車曉囡

(聊城市畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展中心，山東 聊城 252000)

0 引言

近年來，我國(guó)的養(yǎng)鴨業(yè)迅速發(fā)展，正處于分散零星放養(yǎng)和規(guī)模集約化并存階段。鴨大腸桿菌病因其抗原性復(fù)雜，血清型種類繁多，發(fā)病的表現(xiàn)形式不同[1]，已經(jīng)成為鴨的主要疾病之一，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。它的臨床表現(xiàn)及病理特點(diǎn)不一，剖檢時(shí)病理變化多樣。若混有其他病原體感染，情況將更為嚴(yán)重[3]。目前，抗生素的使用能很好遏制其發(fā)生，但長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生耐藥性。同時(shí)抗生素的濫用和廣泛持續(xù)使用加劇了畜禽產(chǎn)品中的藥物殘留，引發(fā)食品安全事件。為了合理使用抗生素，建議臨床用藥不能單憑經(jīng)驗(yàn)，最好通過藥敏試驗(yàn)篩選敏感藥物用于治療，并遵循用藥原則，減少耐藥性的產(chǎn)生，這樣也可以大大降低藥物殘留對(duì)人類健康的危害。

1 病例情況

聊城某養(yǎng)鴨場(chǎng)26日齡肉鴨出現(xiàn)大批死亡，病鴨出現(xiàn)精神萎頓、頭頸縮起、食欲減退、不愿走動(dòng)、呼吸困難、腹部腫大、排灰綠色或灰白色稀糞的臨床癥狀，少數(shù)出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫大現(xiàn)象；剖檢可見心包膜渾濁增厚，有的與心肌粘連，氣囊渾濁增厚，肝臟明顯腫大，肝臟外面附著一層奶酪樣纖維蛋白膜，易于剝離。針對(duì)該病例采用細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定，以此來確定治療方案。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 病料來源

供試病料來自山東聊城市某養(yǎng)鴨場(chǎng)。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康昆明系小鼠7只，是聊城大學(xué)獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室自繁自養(yǎng)。

2.1.3 培養(yǎng)基和試劑

該微生物實(shí)驗(yàn)室常用的各種培養(yǎng)基，自配的兔全血瓊脂培養(yǎng)基，各種生化反應(yīng)管及生化試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司。大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)抗“O”單因子血清為中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心郭玉廣老師惠贈(zèng)。

2.1.4 藥敏紙片

微生物實(shí)驗(yàn)室按胡桂學(xué)的含藥濾紙片的制備方法制備。一共20種藥，包括：頭孢菌素類有頭孢他啶、頭孢克肟、頭孢噻肟鈉、頭孢曲松鈉；氨基糖苷類有硫酸阿米卡星、硫酸鏈霉素、單硫卡、安普霉素、慶大霉素；喹諾酮類有乳酸環(huán)丙沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、甲磺酸培氟沙星；四環(huán)素類有鹽酸多西環(huán)素；喹惡啉類有乙酰甲喹；酰胺醇類有氟苯尼考；林可胺類有鹽酸林可、克林霉素；截?cái)鄠?cè)耳素類有延胡索酸泰妙菌素；多肽類有粘菌素；增效劑有乳酸TMP。

2.1.5 主要儀器設(shè)備

1)中國(guó)龍口市先進(jìn)儀器公司的600型電熱恒溫培養(yǎng)箱。

2)青島海爾股份有限公司的BCD-290W型冰箱。

3)龍口市先進(jìn)儀器公司的六聯(lián)電子調(diào)溫萬用電爐。

4)上海博迅實(shí)業(yè)有限公司的自動(dòng)高壓滅菌器。

5)深圳天南海北有限公司的SHA-3型恒溫振蕩器。

6)蘇州凈化設(shè)備有限公司的SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺(tái)。

7)重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠的CS101-1A型電熱鼓風(fēng)干燥箱。

2.2 試驗(yàn)方法及結(jié)果

2.2.1 細(xì)菌的分離純化

在無菌條件下對(duì)送檢的鴨頭進(jìn)行如下處理：先用酒精浸泡去污殺菌，接著用剪刀將其頭頂皮膚剪開并外翻暴露顱骨，拿滅菌剪刀剪開一側(cè)顱骨，再用滅菌后的接種環(huán)刺破腦膜取樣，在普通平板上劃線分離，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況[3]。挑取上述平板長(zhǎng)出的單個(gè)菌落接種到麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基和全血瓊脂培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，觀察分離菌在各種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性，結(jié)果見表1。

表1 分離菌在各種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性

2.2.2 生化試驗(yàn)及結(jié)果

對(duì)分離菌按照胡桂學(xué)[3]主編的獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程中的方法進(jìn)行細(xì)菌的乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、M.R試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)(即IMViC實(shí)驗(yàn))和三糖鐵培養(yǎng)基接種，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果(見表2)。

表2 生化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 血清型鑒定

將純化后的分離菌接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，用0.5%石碳酸生理鹽水制成濃菌液。然后高壓滅菌2 h破壞其“K”抗原，制成檢測(cè)用抗原。用大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)抗“O”單因子血清進(jìn)行玻片凝集反應(yīng)，同時(shí)設(shè)置檢測(cè)抗原與0.5%石碳酸生理鹽水混合液作為對(duì)照，觀察有無凝集反應(yīng)，若2 min內(nèi)出現(xiàn)明顯的凝集則判為陽性。對(duì)分離菌進(jìn)行O抗原鑒定后確定該菌血清型為O92。

2.2.4 動(dòng)物試驗(yàn)及結(jié)果

將分離菌的12 h肉湯培養(yǎng)物稀釋至含菌量為108/mL，昆明系小鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組用細(xì)菌原液、稀釋菌液，對(duì)照組用滅菌肉湯液作為實(shí)驗(yàn)組的空白對(duì)照，分別向?qū)嶒?yàn)組及對(duì)照組的昆明系小鼠按1 mL/只的劑量進(jìn)行腹腔注射。不同攻毒組小鼠進(jìn)行隔離飼養(yǎng)并連續(xù)觀察7 d。

結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組中注射原液的昆明系小鼠發(fā)病率100%、死亡率為100%；注射稀釋菌液的小鼠發(fā)病率100%，死亡率為66.7 %。其中注射細(xì)菌原液的3只小鼠在接種6 h后全都死亡，且未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀；而注射稀釋菌液的小鼠在10 h后開始出現(xiàn)食欲不振、精神沉郁、步態(tài)不穩(wěn)等癥狀，在1周的觀察期內(nèi)死亡2只，存活的1只也曾表現(xiàn)明顯的病態(tài)。對(duì)全部小鼠剖檢觀察：注射原液的小鼠無明顯病理變化；注射稀釋液菌液的小鼠出現(xiàn)肝淤血、脾腫大(見圖1)病理變化。之后分別取實(shí)驗(yàn)小鼠肝、心、脾、肺、腎進(jìn)行細(xì)菌分離和生化試驗(yàn)鑒定，取得跟上述試驗(yàn)一致的結(jié)果，證實(shí)小白鼠體內(nèi)分離的細(xì)菌和從鴨體內(nèi)分離的細(xì)菌是同一種菌。

圖1 實(shí)驗(yàn)小鼠的解剖圖

對(duì)照組注射滅菌肉湯液的3只昆明系小鼠連續(xù)觀察1周，沒有出現(xiàn)異常表現(xiàn)，剖檢后對(duì)其內(nèi)臟劃線接種也未分離到細(xì)菌，證實(shí)實(shí)驗(yàn)用的小鼠自身不含該致病菌。

通過實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組實(shí)驗(yàn)小鼠的解剖分析及實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)小鼠組織的細(xì)菌分離和生化試驗(yàn)鑒定，可以判定是由此大腸桿菌致使實(shí)驗(yàn)小鼠發(fā)病。結(jié)合病鴨的臨床表現(xiàn)、病理變化以及上述實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，最后確診為鴨大腸桿菌病。

2.2.5 藥敏試驗(yàn)及結(jié)果

采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行大腸桿菌藥物敏感性測(cè)定[4]。挑取純培養(yǎng)的單個(gè)菌落，接種于LB肉湯中，在恒溫振蕩器內(nèi)培養(yǎng)12 h，制備成細(xì)菌懸液并稀釋至含菌量為108/mL，取100 μL稀釋菌液均勻涂布于普通培養(yǎng)基表面，蓋好平皿，待平板表面稍干時(shí)，用鑷子取出藥敏片貼于涂有細(xì)菌的培養(yǎng)基表面，37℃溫箱培養(yǎng)18 h。觀察所有藥敏紙片抑菌環(huán)的大小。

參照NCCLS公布藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)，得出該大腸桿菌對(duì)頭孢他啶、鹽酸環(huán)丙沙星、硫酸阿米卡星、安普霉素、乳酸TMP高度敏感，耐藥藥物占被測(cè)藥物總數(shù)的65%。

3 臨床治療效果

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，可使用頭孢他啶、鹽酸環(huán)丙沙星、硫酸阿米卡星、安普、乳酸TMP等高度敏感藥物來控制該病。但單獨(dú)使用一種藥物療效緩慢，還易產(chǎn)生抗生素耐藥現(xiàn)象，為了使治療效果達(dá)到最好，根據(jù)藥物配伍原則，為該養(yǎng)鴨場(chǎng)推薦了頭孢他啶、硫酸阿米卡星和乳酸TMP這三種高敏藥物聯(lián)合使用來治療該病，用藥3 d就控制住了發(fā)病鴨群的死亡，連續(xù)用藥1周基本上控制了疫情，發(fā)病鴨明顯好轉(zhuǎn)。

4 討論

4.1 大腸桿菌血清型

大腸桿菌O血清型是對(duì)大腸桿菌進(jìn)行分類的主要依據(jù)之一，該例大腸桿菌是從送檢的鴨腦中分離到的，血清型為O92，將分離菌接種到全血瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)明顯的β溶血，可初步推測(cè)該大腸桿菌具有致病性，從動(dòng)物安全試驗(yàn)結(jié)果中可知，此大腸桿菌不僅對(duì)鴨具有致病性，對(duì)小鼠也有很強(qiáng)的致病力。

4.2 動(dòng)物試驗(yàn)攻毒劑量

在進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)時(shí)，在一定時(shí)間內(nèi)，注射不同菌液量會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生不同的致病作用。采用培養(yǎng)12 h肉湯液和含菌量為108/mL的稀釋菌液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用稀釋菌液進(jìn)行攻毒試驗(yàn)可以觀察到實(shí)驗(yàn)小鼠表現(xiàn)出精神沉郁、步態(tài)不穩(wěn)等明顯的臨床癥狀，剖檢后也能看到明顯的病理變化，而注射細(xì)菌原液的臨床癥狀表現(xiàn)不明顯，死亡時(shí)間短，并且解剖后觀察不到明顯的病理變化。因此，在進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)時(shí)要注意選用適當(dāng)?shù)墓ザ緞┝?，以求試?yàn)結(jié)果更精確。

4.3 注意事項(xiàng)

在制作培養(yǎng)基時(shí)，要嚴(yán)格按照規(guī)章制度操作，尤其注意掌握好高壓滅菌時(shí)的溫度和時(shí)間。在制備全血瓊脂培養(yǎng)基時(shí)嚴(yán)格無菌操作，并在使用前要任取一平板放在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在無菌生長(zhǎng)的情況下才可使用。在整個(gè)試驗(yàn)過程中，要嚴(yán)格無菌操作，對(duì)所用各種試劑、培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和病料等均做好明確標(biāo)記，并保存好分離到的菌種，另外對(duì)不用的培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后才可清洗。

藥敏試驗(yàn)時(shí)，在培養(yǎng)基上涂布菌液一定要均勻，待平板表面稍干時(shí)，用鑷子取出藥敏片貼于涂有細(xì)菌的培養(yǎng)基表面，貼紙片時(shí)要輕輕按壓，以保證與培養(yǎng)基密切接觸，最后置于最適溫度下培養(yǎng)。在進(jìn)行動(dòng)物安全試驗(yàn)時(shí)要設(shè)置對(duì)照組，除注射的菌液不同外，其他條件都要保持一致，并且要隨時(shí)觀察小鼠的變化。一般疾病的潛伏期為7 d，可以持續(xù)觀察7 d，通過動(dòng)物安全試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)此菌的致病力。

5 防治措施

控制大腸桿菌病重在預(yù)防，主要從加強(qiáng)飼養(yǎng)管理著手。首先要做好環(huán)境衛(wèi)生和消毒工作。引進(jìn)鴨前提前對(duì)飼養(yǎng)場(chǎng)舍、飲食器械等進(jìn)行徹底的清掃、沖刷和消毒，平時(shí)做好通風(fēng)換氣和定期消毒工作，在經(jīng)常走動(dòng)和出入的道路和門口設(shè)消毒池，供給營(yíng)養(yǎng)全面的飼料，做到科學(xué)管理，規(guī)范飼養(yǎng)，及時(shí)淘汰病鴨、弱鴨，不斷改善飼養(yǎng)條件。當(dāng)出現(xiàn)集體發(fā)病癥狀時(shí)，及時(shí)救治。

在防治大腸桿菌病時(shí)，正確使用抗生素對(duì)改善我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)至關(guān)重要。通過做藥敏實(shí)驗(yàn)篩選高敏藥物是行之有效的方法之一，在此基礎(chǔ)上遵照藥物的配伍原則，選擇適當(dāng)?shù)乃幬锫?lián)合使用，將會(huì)取得更好的療效。該養(yǎng)殖場(chǎng)病例就聯(lián)合使用了頭孢他啶、硫酸阿米卡星和乳酸TMP三種藥物，不僅提高了藥物療效，達(dá)到了良好的治療效果，還降低了藥物的用量，減少了用藥后的不良反應(yīng)和毒副作用，另外也延緩了該大腸桿菌對(duì)這些藥物產(chǎn)生的耐藥性。

6 結(jié)語

該病例通過生化鑒定、血清型檢測(cè)、動(dòng)物安全試驗(yàn)，確定此分離菌為大腸桿菌，診斷為大腸桿菌性疾病。通過藥敏試驗(yàn)篩選高敏藥物，并在藥物配伍原則指導(dǎo)下選用藥物進(jìn)行臨床治療，取得理想的治療效果。養(yǎng)鴨戶在日常養(yǎng)殖過程中，應(yīng)注意采用科學(xué)的預(yù)防措施，才能避免該病帶來的損失。