袁秋華,石鑫,吳文珊,代小毅,鐘駿熙,楊袁,簡(jiǎn)友亮,李瑞龍,王濤
深圳大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,廣東深圳 518071
羥基磷灰石(hydroxyapatite,HA)又稱(chēng)堿式磷酸鈣,化學(xué)式為Ca5(PO4)3(OH),是牙齒和骨骼的主要無(wú)機(jī)組成成分,因HA 具有良好的生物相容性、生物活性和生物降解性,在醫(yī)療材料領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1-2].另外,由于HA具有離子交換特性,在廢水處理方面也有廣泛的應(yīng)用[3-4].HA可降解吸收,對(duì)人體基本不存在毒副作用,因此可作為藥物載體材料使用[5].但是HA 作為生物材料單獨(dú)使用時(shí)脆性較大,且韌性較低[6],為HA 提高的力學(xué)性能,目前主要是將HA與其他高分子材料進(jìn)行復(fù)合[7-8].
氧化石墨烯(graphene oxide,GO)是石墨烯的衍生物,其單層碳原子構(gòu)成的二維空間的基面連接有大量親水性官能團(tuán),可以與其他的官能團(tuán)進(jìn)行酰化和酯化等共價(jià)反應(yīng)[9],具有超強(qiáng)吸附能力,對(duì)親/疏水藥物可以高負(fù)載.同時(shí),在生物環(huán)境中,GO 具有良好的相容性、分散性、較高的載藥量和良好的緩釋特性等特點(diǎn),能有效解決藥物易團(tuán)聚和藥效短等問(wèn)題[10].
姜黃素(curcumin,Cur)是植物界很稀少的具有二酮的色素,其形態(tài)為橙黃色結(jié)晶粉末,味稍苦,不溶于水,可溶于乙醇和冰醋酸,常作為食用色素使用.有研究證明,姜黃素具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽和抗氧化等作用[11].姜黃素的分子結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)活性酚結(jié)構(gòu),因此具有一定的抗氧化能力.作為一種天然酚性物質(zhì),Cur 還含有抗腫瘤和消炎物質(zhì),且有抗氧化特性,能誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[12].此外,Cur 通過(guò)抑制核因子-kappa B(nuclear factor-kappa B,NF-κB)通路激活[13]和降低組織內(nèi)活性氧水平等方式可延緩椎間盤(pán)退變進(jìn)程[14-15].但Cur 在水溶液中的溶解度不高,穩(wěn)定性差,而且在人體腸道內(nèi)代謝快,生物利用率低,不能很好地發(fā)揮Cur 的作用[16].因此,為提高Cur 的穩(wěn)定性與利用效率,將Cur作為目標(biāo)藥物模型進(jìn)行載藥復(fù)合微球的測(cè)試,為Cur治療食管癌、膝關(guān)節(jié)炎、阿爾茨海默病和糖尿病等提供參考.
模板法先通過(guò)較為簡(jiǎn)單方便的途徑合成模板,再通過(guò)物理或化學(xué)方法將目標(biāo)產(chǎn)物合成到模板上,去除模板后便可得到具有模板形貌與尺寸的目標(biāo)產(chǎn)物,分為硬模板法和軟模板法[17].本研究以合成的球狀碳酸鈣作為硬模板,通過(guò)水熱法以離子交換方式成功制備了球狀中空的HA-GO 復(fù)合微球,并通過(guò)X 射線粉末衍射(X-ray powder diffraction,XRD)、傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spec?troscopy,F(xiàn)TIR)、拉曼紅外光譜、場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微 鏡(field emission scanning electron microscope,F(xiàn)ESEM)和紫外可見(jiàn)光近紅外分光光度計(jì)(ultravio?let visible near-infrared spectrophotometers, UV-Vis-NIR)等測(cè)試手段對(duì)合成的復(fù)合微球進(jìn)行表征分析,同時(shí)對(duì)其載藥和釋藥等性能進(jìn)行研究.
試劑:磷酸氫二鈉((NH3)2HPO4)和二水氯化鈣(CaCl2·2H2O)購(gòu)于上海阿拉丁試劑有限公司;碳酸鈉(Na2CO3)、 檸 檬 酸(C6H8O7)和 無(wú) 水 乙 醇(CH3CH2OH)購(gòu)自廣州市東紅化工廠;姜黃素(C21H20O6,藥用級(jí)別,98%)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;氧化石墨烯購(gòu)自湖南豐化材料發(fā)展有限公司;中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞株購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司.
儀器:主要有日本島津傅里葉變換紅外光譜儀、德國(guó)Bruker 的(D8-ADVANCE)X 射線粉末衍射儀、日本電子株式會(huì)社公司的JSM-7800&TEAM型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡、英國(guó)雷尼紹公共有限公司的InVia Reflex 型激光顯微共聚焦拉曼紅外光譜儀以及Micromeritics 公司的全自動(dòng)比表面積與孔隙度分析儀.
1.2.1 CaCO3-GO微球的合成
制備不同反應(yīng)初始濃度的CaCl2溶液與Na2CO3溶液,向CaCl2溶液中加入0.5 mol/L 的檸檬酸控制劑攪拌溶解,加入質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的GO 超聲分散30 min,用1.0 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH = 5.8.將Na2CO3溶液倒入CaCl2的混合溶液中,同時(shí)迅速攪拌,調(diào)節(jié)pH ≈11,攪拌1 h,靜置沉淀22 h.用去離子水和乙醇洗滌多次,于烘箱60~70 ℃干燥,制得CaCO3-GO 模板.根據(jù)CaCl2溶液與Na2CO3溶液的反應(yīng)初始濃度共設(shè)4 組實(shí)驗(yàn),每組實(shí)驗(yàn)中c(CaCl2)=c(Na2CO3),依次為0.1、0.3、0.5 和1.0 mol/L,獲得的CaCO3-GO 模板對(duì)應(yīng)記作0.1CaCO3-GO、0.3CaCO3-GO、0.5CaCO3-GO和1.0CaCO3-GO.
1.2.2 HA-GO復(fù)合微球的制備
語(yǔ)篇中第二封信的送信人是寫(xiě)信人自己陶嵐。這更饒有意味。“現(xiàn)在我卻又要向你說(shuō)話了。”“一邊就從她衣袋內(nèi)取出一封信,仔細(xì)地交給他,象交給一件寶貝一樣。蕭澗秋微笑地受去,只略略的看一看封面,也就仔細(xì)地將它藏進(jìn)抽斗內(nèi),這種藏法也似要傳之久遠(yuǎn)一般?!鄙院?“他很快的走到桌邊,將那封信重新取出來(lái),用剪刀裁了口,抽出一張信紙,他靠在桌邊,幾乎和看福音書(shū)一樣,他看下去……”如此“授受”一個(gè)“文本”,耐人尋味。
分別稱(chēng)取4 種不同初始濃度下制備的CaCO3-GO 樣品各1.0 g,各自加入到50 mL 去離子水中,再加入0.06 mol/L(NH4)2·HPO4攪拌溶解,用1.0 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)溶液pH ≈11.于180 ℃下將混合溶液在反應(yīng)釜中反應(yīng),控制水熱反應(yīng)時(shí)間.待反應(yīng)結(jié)束后,水洗3~5 次,干燥后收集.實(shí)驗(yàn)對(duì)水熱反應(yīng)時(shí)間(分別為3、6和12 h)和不同初始濃度制備的CaCO3-GO兩個(gè)因素通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究分析.4 種CaCO3-GO 模板生成的HA-GO 產(chǎn)物對(duì)應(yīng)標(biāo)記為0.1HA-GO、0.3HA-GO、0.5HA-GO和1.0HA-GO.
依據(jù)ISO 10993.1-2018醫(yī)療器械的生物學(xué)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)對(duì)載體材料進(jìn)行體外細(xì)胞毒性測(cè)試,采用CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞毒性[18].稱(chēng)取0.9 g 樣品浸泡在無(wú)水乙醇24 h,過(guò)濾干燥后紫外消毒滅菌.再將樣品浸泡在20 mL 的完全培養(yǎng)基中,37 ℃、CO2恒溫培養(yǎng)浸提24 h,采用微孔濾膜過(guò)濾,收回浸提液.并以此浸提液濃度為基準(zhǔn)劃分體積分?jǐn)?shù)梯度,依次為 1.0%、 5.0%、 10.0%、 20.0%、 50.0%、70.0%、80.0%和100.0%的浸提液和完全培養(yǎng)基9個(gè)梯度,以完全培養(yǎng)基作為對(duì)照組,其余作為實(shí)驗(yàn)組.將中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)細(xì)胞接種于96 孔板,每組10 孔.各組分別加入200 μL對(duì)照培養(yǎng)液或不同濃度的浸提液.培養(yǎng)72 h后,在每孔加入CCK-8試劑,輕微震蕩后繼續(xù)放入恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2~3 h 后用實(shí)時(shí)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量各孔在450 nm 波長(zhǎng)處的光密度值D(450),實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)5次,取平均值,計(jì)算得出細(xì)胞相對(duì)增殖率.
配制一系列姜黃素?zé)o水乙醇溶液測(cè)定吸光度,計(jì)算回歸方程,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線.
分別稱(chēng)取4 種CaCO3-GO 模型生成的HA-GO 樣品各50 mg,將它們置于姜黃素的乙醇溶液中勻速混合24 h.在8 000 r/min 下離心15 min,分離并收集上清液,重復(fù)加入無(wú)水乙醇離心,使收集到的上清液總量為20 mL.測(cè)量上清混合液的光密度,通過(guò)與之前姜黃素乙醇溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比,計(jì)算微球的載藥量和包封率,并設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)以減少誤差.同時(shí)取空白樣,置于無(wú)水乙醇中同樣操作,排除空白微球的浸出物對(duì)測(cè)試過(guò)程的影響.包封率和載藥量的計(jì)算公式為
按2015 版中國(guó)藥典的規(guī)定對(duì)載藥微球進(jìn)行體外釋放試驗(yàn)[19],釋放溶液使用體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇稀鹽酸溶液來(lái)模擬人工胃液(pH=1.5). 稱(chēng)取50 mg 載藥樣品,放入透析袋中,然后放入釋放溶液中,在37 ℃水浴條件下攪拌,進(jìn)行藥物緩釋實(shí)驗(yàn).分別于0.5、1、2、4、8、12、24、48、72 和96 h 時(shí)取出4 mL 釋放溶液,同時(shí)補(bǔ)充4 mL 模擬的人工胃液,測(cè)量各個(gè)時(shí)間點(diǎn)釋放溶液的在波長(zhǎng)為(427±1)nm處吸光度,同樣進(jìn)行3個(gè)平行樣測(cè)試,減小誤差.緩沖液中藥物的累積釋放率E為
其中,V0為緩沖溶液的總體積(單位:mL);V為每次取出緩沖溶液的體積(單位:mL);ρn為第n次吸取緩沖溶液時(shí)測(cè)定的藥物質(zhì)量濃度(單位:mg/mL);ρi為第i次置換取樣時(shí)測(cè)定的藥物溶液質(zhì)量濃度(單位:mg/mL);m(藥物)為載藥微球中包裹的藥物質(zhì)量(單位:mg).
圖1 為不同反應(yīng)濃度條件下制備的CaCO3-GO的XRD 圖譜.碳酸鈣主要有文石、方解石和球霰石3種無(wú)水結(jié)晶相.方解石是熱力學(xué)最穩(wěn)定,能量最低的晶型,而球霰石是熱力學(xué)最不穩(wěn)定.能量最高,文石介于兩者之間[20].低反應(yīng)濃度(c(CaCl2)=c(Na2CO3)= 0.1 mol/L)與高反應(yīng)濃度(c(CaCl2)=c(Na2CO3)= 1.0 mol/L)得到的XRD 圖譜顯示均為方解石晶型,根據(jù)比對(duì)方解石的標(biāo)準(zhǔn)卡片(PDF#05-0586),圖譜的強(qiáng)衍射峰基本與方解石的(104)、(018)和(116)等晶面符合,進(jìn)而可以判斷合成的為方解石的碳酸鈣.對(duì)比球霰石的標(biāo)準(zhǔn)卡片(PDF#33-0268),在0.3 mol/L 反應(yīng)條件下,出現(xiàn)球霰石的衍射峰,其(112)和(114)晶面衍射峰強(qiáng)度很高,不過(guò)仍然顯示存在方解石的衍射峰.在0.5 mol/L 時(shí),也可以明顯看出兩種晶型的衍射峰同時(shí)存在,但方解石的衍射峰強(qiáng)度強(qiáng)一些.說(shuō)明在低反應(yīng)濃度時(shí)生成的主要是熱力學(xué)較穩(wěn)定的方解石晶型的CaCO3,在增大反應(yīng)濃度后,部分方解石晶型向球霰石晶型轉(zhuǎn)化,但濃度增大到一定程度時(shí),存在形式又轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的方解石.說(shuō)明反應(yīng)濃度確實(shí)影響碳酸鈣的晶型變化,在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)濃度下可以生成球霰石晶型.GO的特征衍射峰在2θ=11.7°處,可能由于本實(shí)驗(yàn)中強(qiáng)度太弱,沒(méi)有檢測(cè)到.
圖1 不同反應(yīng)濃度制備的CaCO3-GO的XRD圖譜Fig.1 The XRD patterns of CaCO3-GO prepared with different reaction concentrations.
圖2 不同反應(yīng)濃度制備的CaCO3-GO的FTIR圖譜Fig.2 FTIR images of CaCO3-GO prepared with different reaction concentrations.
100~200 nm,呈束狀聚集(如0.1 mol/L 時(shí));當(dāng)反應(yīng)濃度增大到0.3 mol/L 時(shí),出現(xiàn)球狀顆粒,且表面光滑,球狀比較完整,部分呈橢球狀,夾雜少許棒狀顆粒,球形的粒徑為0.9~2.0 μm,粒徑分布比較均勻;當(dāng)濃度增至0.5 mol/L 時(shí),球狀減少,多呈圓餅狀且大小不一,同時(shí)還有不太規(guī)則的棒狀存在;當(dāng)高反應(yīng)濃度1.0 mol/L 時(shí),基本上沒(méi)有微米級(jí)的可辨識(shí)形貌,只有納米顆粒呈團(tuán)聚分布.從圖3可明顯看出,反應(yīng)濃度對(duì)碳酸鈣是否能呈現(xiàn)微球狀的形貌有重要的影響.
圖3 (a)0.1CaCO3-GO、(b)0.3CaCO3-GO、(c)0.5CaCO3-GO和(d)1.0CaCO3-GO的FESEM圖像Fig.3 FESEM images of(a)0.1CaCO3-GO,(b)0.3CaCO3-GO,(c)0.5CaCO3-GO,and(d)1.0CaCO3-GO.
圖4為4種不同初始反應(yīng)濃度制備的CaCO3-GO水熱后生成的HA-GO 的XRD 圖譜.總體來(lái)看,碳酸鈣的衍射峰基本消失.與HA的標(biāo)準(zhǔn)卡片(PDF#09-0432)對(duì)比可以看出,不同反應(yīng)濃度下生成的HA-GO 復(fù)合物均出現(xiàn)HA 的特征衍射峰[21-22].說(shuō)明CaCO3轉(zhuǎn)化成了HA,且純度也比較高.同時(shí),在2θ≈11°時(shí)有很微弱的峰,此處為HA 與GO 重疊的衍射峰.
圖4 不同初始反應(yīng)濃度制備的CaCO3-GO水熱后生成的HA-GO的XRD圖譜Fig.4 XRD patterns of HA-GO generated from CaCO3-GO prepared by different initial reaction concentrations after hydrothermal treatment.
圖5 為不同初始反應(yīng)濃度制備的CaCO3-GO 水熱后生成的HA-GO 的傅里葉紅外圖譜.由圖5 可見(jiàn),在569和605 cm-1處為PO43-基團(tuán)的彎曲振動(dòng)峰,1 050 cm-1處的吸收峰為PO43-基團(tuán)的伸縮振動(dòng)吸收峰[23].同時(shí)還發(fā)現(xiàn),712 cm-1處的球霰石的CO32-基團(tuán)振動(dòng)峰已消失,745 cm-1處方解石的特征吸收峰也不再出現(xiàn).1 462 cm-1和415 cm-1處為GO的C—O振動(dòng)峰,也為CO32-基團(tuán)的C—O振動(dòng)峰,可能是由于水熱反應(yīng)后仍有部分CO32-存在于HA 中.3 500 cm-1處的吸收峰應(yīng)該是GO 的—OH 峰.結(jié)合上述XRD 分析,碳酸鈣已基本轉(zhuǎn)化為HA,說(shuō)明該水熱反應(yīng)條件下陰離子交換比較徹底.
圖5 不同初始反應(yīng)濃度制備的CaCO3-GO水熱后生成的HA-GO的傅里葉紅外圖譜Fig.5 FTIR patterns of HA-GO generated from CaCO3-GO prepared by different initial reaction concentrations after hydrothermal treatment.
圖7是在180 ℃進(jìn)行CaCO3-GO水熱反應(yīng),反應(yīng)時(shí)間分別為3、6 和12 h 生成的HA-GO 的XRD 圖譜.由圖7 可見(jiàn),當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為3 h 時(shí),對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)卡片已經(jīng)出現(xiàn)HA 的晶相,而球霰石的特征衍射峰仍然存在,說(shuō)明兩者共同存在,此時(shí)CaCO3已經(jīng)開(kāi)始轉(zhuǎn)化為HA.經(jīng)過(guò)高溫高壓,PO43-開(kāi)始跟CaCO3中的CO32-進(jìn)行交換[24],但仍有CaCO3的衍射峰,說(shuō)明部分CaCO3沒(méi)有轉(zhuǎn)化成功.而隨著時(shí)間的延長(zhǎng),交換越來(lái)越徹底,在反應(yīng)6 h 和12 h 時(shí),已經(jīng)沒(méi)有CaCO3的衍射峰,說(shuō)明CaCO3已完全轉(zhuǎn)化為HA.
圖6 (a)0.1HA-GO、(b)0.3HA-GO、(c)0.5HA-GO、(d)16 000倍鏡下的0.3HA-GO和(e)22 500倍鏡下的1.0 HA-GO的SEM圖Fig.6 SEM images of(a)0.1HA-GO,(b)0.3HA-GO,(c)0.5HA-GO,(d)high magnification of 0.3HA-GO,and(e)1.0 HA-GO.
圖7 不同水熱時(shí)間制備的HA-GO的XRD圖譜Fig.7 XRD patterns of HA-GO prepared at different hydrothermal times.
圖8為不同水熱反應(yīng)時(shí)間(3、6和12 h)條件下制備的HA-GO 的SEM 圖像.由圖8 可以看出,樣品基本都呈球狀,并保持模板CaCO3的形態(tài).水熱反應(yīng)時(shí)間3 h 的樣品,微球表面粗糙,且有微小的顆粒存在.反應(yīng)時(shí)間為6 h 時(shí),微球更加粗糙,表面顆粒變大.增加水熱時(shí)間至12 h,有的微球破碎,表面粗糙,內(nèi)部呈現(xiàn)中空結(jié)構(gòu),有網(wǎng)絡(luò)狀微結(jié)構(gòu)存在.結(jié)合XRD 分析,可以看出水熱反應(yīng)時(shí)間為6 h 時(shí)能獲得形貌較好、轉(zhuǎn)化徹底的HA-GO微球.
圖8 水熱時(shí)間分別為(a)3 h、(b)6 h和(c)12 h制備的HA-GO的SEM圖Fig.8 SEM images of HA-GO prepared with hydrothermal time of(a)3 h,(b)6 h,and(c)12 h.
因此,以下實(shí)驗(yàn)將使用0.3HA-GO且水熱反應(yīng)時(shí)間為6 h、形貌較好的復(fù)合微球進(jìn)行相關(guān)測(cè)試分析.
圖9為HA-GO復(fù)合微球的拉曼光譜.從圖9可見(jiàn),在1 350 cm-1處,GO 和0.3HA-GO 都有1 個(gè)明顯的振動(dòng)峰,稱(chēng)為D 帶,這是石墨烯的無(wú)序振動(dòng)峰.位于1 600 cm-1的峰屬于石墨烯的本征拉曼模式,稱(chēng)為G 帶.589 和960 cm-1分別對(duì)應(yīng)于v3(PO43-)反對(duì)稱(chēng)變角振動(dòng)峰及v1(PO43-)對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰,是HA 的特征峰.用D 帶與G 帶的強(qiáng)度比(ID/IG)表征石墨烯材料的無(wú)序度.GO 的ID/IG=0.85,HA-GO 的ID/IG=0.94,復(fù)合樣品擁有較高的ID/IG,表明復(fù)合樣品中GO的缺陷密度增加.
圖9 GO和0.3HA-GO復(fù)合微球的拉曼光譜Fig.9 Raman spectra of GO and 0.3HA-GO composite microspheres.
圖10是0.3HA-GO微球的Barrett-Joyner-Halenda(BJH)孔徑分布圖以及吸脫附等溫曲線.根據(jù)吸脫附等溫曲線可知,微球的吸脫附等溫曲線符合典型的Ⅲ型等溫線,其滯后環(huán)為H3 型[25],說(shuō)明微球的組成微粒之間存在許多狹縫型的孔隙,觀察相應(yīng)SEM 圖也可相互印證這點(diǎn).測(cè)得比表面積為22.71 m2/g.根據(jù)孔徑大小分類(lèi):孔徑≤2 nm為微孔;孔徑介于2~50 nm 的為介孔;孔徑≥50 nm 為大孔.通過(guò)BJH法分析微球孔徑可知,微球的平均孔徑為30~50 nm,屬于介孔材料.結(jié)合以上分析可知,制備的HA-GO 復(fù)合微球是內(nèi)部中空結(jié)構(gòu)的介孔材料.
圖10 HA-GO 微球的BJH孔徑分布圖及吸脫附等溫曲線(a)BJH孔徑分布;(b)吸脫附等溫曲線Fig.10 Adsorption-desorption isotherm curve of HA-GO microspheres.(a)BJH pore size distribution map,(b)adsorption and desorption isotherms.
通過(guò)體外培養(yǎng)CHO 細(xì)胞評(píng)估HA-GO 復(fù)合微球?qū)?xì)胞增殖的影響,結(jié)果如圖11.CCK-8的結(jié)果表明,以對(duì)照組統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)量為參考標(biāo)準(zhǔn),不同濃度的浸提液對(duì)細(xì)胞增殖基本沒(méi)有負(fù)面影響,說(shuō)明含復(fù)合微球物質(zhì)的培養(yǎng)液沒(méi)有毒性,因而復(fù)合微球?qū)?xì)胞增殖基本上沒(méi)有毒性.
圖11 不同體積分?jǐn)?shù)的微球浸提液培養(yǎng)下的細(xì)胞相對(duì)增殖率Fig.11 Relative proliferation rates in culture extracts of different amounts of the microspheres.
通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定得到姜黃素在無(wú)水乙醇中的最佳吸收波長(zhǎng)為(427 ± 1)nm.同時(shí),在(427±1)nm 波長(zhǎng)處測(cè)定配置的一系列姜黃素乙醇溶液的吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖12.通過(guò)線性擬合,發(fā)現(xiàn)在姜黃素乙醇溶液質(zhì)量濃度為0.05~2.0 μg/mL內(nèi)呈良好線性關(guān)系.
圖12 姜黃素在無(wú)水乙醇中的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.12 Standard curve of curcumin in absolute ethanol.Black square is the experimental data,and red line is the fitting curve.
包封率和載藥量是衡量載藥微球載藥性能的重要指標(biāo),載藥量和包封率高可使微球材料得到充分利用,從而減少原材料的浪費(fèi)和給藥次數(shù),減輕患者頻繁給藥的痛苦,臨床應(yīng)用價(jià)值更高.圖13 為復(fù)合微球的包封率及載藥量,由圖13 可見(jiàn),0.3HA-GO 的樣品擁有較好的負(fù)載能力,其載藥量達(dá) 到(2.95 ± 0.19)%,包 封 率 達(dá) 到(20.90 ±0.31)%.這主要是因?yàn)?.3HA-GO 形成的是表面粗糙內(nèi)部中空的微球,給藥物提供了更多的著位點(diǎn),利于藥物吸附.
圖13 HA-GO的包封率與載藥量的柱狀圖Fig.13 Histograms of drug encapsulation efficiency(black)and drug loading(red)of HA-GO.
由于姜黃素屬于醇溶性物質(zhì),因此使用體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇稀鹽酸溶液(pH=1.5)作為模擬人工胃液進(jìn)行體外釋藥測(cè)試(圖14).由圖14 可以看出,載藥復(fù)合微球初釋放時(shí)呈平穩(wěn)釋放,沒(méi)有明顯的突釋現(xiàn)象,在給藥后120 h 時(shí)的累計(jì)釋放率達(dá)到72%.由曲線的走勢(shì)來(lái)看,釋放率還在緩慢抬升,說(shuō)明藥物后期還會(huì)釋放,最終藥物累積釋放率將高于72%,說(shuō)明HA-GO 微球既能起到緩釋?zhuān)帜芑緦⑺幬锿耆尫?
圖14 載藥微球在體積分?jǐn)?shù)為20%乙醇的模擬人工胃液(pH=1.4)中的累積釋放率隨時(shí)間變化Fig.14 Cumulative release rate of drug-loaded microspheres in artificial gastric juice(pH=1.4)supplemented with volume fraction of 20%ethanol changes with time.
綜上研究可知,初始底物的反應(yīng)濃度很大程度上影響CaCO3-GO 復(fù)合粉末的微觀形貌,是CaCO3能否形成球狀結(jié)構(gòu)的重要影響因素.而在轉(zhuǎn)化過(guò)程中,水熱時(shí)間是轉(zhuǎn)化進(jìn)程是否完成的重要因素,CaCO3-GO 復(fù)合粉末的基本微觀形貌決定了轉(zhuǎn)化后的HA-GO 復(fù)合粉末的形貌.研究結(jié)果表明,球狀碳酸鈣作為硬模板,通過(guò)水熱法以離子交換方式能成功制備球狀中空的HA-GO 復(fù)合微球.球形CaCO3-GO 的最優(yōu)反應(yīng)條件為0.3 mol/L 的反應(yīng)濃度.制備球形HA-GO的最優(yōu)合成條件為:使用0.3 mol/L 的CaCl2溶液和0.3 mol/L 的Na2CO3溶液制備的CaCO3-GO 復(fù)合產(chǎn)物,在180 ℃的高壓反應(yīng)釜中水熱反應(yīng)6 h.制備得到的CaCO3-GO復(fù)合微球的粒徑為5.1~7.7 μm,孔徑為30~50 nm.制備的HA-GO 復(fù)合微球,以姜黃素作為藥物模型進(jìn)行載藥性能及釋放性能的測(cè)試.結(jié)果發(fā)現(xiàn),球狀結(jié)構(gòu)的微球的確能提高藥物的負(fù)載量,復(fù)合微球的包封率能達(dá)到(20.90 ± 0.31)%、載藥量達(dá)到(2.95 ±0.19)%,對(duì)姜黃素起到了緩釋作用,并且釋放較為徹底.研究結(jié)果表明,HA-GO 載藥復(fù)合微球展現(xiàn)出良好的醫(yī)用前景.