蔣曉可，劉長(zhǎng)寧

（1.中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園，云南 勐臘 666303；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

紫花苜蓿（Medicago sativaL.）因其高產(chǎn)潛力、廣泛的適應(yīng)性和優(yōu)良的營(yíng)養(yǎng)特性被譽(yù)為“牧草之王”，是世界上分布最廣、栽培歷史最悠久的飼草之一。近年來，隨著畜牧業(yè)的迅速發(fā)展，紫花苜蓿的需求增加，對(duì)紫花苜蓿的研究應(yīng)用愈加廣泛［1］。2020 年，四倍體紫花苜蓿兩個(gè)品種（新疆大葉和中苜一號(hào)）的參考基因組公布［2-3］，完成了染色體水平的基因組組裝，極大推進(jìn)了紫花苜?；蚬δ艿难芯亢推贩N改良的發(fā)展。

基因編輯是一種利用序列特異性核酸酶（sequence-specific nucleases,SSNs）在序列特定位點(diǎn)引起堿基突變的技術(shù)。CRISPR/Cas9 因其操作簡(jiǎn)單、實(shí)用高效而成為目前應(yīng)用最為廣泛的基因編輯技術(shù)，已被廣泛用于水稻、高粱、小麥、玉米、大豆、番茄、馬鈴薯的作物改良［4-6］。

基于以上背景，我們利用Django Web 框架，結(jié)合SQLite 數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建了紫花苜?；蚓庉嫈?shù)據(jù)庫(kù)（Alfalfa Gene Editing Database，AlfalfaGEDB），提供基因基本信息瀏覽、BLAST 序列比對(duì)、JBrowse基因組瀏覽器、多條件查詢、sgRNA 靶點(diǎn)設(shè)計(jì)、在線Heatmap 繪制、生物復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)繪制、基因家族預(yù)測(cè)和數(shù)據(jù)下載等功能。AlfalfaGEDB 及其相關(guān)工具為研究人員提供了一個(gè)實(shí)用性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便的平臺(tái)，用以檢索紫花苜蓿基因的相關(guān)信息，幫助研究人員更好的開展研究。本研究以MsHB7和Ms-PALM1基因?yàn)槔?，?duì)AlfalfaGEDB 的功能進(jìn)行展示，旨在證明AlfalfaGEDB 的實(shí)用性和數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果的可靠性。

1 材料和方法

1.1 AlfalfaGEDB 的數(shù)據(jù)處理

通過文獻(xiàn)檢索，對(duì)四倍體紫花苜蓿兩個(gè)品種（新疆大葉、中苜一號(hào)）的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行全面收集，將四倍體紫花苜蓿的蛋白序列比對(duì)至多個(gè)基因功能公共數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得了KEGG、GO、Pfam 等多種注釋信息；基于NCBI SRA 數(shù)據(jù)庫(kù)、EBI 和國(guó)家基因庫(kù)生命大數(shù)據(jù)平臺(tái)（CNGBdb）等公共數(shù)據(jù)庫(kù)，收集分析了212 份紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，涵蓋紫花苜蓿不同組織、不同環(huán)境脅迫等多種樣本；利用CRISPR-GE［7］和CRISPR-Local［8］靶點(diǎn)預(yù)測(cè)工具，對(duì)紫花苜蓿兩個(gè)品種分別進(jìn)行了sgRNA 預(yù)測(cè)，獲得4 套全基因組靶點(diǎn)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)，基因組覆蓋率達(dá)99%以上。

1.2 AlfalfaGEDB 的實(shí)現(xiàn)

基于紫花苜蓿多組學(xué)數(shù)據(jù)的挖掘和整理，利用Django Web 框架，結(jié)合SQLite 數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建了紫花苜?；蚓庉嫈?shù)據(jù)庫(kù)（Alfalfa Gene Editing Database，AlfalfaGEDB），訪問網(wǎng)址為：http://alfalfagedb.liu-lab.com/。AlfalfaGEDB 收錄了紫花苜蓿兩個(gè)品種基因組信息、多樣本的基因表達(dá)譜、全基因組sgRNA 靶點(diǎn)預(yù)測(cè)等信息，提供基因組信息在線瀏覽，轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量可視化以及sgRNA 靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)在線瀏覽等功能模塊。此外，數(shù)據(jù)庫(kù)也集成了在線BLAST、熱圖繪制，生物復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)查詢、基于CRISPR/Cas9 的sgRNA 靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)等工具。

1.3 AlfalfaGEDB 的應(yīng)用

以紫花苜蓿、CRISPR 等作為關(guān)鍵字進(jìn)行文獻(xiàn)搜集，選擇經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的功能基因MsHB7和MsPALM1作為主要查詢對(duì)象。通過AlfalfaGEDB的BLAST 序列比對(duì)工具，對(duì)基因進(jìn)行驗(yàn)證，得到該基因在AlfalfaGEDB 中對(duì)應(yīng)的基因名，實(shí)現(xiàn)基因ID 的轉(zhuǎn)化。Browse 功能用于查詢基因的基本信息；利用JBrowse 基因組瀏覽器進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)的可視化；在線Heatmap 繪制工具展示基因在不同組織和脅迫條件下的表達(dá)信息；多條件查詢用于查詢基因所在網(wǎng)絡(luò)的信息；Network 工具繪制基因所在的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；基因家族預(yù)測(cè)結(jié)果確定該基因所在的轉(zhuǎn)錄因子家族；sgRNA 靶點(diǎn)設(shè)計(jì)提示了該基因預(yù)測(cè)到的所有可能的靶點(diǎn)信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 MsHB7 基因在AlfalfaGEDB 中的應(yīng) 用

已有研究表明，MsHB7作為HD-Zip 轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，其過表達(dá)對(duì)紫花苜蓿鹽脅迫耐受性具有負(fù)調(diào)節(jié)作用［9］。此外，還有一些植物物種中的HD-Zip 成員在非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮作用。JcHDZ07基因是小桐子（Jatropha curcasL.）中HD-Zip 家族的成員，它在擬南芥中的過表達(dá)使轉(zhuǎn)基因品系對(duì)鹽脅迫更加敏感［10］。玉米（Zea maysL.）中ZmHDZ1的過表達(dá)使轉(zhuǎn)基因水稻鹽敏感性增強(qiáng)［11］；棉花（Gossypium hirsutumL.）GhHB12基因過表達(dá)也對(duì)擬南芥和棉花的鹽脅迫和耐旱性產(chǎn)生了負(fù)調(diào)控作用［12］。鹽堿脅迫是重要的植物非生物脅迫因子，土壤鹽堿化也是世界范圍內(nèi)備受關(guān)注的生態(tài)問題，紫花苜蓿作為優(yōu)質(zhì)的牧草品種，選育適宜的耐鹽堿品種將極大促進(jìn)紫花苜蓿的生產(chǎn)和發(fā)展［13］。

在AlfalfaGEDB 中搜索MsHB7（MsG0380016624.01）基因，可以得到如下結(jié)果：

（1）Browse 搜索結(jié)果如圖1 所示，可以得到該基因的染色體位置信息、序列信息、基因注釋信息、sgRNA 靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果，該基因在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋為HD-Zip 相關(guān)蛋白。

圖1 MsHB7（MsG0380016624.01）基本信息瀏覽

（2）BLAST 工具鑒定結(jié)果顯示：紫花苜蓿中苜一號(hào)品種中MsHB7（MsG0380016624.01）基因與蒺藜苜蓿中響應(yīng)ABA、鹽脅迫的MtHB12（XP_003602321.2）基因的氨基酸序列相似性高達(dá)98%（圖2A）。

（3）JBrowse 可視化結(jié)果顯示：MsHB7具有兩個(gè)外顯子和兩個(gè)CDS 區(qū)域（圖2B）。

（4）如圖2C 所示，轉(zhuǎn)錄因子基因家族鑒定結(jié)果表明MsHB7基因?qū)儆贖D-Zip 轉(zhuǎn)錄因子家族。

除基因的詳細(xì)信息，AlfalfaGEDB 提供的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析工具可幫助研究人員分析和挖掘更多的基因功能。AlfalfaGEDB 網(wǎng)絡(luò)查詢工具顯示：MsHB7與MsG0380016581.01 基因有蛋白互作關(guān)系（圖2D）。共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)查詢結(jié)果表明MsHB7與821 個(gè)基因有共表達(dá)關(guān)系，我們對(duì)p-value 值前10 的基因進(jìn)行了共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)展示（圖2E）。熱圖聚類（圖2F）顯示，MsHB7及其相關(guān)基因受鹽脅迫誘導(dǎo)變化明顯：與對(duì)照組相比（CZM、CXJ），這些基因在鹽處理下（TZM、TXJ）表達(dá)量上升。MsHB7基因sgRNA 靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖1D所示，利用CRISPR-GE 工具在MsHB7中預(yù)測(cè)出54個(gè)靶點(diǎn)，CRISPR-Local 工具預(yù)測(cè)出36 個(gè)靶點(diǎn)，兩個(gè)工具預(yù)測(cè)到的相同靶點(diǎn)數(shù)為35 個(gè)。

圖2 MsHB7在AlfalfaGEDB中查詢結(jié)果

2.2 MsPALM1 在 AlfalfaGEDB 中的應(yīng)用

莖葉比是衡量紫花苜蓿品質(zhì)的重要指標(biāo)，與紫花苜蓿的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值呈正相關(guān)，培育多葉型新品種有助于改善紫花苜蓿莖葉比，從而提高其產(chǎn)量和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。已有研究證明，C2H2 型鋅指轉(zhuǎn)錄因子——PALM1在二倍體蒺藜苜蓿復(fù)葉形成過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［14-15］。2020 年，研究人員利用紫花苜蓿新疆大葉基因組數(shù)據(jù)，以MtPALM1作為查詢，成功在紫花苜蓿中鑒定出4個(gè)MsPALM1等位基因：MS.gene059669,MS.gene09654,MS.gene21467 和 MS.gene015309。利用CRISPR/Cas9 技術(shù)，對(duì)調(diào)控紫花苜蓿小葉數(shù)目的Ms-PALM1等位基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，將三出復(fù)葉的紫花苜蓿突變?yōu)? 小葉的類掌狀復(fù)葉，大大加快了紫花苜蓿育種速度。

為了更直觀地對(duì)本數(shù)據(jù)庫(kù)sgRNA 靶點(diǎn)設(shè)計(jì)工具進(jìn)行驗(yàn)證，我們以MsPALM1為例，通過BLAST得到MtPALM1在新疆大葉基因組中的4 個(gè)等位基因，序列相似性99%以上（圖3A）。轉(zhuǎn)錄因子家族預(yù)測(cè)結(jié)果如圖3B 所示，MsPALM1的4 個(gè)等位基因?qū)儆贑2H2 轉(zhuǎn)錄因子家族，該結(jié)果進(jìn)一步印證了BLAST 結(jié)果的真實(shí)性。Browse 查詢結(jié)果顯示，4 個(gè)基因位于5 號(hào)染色體組的不同亞染色體上，GO 和Pfam 注釋結(jié)果相同，編碼C2H2 型鋅指蛋白（圖3C）。MsPALM1等位基因的表達(dá)矩陣熱圖顯示，其在敲除palm1 的葉片里明顯高表達(dá)（圖3D）。

圖3 MtPALM1在AlfalfaGEDB中的查詢結(jié)果

利用本數(shù)據(jù)庫(kù)的多靶點(diǎn)預(yù)測(cè)工具，成功預(yù)測(cè)到陳海濤等的研究中［16］敲除MsPALM1等位基因所用靶點(diǎn)：5’-GGAGACGAGCACGGTCGCGGCGG-3’（圖4），有力地證明了AlfalfaGEDB 靶點(diǎn)預(yù)測(cè)的可用性。

圖4 MsPALM1等位基因靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

3 小結(jié)

紫花苜?；蚓庉嫈?shù)據(jù)庫(kù)（AlfalfaGEDB）共收集了兩個(gè)品種紫花苜蓿的基因組數(shù)據(jù)、212 份紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及4 套全基因組sgRNA 預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)。在此基礎(chǔ)上，利用Django Web 框架，結(jié)合多種生物信息學(xué)工具，構(gòu)建了一個(gè)相對(duì)全面的紫花苜蓿基因編輯數(shù)據(jù)庫(kù)。本文通過對(duì)MsHB7和Ms-PALM1兩個(gè)實(shí)例進(jìn)行分析，對(duì)AlfalfaGEDB 的工具進(jìn)行了全方位的測(cè)試與驗(yàn)證，數(shù)據(jù)庫(kù)查詢結(jié)果與已有研究結(jié)果［3,17］的一致性也進(jìn)一步印證了紫花苜蓿基因編輯數(shù)據(jù)庫(kù)的實(shí)用性和可靠性。

豆科作物紫花苜蓿在改良土壤、水土保持、生物固氮等方面發(fā)揮了重要作用，其應(yīng)用對(duì)飼料、作物輪作和土壤肥力至關(guān)重要,是可持續(xù)農(nóng)業(yè)的重要組成部分。作為目前最全面的紫花苜蓿功能基因研究平臺(tái)，AlfalfaGEDB 為研究人員提供了友好的Web 服務(wù)和便捷高效的生物信息學(xué)工具，成為紫花苜蓿功能基因研究的重要補(bǔ)充工具，期待其能夠持續(xù)為紫花苜?；蚬δ苎芯亢瓦z傳育種提供有用的資源。