袁秋華，石鑫，吳文珊，代小毅，鐘駿熙，楊袁，簡(jiǎn)友亮，李瑞龍，王濤

深圳大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東深圳 518071

羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）又稱(chēng)堿式磷酸鈣，化學(xué)式為Ca5（PO4）3（OH），是牙齒和骨骼的主要無(wú)機(jī)組成成分，因HA 具有良好的生物相容性、生物活性和生物降解性，在醫(yī)療材料領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［1-2］.另外，由于HA具有離子交換特性，在廢水處理方面也有廣泛的應(yīng)用［3-4］.HA可降解吸收，對(duì)人體基本不存在毒副作用，因此可作為藥物載體材料使用［5］.但是HA 作為生物材料單獨(dú)使用時(shí)脆性較大，且韌性較低［6］，為HA 提高的力學(xué)性能，目前主要是將HA與其他高分子材料進(jìn)行復(fù)合［7-8］.

氧化石墨烯（graphene oxide，GO）是石墨烯的衍生物，其單層碳原子構(gòu)成的二維空間的基面連接有大量親水性官能團(tuán)，可以與其他的官能團(tuán)進(jìn)行酰化和酯化等共價(jià)反應(yīng)［9］，具有超強(qiáng)吸附能力，對(duì)親/疏水藥物可以高負(fù)載.同時(shí)，在生物環(huán)境中，GO 具有良好的相容性、分散性、較高的載藥量和良好的緩釋特性等特點(diǎn)，能有效解決藥物易團(tuán)聚和藥效短等問(wèn)題［10］.

姜黃素（curcumin，Cur）是植物界很稀少的具有二酮的色素，其形態(tài)為橙黃色結(jié)晶粉末，味稍苦，不溶于水，可溶于乙醇和冰醋酸，常作為食用色素使用.有研究證明，姜黃素具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽和抗氧化等作用［11］.姜黃素的分子結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)活性酚結(jié)構(gòu)，因此具有一定的抗氧化能力.作為一種天然酚性物質(zhì)，Cur 還含有抗腫瘤和消炎物質(zhì)，且有抗氧化特性，能誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［12］.此外，Cur 通過(guò)抑制核因子-kappa B（nuclear factor-kappa B，NF-κB）通路激活［13］和降低組織內(nèi)活性氧水平等方式可延緩椎間盤(pán)退變進(jìn)程［14-15］.但Cur 在水溶液中的溶解度不高，穩(wěn)定性差，而且在人體腸道內(nèi)代謝快，生物利用率低，不能很好地發(fā)揮Cur 的作用［16］.因此，為提高Cur 的穩(wěn)定性與利用效率，將Cur作為目標(biāo)藥物模型進(jìn)行載藥復(fù)合微球的測(cè)試，為Cur治療食管癌、膝關(guān)節(jié)炎、阿爾茨海默病和糖尿病等提供參考.

模板法先通過(guò)較為簡(jiǎn)單方便的途徑合成模板，再通過(guò)物理或化學(xué)方法將目標(biāo)產(chǎn)物合成到模板上，去除模板后便可得到具有模板形貌與尺寸的目標(biāo)產(chǎn)物，分為硬模板法和軟模板法［17］.本研究以合成的球狀碳酸鈣作為硬模板，通過(guò)水熱法以離子交換方式成功制備了球狀中空的HA-GO 復(fù)合微球，并通過(guò)X 射線粉末衍射（X-ray powder diffraction，XRD）、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spec?troscopy，F(xiàn)TIR）、拉曼紅外光譜、場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微 鏡（field emission scanning electron microscope，F(xiàn)ESEM）和紫外可見(jiàn)光近紅外分光光度計(jì)（ultravio?let visible near-infrared spectrophotometers， UV-Vis-NIR）等測(cè)試手段對(duì)合成的復(fù)合微球進(jìn)行表征分析，同時(shí)對(duì)其載藥和釋藥等性能進(jìn)行研究.

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

試劑：磷酸氫二鈉（（NH3）2HPO4）和二水氯化鈣（CaCl2·2H2O）購(gòu)于上海阿拉丁試劑有限公司；碳酸鈉（Na2CO3）、 檸 檬 酸（C6H8O7）和 無(wú) 水 乙 醇（CH3CH2OH）購(gòu)自廣州市東紅化工廠；姜黃素（C21H20O6，藥用級(jí)別，98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；氧化石墨烯購(gòu)自湖南豐化材料發(fā)展有限公司；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞株購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司.

儀器：主要有日本島津傅里葉變換紅外光譜儀、德國(guó)Bruker 的（D8-ADVANCE）X 射線粉末衍射儀、日本電子株式會(huì)社公司的JSM-7800&TEAM型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡、英國(guó)雷尼紹公共有限公司的InVia Reflex 型激光顯微共聚焦拉曼紅外光譜儀以及Micromeritics 公司的全自動(dòng)比表面積與孔隙度分析儀.

1.2 復(fù)合微球的制備

1.2.1 CaCO3-GO微球的合成

制備不同反應(yīng)初始濃度的CaCl2溶液與Na2CO3溶液，向CaCl2溶液中加入0.5 mol/L 的檸檬酸控制劑攪拌溶解，加入質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的GO 超聲分散30 min，用1.0 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH = 5.8.將Na2CO3溶液倒入CaCl2的混合溶液中，同時(shí)迅速攪拌，調(diào)節(jié)pH ≈11，攪拌1 h，靜置沉淀22 h.用去離子水和乙醇洗滌多次，于烘箱60～70 ℃干燥，制得CaCO3-GO 模板.根據(jù)CaCl2溶液與Na2CO3溶液的反應(yīng)初始濃度共設(shè)4 組實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)中c（CaCl2）=c（Na2CO3），依次為0.1、0.3、0.5 和1.0 mol/L，獲得的CaCO3-GO 模板對(duì)應(yīng)記作0.1CaCO3-GO、0.3CaCO3-GO、0.5CaCO3-GO和1.0CaCO3-GO.

1.2.2 HA-GO復(fù)合微球的制備

語(yǔ)篇中第二封信的送信人是寫(xiě)信人自己陶嵐。這更饒有意味。“現(xiàn)在我卻又要向你說(shuō)話了。”“一邊就從她衣袋內(nèi)取出一封信,仔細(xì)地交給他,象交給一件寶貝一樣。蕭澗秋微笑地受去,只略略的看一看封面,也就仔細(xì)地將它藏進(jìn)抽斗內(nèi),這種藏法也似要傳之久遠(yuǎn)一般?！鄙院?“他很快的走到桌邊,將那封信重新取出來(lái),用剪刀裁了口,抽出一張信紙,他靠在桌邊,幾乎和看福音書(shū)一樣,他看下去……”如此“授受”一個(gè)“文本”,耐人尋味。

分別稱(chēng)取4 種不同初始濃度下制備的CaCO3-GO 樣品各1.0 g，各自加入到50 mL 去離子水中，再加入0.06 mol/L（NH4）2·HPO4攪拌溶解，用1.0 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)溶液pH ≈11.于180 ℃下將混合溶液在反應(yīng)釜中反應(yīng)，控制水熱反應(yīng)時(shí)間.待反應(yīng)結(jié)束后，水洗3～5 次，干燥后收集.實(shí)驗(yàn)對(duì)水熱反應(yīng)時(shí)間（分別為3、6和12 h）和不同初始濃度制備的CaCO3-GO兩個(gè)因素通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究分析.4 種CaCO3-GO 模板生成的HA-GO 產(chǎn)物對(duì)應(yīng)標(biāo)記為0.1HA-GO、0.3HA-GO、0.5HA-GO和1.0HA-GO.

1.3 細(xì)胞毒性分析

依據(jù)ISO 10993.1-2018醫(yī)療器械的生物學(xué)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)對(duì)載體材料進(jìn)行體外細(xì)胞毒性測(cè)試，采用CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞毒性［18］.稱(chēng)取0.9 g 樣品浸泡在無(wú)水乙醇24 h，過(guò)濾干燥后紫外消毒滅菌.再將樣品浸泡在20 mL 的完全培養(yǎng)基中，37 ℃、CO2恒溫培養(yǎng)浸提24 h，采用微孔濾膜過(guò)濾，收回浸提液.并以此浸提液濃度為基準(zhǔn)劃分體積分?jǐn)?shù)梯度，依次為 1.0%、 5.0%、 10.0%、 20.0%、 50.0%、70.0%、80.0%和100.0%的浸提液和完全培養(yǎng)基9個(gè)梯度，以完全培養(yǎng)基作為對(duì)照組，其余作為實(shí)驗(yàn)組.將中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細(xì)胞接種于96 孔板，每組10 孔.各組分別加入200 μL對(duì)照培養(yǎng)液或不同濃度的浸提液.培養(yǎng)72 h后，在每孔加入CCK-8試劑，輕微震蕩后繼續(xù)放入恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 h 后用實(shí)時(shí)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量各孔在450 nm 波長(zhǎng)處的光密度值D（450），實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)5次，取平均值，計(jì)算得出細(xì)胞相對(duì)增殖率.

1.4 微球包封率及載藥量分析

配制一系列姜黃素?zé)o水乙醇溶液測(cè)定吸光度，計(jì)算回歸方程，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線.

分別稱(chēng)取4 種CaCO3-GO 模型生成的HA-GO 樣品各50 mg，將它們置于姜黃素的乙醇溶液中勻速混合24 h.在8 000 r/min 下離心15 min，分離并收集上清液，重復(fù)加入無(wú)水乙醇離心，使收集到的上清液總量為20 mL.測(cè)量上清混合液的光密度，通過(guò)與之前姜黃素乙醇溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，計(jì)算微球的載藥量和包封率，并設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)以減少誤差.同時(shí)取空白樣，置于無(wú)水乙醇中同樣操作，排除空白微球的浸出物對(duì)測(cè)試過(guò)程的影響.包封率和載藥量的計(jì)算公式為

1.5 微球體外釋藥測(cè)定

按2015 版中國(guó)藥典的規(guī)定對(duì)載藥微球進(jìn)行體外釋放試驗(yàn)［19］，釋放溶液使用體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇稀鹽酸溶液來(lái)模擬人工胃液（pH=1.5）. 稱(chēng)取50 mg 載藥樣品，放入透析袋中，然后放入釋放溶液中，在37 ℃水浴條件下攪拌，進(jìn)行藥物緩釋實(shí)驗(yàn).分別于0.5、1、2、4、8、12、24、48、72 和96 h 時(shí)取出4 mL 釋放溶液，同時(shí)補(bǔ)充4 mL 模擬的人工胃液，測(cè)量各個(gè)時(shí)間點(diǎn)釋放溶液的在波長(zhǎng)為（427±1）nm處吸光度，同樣進(jìn)行3個(gè)平行樣測(cè)試，減小誤差.緩沖液中藥物的累積釋放率E為

其中，V0為緩沖溶液的總體積（單位：mL）；V為每次取出緩沖溶液的體積（單位：mL）；ρn為第n次吸取緩沖溶液時(shí)測(cè)定的藥物質(zhì)量濃度（單位：mg/mL）；ρi為第i次置換取樣時(shí)測(cè)定的藥物溶液質(zhì)量濃度（單位：mg/mL）；m(藥物)為載藥微球中包裹的藥物質(zhì)量（單位：mg）.

2 結(jié)果與討論

2.1 四種CaCO3-GO的XRD表征

圖1 為不同反應(yīng)濃度條件下制備的CaCO3-GO的XRD 圖譜.碳酸鈣主要有文石、方解石和球霰石3種無(wú)水結(jié)晶相.方解石是熱力學(xué)最穩(wěn)定，能量最低的晶型，而球霰石是熱力學(xué)最不穩(wěn)定.能量最高，文石介于兩者之間［20］.低反應(yīng)濃度（c（CaCl2）=c（Na2CO3）= 0.1 mol/L）與高反應(yīng)濃度（c（CaCl2）=c（Na2CO3）= 1.0 mol/L）得到的XRD 圖譜顯示均為方解石晶型，根據(jù)比對(duì)方解石的標(biāo)準(zhǔn)卡片（PDF#05-0586），圖譜的強(qiáng)衍射峰基本與方解石的（104）、（018）和（116）等晶面符合，進(jìn)而可以判斷合成的為方解石的碳酸鈣.對(duì)比球霰石的標(biāo)準(zhǔn)卡片（PDF#33-0268），在0.3 mol/L 反應(yīng)條件下，出現(xiàn)球霰石的衍射峰，其（112）和（114）晶面衍射峰強(qiáng)度很高，不過(guò)仍然顯示存在方解石的衍射峰.在0.5 mol/L 時(shí)，也可以明顯看出兩種晶型的衍射峰同時(shí)存在，但方解石的衍射峰強(qiáng)度強(qiáng)一些.說(shuō)明在低反應(yīng)濃度時(shí)生成的主要是熱力學(xué)較穩(wěn)定的方解石晶型的CaCO3，在增大反應(yīng)濃度后，部分方解石晶型向球霰石晶型轉(zhuǎn)化，但濃度增大到一定程度時(shí)，存在形式又轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的方解石.說(shuō)明反應(yīng)濃度確實(shí)影響碳酸鈣的晶型變化，在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)濃度下可以生成球霰石晶型.GO的特征衍射峰在2θ=11.7°處，可能由于本實(shí)驗(yàn)中強(qiáng)度太弱，沒(méi)有檢測(cè)到.

圖1 不同反應(yīng)濃度制備的CaCO3-GO的XRD圖譜Fig.1 The XRD patterns of CaCO3-GO prepared with different reaction concentrations.

2.2 四種CaCO3-GO的FTIR表征

圖2 不同反應(yīng)濃度制備的CaCO3-GO的FTIR圖譜Fig.2 FTIR images of CaCO3-GO prepared with different reaction concentrations.

2.3 四種CaCO3-GO的FESEM表征

100～200 nm，呈束狀聚集（如0.1 mol/L 時(shí)）；當(dāng)反應(yīng)濃度增大到0.3 mol/L 時(shí)，出現(xiàn)球狀顆粒，且表面光滑，球狀比較完整，部分呈橢球狀，夾雜少許棒狀顆粒，球形的粒徑為0.9～2.0 μm，粒徑分布比較均勻；當(dāng)濃度增至0.5 mol/L 時(shí)，球狀減少，多呈圓餅狀且大小不一，同時(shí)還有不太規(guī)則的棒狀存在；當(dāng)高反應(yīng)濃度1.0 mol/L 時(shí)，基本上沒(méi)有微米級(jí)的可辨識(shí)形貌，只有納米顆粒呈團(tuán)聚分布.從圖3可明顯看出，反應(yīng)濃度對(duì)碳酸鈣是否能呈現(xiàn)微球狀的形貌有重要的影響.

圖3 （a）0.1CaCO3-GO、（b）0.3CaCO3-GO、（c）0.5CaCO3-GO和（d）1.0CaCO3-GO的FESEM圖像Fig.3 FESEM images of(a)0.1CaCO3-GO,(b)0.3CaCO3-GO,(c)0.5CaCO3-GO,and(d)1.0CaCO3-GO.

2.4 四種HA-GO的XRD分析

圖4為4種不同初始反應(yīng)濃度制備的CaCO3-GO水熱后生成的HA-GO 的XRD 圖譜.總體來(lái)看，碳酸鈣的衍射峰基本消失.與HA的標(biāo)準(zhǔn)卡片（PDF#09-0432）對(duì)比可以看出，不同反應(yīng)濃度下生成的HA-GO 復(fù)合物均出現(xiàn)HA 的特征衍射峰［21-22］.說(shuō)明CaCO3轉(zhuǎn)化成了HA，且純度也比較高.同時(shí)，在2θ≈11°時(shí)有很微弱的峰，此處為HA 與GO 重疊的衍射峰.

圖4 不同初始反應(yīng)濃度制備的CaCO3-GO水熱后生成的HA-GO的XRD圖譜Fig.4 XRD patterns of HA-GO generated from CaCO3-GO prepared by different initial reaction concentrations after hydrothermal treatment.

2.5 四種HA-GO的FTIR分析

圖5 為不同初始反應(yīng)濃度制備的CaCO3-GO 水熱后生成的HA-GO 的傅里葉紅外圖譜.由圖5 可見(jiàn)，在569和605 cm-1處為PO43-基團(tuán)的彎曲振動(dòng)峰，1 050 cm-1處的吸收峰為PO43-基團(tuán)的伸縮振動(dòng)吸收峰［23］.同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，712 cm-1處的球霰石的CO32-基團(tuán)振動(dòng)峰已消失，745 cm-1處方解石的特征吸收峰也不再出現(xiàn).1 462 cm-1和415 cm-1處為GO的C—O振動(dòng)峰，也為CO32-基團(tuán)的C—O振動(dòng)峰，可能是由于水熱反應(yīng)后仍有部分CO32-存在于HA 中.3 500 cm-1處的吸收峰應(yīng)該是GO 的—OH 峰.結(jié)合上述XRD 分析，碳酸鈣已基本轉(zhuǎn)化為HA，說(shuō)明該水熱反應(yīng)條件下陰離子交換比較徹底.

圖5 不同初始反應(yīng)濃度制備的CaCO3-GO水熱后生成的HA-GO的傅里葉紅外圖譜Fig.5 FTIR patterns of HA-GO generated from CaCO3-GO prepared by different initial reaction concentrations after hydrothermal treatment.

2.6 四種HA-GO的FESEM分析

2.7 不同水熱時(shí)間制備的HA-GO的XRD分析

圖7是在180 ℃進(jìn)行CaCO3-GO水熱反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間分別為3、6 和12 h 生成的HA-GO 的XRD 圖譜.由圖7 可見(jiàn)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為3 h 時(shí)，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)卡片已經(jīng)出現(xiàn)HA 的晶相，而球霰石的特征衍射峰仍然存在，說(shuō)明兩者共同存在，此時(shí)CaCO3已經(jīng)開(kāi)始轉(zhuǎn)化為HA.經(jīng)過(guò)高溫高壓，PO43-開(kāi)始跟CaCO3中的CO32-進(jìn)行交換［24］，但仍有CaCO3的衍射峰，說(shuō)明部分CaCO3沒(méi)有轉(zhuǎn)化成功.而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，交換越來(lái)越徹底，在反應(yīng)6 h 和12 h 時(shí)，已經(jīng)沒(méi)有CaCO3的衍射峰，說(shuō)明CaCO3已完全轉(zhuǎn)化為HA.

圖6 （a）0.1HA-GO、（b）0.3HA-GO、（c）0.5HA-GO、（d）16 000倍鏡下的0.3HA-GO和（e）22 500倍鏡下的1.0 HA-GO的SEM圖Fig.6 SEM images of(a)0.1HA-GO,(b)0.3HA-GO,(c)0.5HA-GO,(d)high magnification of 0.3HA-GO,and(e)1.0 HA-GO.

圖7 不同水熱時(shí)間制備的HA-GO的XRD圖譜Fig.7 XRD patterns of HA-GO prepared at different hydrothermal times.

2.8 不同水熱時(shí)間制備的HA-GO的FESEM表征

圖8為不同水熱反應(yīng)時(shí)間（3、6和12 h）條件下制備的HA-GO 的SEM 圖像.由圖8 可以看出，樣品基本都呈球狀，并保持模板CaCO3的形態(tài).水熱反應(yīng)時(shí)間3 h 的樣品，微球表面粗糙，且有微小的顆粒存在.反應(yīng)時(shí)間為6 h 時(shí)，微球更加粗糙，表面顆粒變大.增加水熱時(shí)間至12 h，有的微球破碎，表面粗糙，內(nèi)部呈現(xiàn)中空結(jié)構(gòu)，有網(wǎng)絡(luò)狀微結(jié)構(gòu)存在.結(jié)合XRD 分析，可以看出水熱反應(yīng)時(shí)間為6 h 時(shí)能獲得形貌較好、轉(zhuǎn)化徹底的HA-GO微球.

圖8 水熱時(shí)間分別為（a）3 h、（b）6 h和（c）12 h制備的HA-GO的SEM圖Fig.8 SEM images of HA-GO prepared with hydrothermal time of(a)3 h,(b)6 h,and(c)12 h.

因此，以下實(shí)驗(yàn)將使用0.3HA-GO且水熱反應(yīng)時(shí)間為6 h、形貌較好的復(fù)合微球進(jìn)行相關(guān)測(cè)試分析.

2.9 HA-GO的拉曼分析

圖9為HA-GO復(fù)合微球的拉曼光譜.從圖9可見(jiàn)，在1 350 cm-1處，GO 和0.3HA-GO 都有1 個(gè)明顯的振動(dòng)峰，稱(chēng)為D 帶，這是石墨烯的無(wú)序振動(dòng)峰.位于1 600 cm-1的峰屬于石墨烯的本征拉曼模式，稱(chēng)為G 帶.589 和960 cm-1分別對(duì)應(yīng)于v3（PO43-）反對(duì)稱(chēng)變角振動(dòng)峰及v1（PO43-）對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰，是HA 的特征峰.用D 帶與G 帶的強(qiáng)度比（ID/IG）表征石墨烯材料的無(wú)序度.GO 的ID/IG=0.85，HA-GO 的ID/IG=0.94，復(fù)合樣品擁有較高的ID/IG，表明復(fù)合樣品中GO的缺陷密度增加.

圖9 GO和0.3HA-GO復(fù)合微球的拉曼光譜Fig.9 Raman spectra of GO and 0.3HA-GO composite microspheres.

2.10 HA-GO的N2吸附脫附分析

圖10是0.3HA-GO微球的Barrett-Joyner-Halenda（BJH）孔徑分布圖以及吸脫附等溫曲線.根據(jù)吸脫附等溫曲線可知，微球的吸脫附等溫曲線符合典型的Ⅲ型等溫線，其滯后環(huán)為H3 型［25］，說(shuō)明微球的組成微粒之間存在許多狹縫型的孔隙，觀察相應(yīng)SEM 圖也可相互印證這點(diǎn).測(cè)得比表面積為22.71 m2/g.根據(jù)孔徑大小分類(lèi)：孔徑≤2 nm為微孔；孔徑介于2～50 nm 的為介孔；孔徑≥50 nm 為大孔.通過(guò)BJH法分析微球孔徑可知，微球的平均孔徑為30～50 nm，屬于介孔材料.結(jié)合以上分析可知，制備的HA-GO 復(fù)合微球是內(nèi)部中空結(jié)構(gòu)的介孔材料.

圖10 HA-GO 微球的BJH孔徑分布圖及吸脫附等溫曲線（a）BJH孔徑分布；（b）吸脫附等溫曲線Fig.10 Adsorption-desorption isotherm curve of HA-GO microspheres.(a)BJH pore size distribution map,(b)adsorption and desorption isotherms.

2.11 細(xì)胞毒性測(cè)試分析

通過(guò)體外培養(yǎng)CHO 細(xì)胞評(píng)估HA-GO 復(fù)合微球?qū)?xì)胞增殖的影響，結(jié)果如圖11.CCK-8的結(jié)果表明，以對(duì)照組統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)量為參考標(biāo)準(zhǔn)，不同濃度的浸提液對(duì)細(xì)胞增殖基本沒(méi)有負(fù)面影響，說(shuō)明含復(fù)合微球物質(zhì)的培養(yǎng)液沒(méi)有毒性，因而復(fù)合微球?qū)?xì)胞增殖基本上沒(méi)有毒性.

圖11 不同體積分?jǐn)?shù)的微球浸提液培養(yǎng)下的細(xì)胞相對(duì)增殖率Fig.11 Relative proliferation rates in culture extracts of different amounts of the microspheres.

2.12 姜黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定得到姜黃素在無(wú)水乙醇中的最佳吸收波長(zhǎng)為（427 ± 1）nm.同時(shí)，在（427±1）nm 波長(zhǎng)處測(cè)定配置的一系列姜黃素乙醇溶液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖12.通過(guò)線性擬合，發(fā)現(xiàn)在姜黃素乙醇溶液質(zhì)量濃度為0.05～2.0 μg/mL內(nèi)呈良好線性關(guān)系.

圖12 姜黃素在無(wú)水乙醇中的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.12 Standard curve of curcumin in absolute ethanol.Black square is the experimental data，and red line is the fitting curve.

2.13 HA-GO的載藥性能及藥物釋放曲線

包封率和載藥量是衡量載藥微球載藥性能的重要指標(biāo)，載藥量和包封率高可使微球材料得到充分利用，從而減少原材料的浪費(fèi)和給藥次數(shù)，減輕患者頻繁給藥的痛苦，臨床應(yīng)用價(jià)值更高.圖13 為復(fù)合微球的包封率及載藥量，由圖13 可見(jiàn)，0.3HA-GO 的樣品擁有較好的負(fù)載能力，其載藥量達(dá) 到（2.95 ± 0.19）%，包 封 率 達(dá) 到（20.90 ±0.31）%.這主要是因?yàn)?.3HA-GO 形成的是表面粗糙內(nèi)部中空的微球，給藥物提供了更多的著位點(diǎn)，利于藥物吸附.

圖13 HA-GO的包封率與載藥量的柱狀圖Fig.13 Histograms of drug encapsulation efficiency(black)and drug loading(red)of HA-GO.

由于姜黃素屬于醇溶性物質(zhì)，因此使用體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇稀鹽酸溶液（pH=1.5）作為模擬人工胃液進(jìn)行體外釋藥測(cè)試（圖14）.由圖14 可以看出，載藥復(fù)合微球初釋放時(shí)呈平穩(wěn)釋放，沒(méi)有明顯的突釋現(xiàn)象，在給藥后120 h 時(shí)的累計(jì)釋放率達(dá)到72%.由曲線的走勢(shì)來(lái)看，釋放率還在緩慢抬升，說(shuō)明藥物后期還會(huì)釋放，最終藥物累積釋放率將高于72%，說(shuō)明HA-GO 微球既能起到緩釋?zhuān)帜芑緦⑺幬锿耆尫?

圖14 載藥微球在體積分?jǐn)?shù)為20%乙醇的模擬人工胃液（pH=1.4）中的累積釋放率隨時(shí)間變化Fig.14 Cumulative release rate of drug-loaded microspheres in artificial gastric juice(pH=1.4)supplemented with volume fraction of 20%ethanol changes with time.

結(jié) 語(yǔ)

綜上研究可知，初始底物的反應(yīng)濃度很大程度上影響CaCO3-GO 復(fù)合粉末的微觀形貌，是CaCO3能否形成球狀結(jié)構(gòu)的重要影響因素.而在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，水熱時(shí)間是轉(zhuǎn)化進(jìn)程是否完成的重要因素，CaCO3-GO 復(fù)合粉末的基本微觀形貌決定了轉(zhuǎn)化后的HA-GO 復(fù)合粉末的形貌.研究結(jié)果表明，球狀碳酸鈣作為硬模板，通過(guò)水熱法以離子交換方式能成功制備球狀中空的HA-GO 復(fù)合微球.球形CaCO3-GO 的最優(yōu)反應(yīng)條件為0.3 mol/L 的反應(yīng)濃度.制備球形HA-GO的最優(yōu)合成條件為：使用0.3 mol/L 的CaCl2溶液和0.3 mol/L 的Na2CO3溶液制備的CaCO3-GO 復(fù)合產(chǎn)物，在180 ℃的高壓反應(yīng)釜中水熱反應(yīng)6 h.制備得到的CaCO3-GO復(fù)合微球的粒徑為5.1～7.7 μm，孔徑為30～50 nm.制備的HA-GO 復(fù)合微球，以姜黃素作為藥物模型進(jìn)行載藥性能及釋放性能的測(cè)試.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，球狀結(jié)構(gòu)的微球的確能提高藥物的負(fù)載量，復(fù)合微球的包封率能達(dá)到（20.90 ± 0.31）%、載藥量達(dá)到（2.95 ±0.19）%，對(duì)姜黃素起到了緩釋作用，并且釋放較為徹底.研究結(jié)果表明，HA-GO 載藥復(fù)合微球展現(xiàn)出良好的醫(yī)用前景.