchdown PCR，TD-PCR）在PCR反應(yīng)過程中，其他條件保持不變，退火溫度每個循環(huán)降低1 ℃，從高于Tm值逐漸降低至低于Tm值，在最低退火溫度下循環(huán)10次左右，使特異性產(chǎn)物富集而降低非特異性產(chǎn)物。有人開發(fā)了一種基于肺孢子菌二氫葉酸還原酶基因的定量TD-PCR，并將此方法用于臨床呼吸道標本檢測，證明具有較好的敏感性和特異性，可區(qū)分定植和感染。

1.6.2PCR熔解曲線技術(shù)（melting curve PCR，MC-PCR）在擴增反應(yīng)完成后，逐漸增加溫度使雙鏈DNA變性，熒光染料又回復(fù)到游離狀態(tài)導致熒光信號降低，監(jiān)測每一步的熒光信號可產(chǎn)生熔解曲線，在擴增產(chǎn)物的熔解溫度上有一特征峰可以區(qū)分特異產(chǎn)物與非特異產(chǎn)物。BERNAL-MARTNEZ等[12]發(fā)現(xiàn)一種基于real-time PCR的MC-PCR方法，可用于鑒別肺孢子菌和結(jié)核分枝桿菌及其他真菌感染。

1.7宏基因組測序法（metagenomic next-generation sequencing， mNGS）mNGS是一種不依賴傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)，基于二代測序技術(shù)的高通量測序方法，可快速準確地檢出所有微生物，覆蓋范圍廣，檢測時間短，準確性和靈敏度高于傳統(tǒng)病原體檢測[13]。隨著測序技術(shù)的飛速發(fā)展，測序成本呈指數(shù)級下降，推動了mNGS技術(shù)的快速普及，在臨床上被廣泛應(yīng)用于病原體快速診斷和抗生素耐藥性監(jiān)測等。HUANG等[14]用mNGS對127份傳統(tǒng)病原體檢測陰性的肺部樣品進行鑒定，結(jié)果顯示其中120份為陽性，包括了許多傳統(tǒng)病原體檢測方法通常無法檢出的真菌如肺孢子菌、霉菌等，以及容易檢出的病原菌如銅綠假單胞菌、結(jié)核分枝桿菌及鮑曼不動桿菌等。與傳統(tǒng)病原體檢測相比，mNGS敏感性更高（前者為25.73%，后者為88.30%），而特異性較低（前者為88.41%，后者為81.16%）。JIANG等[15]用mNGS對60例非HIV感染的PJP患者和134例診斷為非PJP肺炎患者的肺泡灌洗液及血清樣本進行鑒定，與傳統(tǒng)的檢測方法Gomori甲胺銀染法和血清（1，3）-β-D-葡聚糖對比，發(fā)現(xiàn)mNGS診斷PJP的敏感性為100%，顯著高于Gomori甲胺銀染色（25.0%）和血清（1，3）-β-D-葡聚糖（67.4%），mNGS的特異性（96.3%）明顯高于血清（1，3）-β-D-葡聚糖（81.4%），mNGS能有效鑒別患者的合并感染，在mNGS診斷后，71.7%的PJP患者修改了最初的抗菌治療方案。XIE等[16]通過mNGS早期明確診斷后，臨床依據(jù)結(jié)果調(diào)整患者治療方案，患者28 d、90 d生存率均有所提高，90 d生存率從57.7%提高至83.3%。mNGS受抗生素影響小，在使用抗生素前提下，mNGs的陽性率 （91.3%）顯著高于傳統(tǒng)方法（43.5%）[17～18]，ZHANG等[19]和CAMARGO等[20]研究均發(fā)現(xiàn)用mNGS與涂片鏡檢結(jié)果比較，mNGS敏感率和特異性明顯優(yōu)于涂片鏡檢方法。最近，mNGS作為一種多功能的診斷工具，已成功地用于各種傳染病中，與傳統(tǒng)方法相比，PJ的檢測陽性率增加[21～22]。另外，使用抗菌藥物對mNGS影響很小，mNGS有比傳統(tǒng)方法更快更準確的診斷優(yōu)勢，LI等[23]使用mNGS技術(shù)成功診斷PJP。因此mNGS能檢測和鑒定包括真菌、細菌及病毒等多種病原體，明顯提高病原體檢出敏感率和特異度，尤其對混合感染的檢測更具優(yōu)勢;但也有局限性，存在去人源化難度大、對RNA病毒檢出率低、真菌和結(jié)核菌提取DNA相對困難及可檢測標本中多種病原體等問題，所以臨床醫(yī)生需要結(jié)合患者的臨床癥狀、檢查資料及流行病學資料綜合分析，避免非致病菌干擾并作出正確判讀。

2小結(jié)

近年來隨著分子生物學技術(shù)不斷用于臨床疾病診療的探討，也運用于PJP診斷研究中，明顯提高敏感性和特異性。即七種分子生物學方法檢測陽性率均高于涂片染色鏡檢。但每種方法各有優(yōu)劣勢，普通PCR可作為篩查項目;qPCR及LAMP等技術(shù)能有效區(qū)分定植為臨床診療提供參考。mNGS能快速進行病原體鑒別，可同時鑒定出多種病原體，對混合感染的檢測具有優(yōu)勢，對抗生素耐藥性分析、疾病風險評估等個性化診斷，為推進精準醫(yī)療，實現(xiàn)患者的個性化治療提供技術(shù)支持，具有較好的發(fā)展空間。但是也有局限性，不能區(qū)分感染和定植。為了使這些新技術(shù)為臨床診療發(fā)揮更好的作用，相關(guān)專業(yè)委員會發(fā)布了相應(yīng)專家共識[24～26]。在耶氏肺孢子菌肺炎臨床診療中應(yīng)根據(jù)實際情況選擇適合的分子生物學方法，建議用多種方法聯(lián)合檢測，可以提高病原體診斷的準確性，減少漏診和誤診。

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（編輯：潘明志）