趙丹丹，瞿惠燕，楊濤，張曉青，郭佳瑩，周華

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院心病研究所，上海 201203

心力衰竭是大多數(shù)心血管疾病的終末階段，具有較高的發(fā)病率和病死率，且預(yù)后較差。左心功能與結(jié)構(gòu)改變是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的預(yù)測指標，與心肌細胞的進行性丟失密切相關(guān)。細胞凋亡是心肌細胞進行性丟失的主要原因。有研究表明，細胞凋亡參與心臟由代償性肥大到失代償性重構(gòu)的全過程。因此，抑制或消除凋亡級聯(lián)反應(yīng)可能有利于阻止不良重構(gòu)和心力衰竭的進展。PI3K/AKT通路是機體具有多重效應(yīng)的信號通路，并可通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員活性與表達調(diào)控細胞凋亡，參與心力衰竭的病理生理過程。

研究表明，中醫(yī)藥辨證論治心力衰竭具有多靶點、多途徑調(diào)節(jié)的作用。鹿紅方是周華教授治療心力衰竭的有效經(jīng)驗方，具有補腎強心、活血通絡(luò)功效，已在臨床應(yīng)用數(shù)十年。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鹿紅方可以改善心力衰竭患者心功能與臨床癥狀，抑制心力衰竭動物模型心肌細胞焦亡與炎癥反應(yīng)，延緩心力衰竭進程。基于此，本研究通過結(jié)扎冠狀動脈制備心肌梗死后心力衰竭大鼠模型，觀察鹿紅方能否通過調(diào)控PI3K/AKT通路抑制心肌細胞凋亡，為鹿紅方的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級健康雄性Wistar大鼠60只，7～8周齡，購于浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（浙）2019-0001。大鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，溫度（22±2）℃、相對濕度55%～75%環(huán)境，12 h/12 h明暗交替，自由攝食飲水。本實驗經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審批（PZSHUTCM190322020）。

1.2 藥物及制備

鹿紅方（鹿角片15 g，紅花9 g，山萸肉15 g，補骨脂20 g，淫羊藿30 g，女貞子30 g，沉香6 g），飲片購自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院。按比例稱取飲片，加10倍量水浸泡45 min，煎煮85 min，過濾，收集濾液，藥渣再加水煎煮45 min，過濾，合并2次濾液，減壓濃縮，噴霧干燥，制成干浸膏備用（每克浸膏含原藥材4.08 g），使用前加蒸餾水配制成濃度為0.276 g/mL。培哚普利片，8 mg/片，施維雅（天津）制藥有限公司，批號190527-02，使用前加適量蒸餾水配制成濃度為0.072 mg/mL。

1.3 主要試劑與儀器

TUNEL試劑盒（武漢賽維爾，貨號G1501），B型利鈉肽（BNP）試劑盒（上海朗頓生物，貨號BPE30445），異氟烷（上海玉研，貨號S10010533），BCA蛋白定量試劑盒、蛋白酶磷酸酶抑制劑、RIPA裂解液、SDS-PAGE配制試劑盒、BSA（上海碧云天生物，貨號分別為P0012、P1045、P0013C、P0012AC、ST023-200g），PI3K 抗體（美國CST，貨號4249），Akt抗體（美國CST，貨號4691），p-Akt抗體（美國CST，貨號4060），Bcl-2 抗體（英國Abcam，貨號ab196495），GAPDH 抗體（美國CST，貨號5174），Bax 抗體（美國Proteintech，貨號50599-2-Ig），HRP標記山羊抗兔IgG抗體（美國CST，貨號7074）。小動物超聲影像系統(tǒng)（美國GE，型號VIVID5），小動物麻醉機、呼吸機（上海玉研，型號分別為ABS-100、SAR-100），動物用心電圖機（深圳邦健，型號ECG-101G），多功能酶標儀（美國BioTek，型號Synergy H1），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能，型號4600SF）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及給藥

60只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、鹿紅方組和培哚普利組，每組15只。除假手術(shù)組外，其余大鼠參照文獻[9]方法通過結(jié)扎左冠狀動脈前降支（LAD）制備心力衰竭模型。大鼠術(shù)前禁食12 h，異氟烷吸入麻醉，連接呼吸機，于左胸第3、4肋間靠近胸骨處剪開皮膚，打開胸腔，去除心包膜，在左心耳下緣2 mm處用6-0號帶針絲線結(jié)扎LAD，結(jié)扎成功可見心尖部變白、心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段明顯抬高。將心臟復(fù)位，關(guān)閉胸腔，逐層進行縫合。術(shù)后連續(xù)7 d肌肉注射青霉素（40萬U/d）預(yù)防感染。假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎，其余操作步驟同前。

術(shù)后第2日開始灌胃，按照人與動物體表面積法換算給藥劑量，鹿紅方組給藥劑量為2.76 g/（kg·d），培哚普利組給藥劑量為0.72 mg/（kg·d），灌胃體積1 mL/100 g，假手術(shù)組和模型組灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)8周。

2.2 超聲檢測

末次給藥結(jié)束后，大鼠異氟烷吸入麻醉，采集M型超聲圖像，檢測大鼠心臟左室射血分數(shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）和左室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs），評價大鼠心功能和結(jié)構(gòu)。

2.3 ELISA檢測

BNP由心室肌細胞分泌，是目前心力衰竭診斷、評估病情與預(yù)后的常用指標，與疾病的嚴重程度呈正相關(guān)。超聲檢測結(jié)束后，行腹主動脈穿刺采血，常溫靜置2 h，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，分離上清液，按試劑盒說明書檢測大鼠血清BNP含量。

2.4 HE和Masson染色

腹主動脈取血結(jié)束后，迅速摘取大鼠心臟，用預(yù)冷生理鹽水沖洗，置于4%多聚甲醛中固定24 h以上。常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，分別進行HE 染色和Masson染色，觀察心肌組織病理改變和纖維化情況。采用Image J軟件計算心肌纖維化面積，心肌纖維化面積（%）＝膠原面積÷視野總面積×100%。

2.5 TUNEL檢測

取大鼠心肌組織石蠟切片，脫蠟至水，蛋白酶K進行抗原修復(fù)，破膜，加TUNEL顯色反應(yīng)液，37 ℃孵育2 h，DAPI復(fù)染細胞核，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，每張切片選取3個不重疊視野，采用Image J軟件計算心肌細胞凋亡指數(shù)。心肌細胞凋亡指數(shù)（%）＝凋亡細胞數(shù)÷總細胞數(shù)×100%。

2.6 Western blot檢測

取50 mg心肌組織，加入裂解液裂解，BCA法測定蛋白濃度。凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%BSA 室溫封閉2 h，TBST 洗膜7 min×3 次，滴加PI3K 一抗（1∶1 000）、AKT 一抗（1∶1 000）、p-AKT一抗（1∶2 000）、Bcl-2一抗（1∶1 000）、Bax一抗（1∶5 000）、GAPDH一抗（1∶2 000），4 ℃冰箱孵育過夜。TBST 洗膜7 min×3 次，滴加相應(yīng)二抗（1∶3 000），常溫孵育2 h。TBST 洗膜7 min×3 次，滴加ECL 發(fā)光液，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)獲取圖像，以GAPDH為內(nèi)參，Image J軟件計算各條帶灰度值。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 鹿紅方對模型大鼠心功能的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVEF、LVFS明顯降低（＜0.01），LVIDd、LVIDs 明顯升高（＜0.01），提示長期容量負荷超載導(dǎo)致大鼠左心功能降低，心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，心力衰竭模型復(fù)制成功。與模型組比較，鹿紅方組和培哚普利組大鼠LVEF、LVFS明顯升高（＜0.01），LVIDd、LVIDs 明顯降低（＜0.01）；與鹿紅方組比較，培哚普利組大鼠LVEF、LVFS明顯升高（＜0.05），LVIDd、LVIDs差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠心功能指標比較（）

4.2 鹿紅方對模型大鼠血清B型利鈉肽含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清BNP含量明顯增加（＜0.01）；與模型組比較，鹿紅方組和培哚普利組大鼠血清BNP含量明顯減少（＜0.01）；鹿紅方組與培哚普利組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血清BNP含量比較（，ng/L）

4.3 鹿紅方對模型大鼠心肌組織病理變化的影響

HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌細胞排序有序，形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常，細胞核致密清晰；模型組大鼠心肌組織有不同程度變性、壞死，心肌細胞排列紊亂、結(jié)構(gòu)模糊，局部心肌細胞消失，被增生的結(jié)締組織取代，有大量炎性細胞浸潤；與模型組比較，鹿紅方組和培哚普利組大鼠心肌組織病理損傷均明顯改善，心肌細胞水腫、壞死明顯減輕，排列略不規(guī)則，有少量炎性細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織形態(tài)（HE染色，bar=200 μm）

4.4 鹿紅方對模型大鼠心肌纖維化的影響

Masson染色中正常大鼠心肌組織呈紅色，膠原纖維呈藍色。結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌組織僅在血管周圍有少量散在的膠原纖維沉積；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠膠原纖維沉積嚴重，心肌纖維化面積明顯增加（＜0.01）；與模型組比較，鹿紅方組和培哚普利組大鼠心肌組織膠原纖維沉積明顯減輕，心肌纖維化面積明顯減少（＜0.05）；鹿紅方組與培哚普利組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）。結(jié)果見圖2、表3。

表3 各組大鼠心肌纖維化面積比較（，%）

圖2 各組大鼠心肌組織形態(tài)（Masson染色，bar=3 mm）

4.5 鹿紅方對模型大鼠心肌細胞凋亡的影響

TUNEL染色中陽性凋亡細胞核呈綠色熒光。結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠僅有少量心肌細胞凋亡；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡增加，心肌細胞凋亡指數(shù)明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，鹿紅方組和培哚普利組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)明顯降低（＜0.01）；鹿紅方組與培哚普利組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）。結(jié)果見圖3、表4。

圖3 各組大鼠心肌細胞凋亡陽性表達（TUNEL染色，bar=20 μm）

表4 各組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)比較（，%）

4.6 鹿紅方對模型大鼠心肌組織PI3K、AKT、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織PI3K、p-AKT、Bax蛋白表達明顯升高（＜0.01，＜0.05），Bcl-2 蛋白表達明顯降低（＜0.01）；與模型組比較，鹿紅方組和培哚普利組大鼠心肌組織PI3K、p-AKT、Bax 蛋白表達明顯降低（＜0.01，＜0.05），Bcl-2蛋白表達明顯升高（＜0.01）；鹿紅方組與培哚普利組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）。見圖4、表5。

圖4 各組大鼠心肌組織PI3K、AKT、Bcl-2、Bax蛋白免疫印跡

表5 各組大鼠心肌組織PI3K、p-AKT、Bcl-2、Bax蛋白表達比較（）

5 討論

心力衰竭發(fā)病機制復(fù)雜，涉及病理因素眾多。目前認為，心室重構(gòu)是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的基本機制，心肌細胞凋亡是心室重構(gòu)的重要病理基礎(chǔ)。正常情況下，細胞凋亡一般在衰老的細胞中發(fā)生，是機體維持細胞動態(tài)平衡的自我保護機制。當受到缺血、缺氧等損傷刺激時，機體氧化應(yīng)激水平增加、炎癥因子增多、細胞膜完整性及穩(wěn)定性被破壞，導(dǎo)致細胞凋亡發(fā)生。心肌細胞過度凋亡可使心肌細胞數(shù)量驟減，心臟收縮與舒張功能失常，最終導(dǎo)致心腔擴大、心室壁變薄、心肌肥大等心肌重構(gòu)的病理表現(xiàn)。因此，有效抑制心肌細胞凋亡對心力衰竭的防治和預(yù)后具有積極意義。

PI3K/AKT信號通路具有多種效應(yīng)功能，在調(diào)節(jié)血管再生、內(nèi)皮細胞功能、心肌細胞凋亡及糖脂代謝中具有重要作用，其對凋亡的調(diào)控主要體現(xiàn)在直接或間接調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax蛋白表達。Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡過程中起重要作用，Bcl-2、Bax蛋白表達水平與凋亡調(diào)控直接相關(guān)。PI3K是由催化亞基（p110）和調(diào)節(jié)亞基（p85）兩部分構(gòu)成的二聚體蛋白，當接收到刺激信號時，機體可通過2條途徑將底物二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）轉(zhuǎn)變?yōu)槿姿崃字＜〈迹≒IP3）而活化，活化后的PIP3進一步與AKT結(jié)合，使AKT募集到膜上而磷酸化激活。AKT磷酸化（p-AKT）水平是PI3K/AKT信號通路活化的重要標志之一。研究表明，長期心力衰竭患者心肌組織p-AKT水平顯著升高，經(jīng)左室輔助裝置治療后心肌組織p-AKT水平下降，心肌肥厚減輕，心功能得到改善。研究發(fā)現(xiàn)，心力衰竭模型小鼠p-AKT水平明顯升高，可誘導(dǎo)Bax表達，促進心肌細胞凋亡，而抑制p-AKT表達可有效改善模型小鼠心功能，減少心肌細胞凋亡，減輕心肌肥厚。

中醫(yī)學(xué)認為，心力衰竭為本虛標實之證，本虛以心氣虛、心陽虛為主，標實以水飲、瘀血、痰濁為患。由于“心腎相交”“水火既濟”，心陽虛不能下歸于腎，導(dǎo)致腎陽漸虛，腎陽虛衰又無以溫煦心陽，終致心腎陽虛。腎陽為一身陽氣之本，“五臟之陽氣非此不能發(fā)”。因此，心力衰竭中醫(yī)治療強調(diào)“心腎同治”，鹿紅方正是在此理論基礎(chǔ)上創(chuàng)制而成。方中鹿角片溫陽補腎、行血消腫，紅花活血袪瘀通經(jīng)，二者共為君藥；補骨脂、淫羊藿助君藥溫腎助陽之力，二者皆為臣藥；山萸肉、女貞子補益肝腎之陰陽，沉香溫腎納氣平喘，三藥合用調(diào)補陰陽，共為佐使藥。諸藥合用，共奏溫腎強心、活血通絡(luò)功效。

本實驗以LAD結(jié)扎法制備心力衰竭大鼠模型，以鹿紅方干預(yù)，發(fā)現(xiàn)鹿紅方可有效提高模型大鼠心功能，降低血清BNP含量，減輕心肌纖維化，抑制心肌細胞凋亡，并且下調(diào)PI3K、p-AKT、Bax蛋白表達，上調(diào)Bcl-2蛋白表達，提示其抗凋亡機制與抑制PI3K/AKT/Bax信號通路活化有一定關(guān)系。本研究揭示了鹿紅方抑制心肌細胞凋亡的可能作用機制，為其臨床應(yīng)用和深入研究提供一定實驗依據(jù)。