梁春芳，朱康寧，張 琦

（河南省人民醫(yī)院 省直第一醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450000）

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，發(fā)生率和病死率均較高。我國胃癌發(fā)病率較高，因胃癌患者初期無明顯特征，早期篩查的診斷率較低，待確診時大多已處于中晚期[1]。目前，胃癌的主要治療方法為化療，但有超過50%的患者會出現(xiàn)復發(fā)和轉移[2]。胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個極其復雜的過程，與一些原癌基因和抑癌基因異常表達密切相關[3]。因此，尋找異常表達的小分子，對胃癌的發(fā)生、發(fā)展及預后評估有重要的意義。miRNA是由22～24個核苷酸構成的單鏈非編碼RNA分子，廣泛分布于真核生物中，調(diào)控哺乳動物1/3的基因表達[4]。miRNA的異常表達與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，主要作用為調(diào)控癌基因或抑癌基因[5]。有研究結果顯示，miR-21在肝癌[6]、胃癌[7]和乳腺癌[8]等腫瘤中呈異常表達，主要通過與目的基因的特異性結合，阻斷其轉錄來調(diào)控基因的表達。miR-135a與消化系統(tǒng)腫瘤，如胃癌、結直腸癌和胰腺癌密切相關，主要通過抑制抑癌基因的活化來調(diào)控消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9-11]。這提示miR-21和miR-135a與胃癌有密切聯(lián)系，化療后檢測患者miR-21和miR-135a的表達或可用于評估胃癌患者的早期復發(fā)和轉移風險。為此，本研究擬探討胃癌患者血清miR-21、miR-135a表達與化療后復發(fā)、轉移的關系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年1月—2018年1月河南省人民醫(yī)院行化療的胃癌患者100例（胃癌組），其中男62例、女38例，年齡38~77歲。腫瘤部位包括賁門（22例）、胃體（34例）、胃竇（31例）、全胃（13例）；病理類型包括單純腺癌（55例）、印戒細胞癌（10例）、黏液腺癌（6例）、混合型（29例）；參考國際抗癌聯(lián)盟及美國腫瘤聯(lián)合會發(fā)布的胃癌TNM分期標準[12]進行TNM分期：ⅠB期8例、Ⅱ期15例、ⅢA期28例、ⅢB期22例、ⅢC期27例。另選取同期河南省人民醫(yī)院健康體檢者50名（正常對照組），其中男29名、女21名，年齡38～77歲。2個組之間年齡、性別差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。本研究經(jīng)河南省人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 納入與排除標準

納入標準：（1）以病理學檢查結果為診斷標準；（2）入組前未經(jīng)過放療或化療等治療；（3）臨床資料和隨訪資料齊全，且簽署知情同意書。

排除標準：（1）術前曾接受手術、輔助化療或放療；（2）腫瘤類型為肉瘤、間質(zhì)瘤或淋巴瘤；（3）化療過程中死亡；（4）患可經(jīng)血液傳播的傳染性疾病。

1.3 隨訪

在化療后1個月開始對患者進行隨訪，每個月采用電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）復查1次，如出現(xiàn)復發(fā)或轉移征象，則通過磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、正電子發(fā)射斷層顯像（positron emission tomography，PET）/CT和淋巴結穿刺等方法確診。從2016年2月開始，對患者進行24個月的隨訪。隨訪第12個月、第14個月和第18個月各失訪1例。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）

采集所有患者化療前和化療后第3、8、13、18、24個月的空腹靜脈血10 mL，采集正常對照者體檢當日的空腹靜脈血10 mL，4 ℃1 000×g離心15 min后，分離血清，置于-80 ℃保存待檢。采用Trizol LS試劑盒（美國Invitrogen公司）提取血清總RNA，采用NanoDrop 2000分光光度計（美國ThermoFisher Scientific公司）檢測總RNA的純度和濃度。將胃癌組與正常對照組的RNA濃度調(diào)至一致，再使用miRNA 第一鏈 cDNA 合成（加尾法）試劑盒將RNA逆轉錄（37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min）為cDNA。采用實時熒光定量PCR檢測miR-21和miR-135a表達。引物序列見表1。擴增條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-21和miR-135a的相對表達量。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件和Graphpad 5軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。計數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價miR-21和miR-135a判斷胃癌預后的效能。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組與正常對照組血清miR-21和miR-135a相對表達量比較

與正常對照組比較，胃癌組化療前血清miR-21相對表達量升高（P<0.05），miR-135a相對表達量降低（P<0.05），見表2。胃癌組中有79例（79%）miR-21表達升高，有68例（68%）miR-135a表達降低。

表2 胃癌組與正常對照組血清miR-21和miR-135a相對表達量比較

2.2 血清miR-21和miR-135a相對表達量與胃癌患者臨床病理特征的關系

胃癌組化療前血清miR-21和miR-135a相對表達量與淋巴結轉移、分化程度、浸潤深度有關（P<0.05），與年齡、性別、TNM分期、有無遠處轉移無關（P>0.05）。見表3。

表3 胃癌組血清中miR-21和miR-135表達水平與臨床特征的關系

2.3 胃癌組化療后復發(fā)轉移患者血清miR-21和miR-135a相對表達量

100例胃癌患者化療后隨訪24個月，失訪3例。97例完成隨訪的患者中有66例（68%）出現(xiàn)復發(fā)或轉移（復發(fā)轉移組），其中25例為局部復發(fā)、41例為遠處轉移，有33例死亡。未出現(xiàn)復發(fā)或轉移的患者歸入無復發(fā)轉移組。

復發(fā)轉移組化療后3、8、13、18和24個月的血清miR-21相對表達量高于無復發(fā)轉移組（P<0.05），miR-135a相對表達量低于無復發(fā)轉移組（P<0.05）。復發(fā)轉移組化療后血清miR-21相對表達量隨隨訪時間的延長而升高（P<0.05），血清miR-135a相對表達量隨隨訪時間的延長而降低（P<0.05）。無復發(fā)轉移組血清miR-21相對表達量隨隨訪時間的延長而降低（P<0.05），血清miR-135a相對表達量各時間點差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表4、表5。

表4 復發(fā)轉移組與無復發(fā)轉移組各隨訪時間點血清miR-21相對表達量比較

表5 復發(fā)轉移組與無復發(fā)轉移組各隨訪時間點血清miR-135a相對表達量比較

2.4 miR-21和miR-135a單項檢測及聯(lián)合檢測判斷胃癌化療后復發(fā)轉移的效能

以患者出現(xiàn)復發(fā)或轉移作為陽性（預后不良，66例），無復發(fā)或轉移作為陰性（31例），采用ROC曲線分析隨訪24個月時的miR-21和miR-135a檢測結果判斷胃癌預后的效能。結果顯示，miR-21和miR-135a判斷胃癌預后的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.789、0.826，最佳臨界值分別為1.27、1.88。以隨訪24個月時的miR-21和miR-135a檢測結果均陽性為聯(lián)合檢測陽性，均陰性為聯(lián)合檢測陰性，miR-21+miR-135a聯(lián)合檢測判斷胃癌預后的敏感性和特異性分別為91.2%和67.8%。見表6、圖1。

圖1 隨訪24個月時的miR-21和miR-135a判斷胃癌化療后復發(fā)轉移的ROC曲線

表6 隨訪24個月時的miR-21和miR-135a單項檢測和聯(lián)合檢測判斷胃癌化療后復發(fā)轉移的效能

3 討論

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，好發(fā)于50歲以上人群，但近年來有逐漸年輕化的趨勢，男女性發(fā)病比例約為2∶1[3]。由于胃癌早期癥狀不明顯，易被忽視，當患者被確診時已經(jīng)處于中晚期，錯過了最佳的治療時期，故大部分胃癌患者預后不良，復發(fā)轉移率較高[13]。有研究結果顯示，miRNA主要參與了腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲、遷移等過程，其異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-181、miR-145等參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展，可作為胃癌的生物標志物[15-16]。

本研究結果顯示，胃癌組化療前血清miR-21相對表達量高于正常對照組（P<0.05），miR-135 a相對表達量低于正常對照組（P<0.05）；高表達miR-21和低表達miR-135a與胃癌患者淋巴結轉移、中高分化、浸潤程度（漿膜層）密切相關，但與年齡、性別、遠處轉移、TNM分期無關，說明miR-21和miR-135可能參與了胃癌的發(fā)病過程。miR-21和miR-135a與消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。有研究發(fā)現(xiàn)，在消化系統(tǒng)腫瘤，如胃癌中，miR-21表達上調(diào)，miR-135a表達下調(diào)[9，17]。miR-21可通過抑制磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）的表達，阻礙磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB；又稱Akt）信號通路，促進腫瘤細胞增殖[18]；還可通過下調(diào)程序性細胞死亡因子4（programmed cell death 4，Pdcd4）的表達，誘導結直腸癌細胞的侵襲和遷移[19]。miR-135a與驅動蛋白家族成員C1（kinesin family member C1，KIFC1）結合后可下調(diào)KIFCI的表達，抑制胃癌細胞增殖，促進胃癌細胞凋亡[20]。在伴有淋巴結轉移的胃癌患者中，miR-135a可抑制瞬時受體電位通道1的表達，從而抑制胃癌的淋巴結轉移，減緩胃癌的發(fā)展[21]。

miR-21和miR-135a與胃癌的進展密切相關。本研究結果顯示，在24個月的隨訪期中，化療后復發(fā)轉移患者的血清miR-21相對表達量隨隨訪時間的延長而升高（P<0.05），血清miR-135a相對表達量隨隨訪時間的延長而降低（P<0.05）。提示miR-21和miR-135a與胃癌化療后復發(fā)轉移密切相關。本研究ROC曲線分析結果顯示，隨訪24個月時的miR-21和miR-135a單項檢測判斷胃癌預后的AUC分別為0.789、0.826，敏感性和特異性均>70%，兩者聯(lián)合檢測可在特異性稍降低（67.8%）的基礎上將敏感性提高至91.2%。這說明miR-21和miR-135a聯(lián)合檢測判斷胃癌患者化療后2年內(nèi)是否會發(fā)生復發(fā)或轉移具有較好的價值。

綜上所述，胃癌患者血清miR-21和miR-135a表達異常，且表達水平與胃癌患者的淋巴結轉移、分化程度、浸潤程度密切相關。血清miR-21和miR-135a聯(lián)合檢測對胃癌化療后復發(fā)或轉移的判斷具有較好的價值。