李艾元，施心雨，岳萬(wàn)福，游衛(wèi)云

(浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院·動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 311300)

20世紀(jì)70年代，支架工程已成為組織工程領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[1],支架工程的核心是模擬天然的細(xì)胞外基質(zhì)[2]?；谏飳W(xué)、工程學(xué)、醫(yī)學(xué)等原理設(shè)計(jì)出的組織工程支架可以適應(yīng)不同組織的生物結(jié)構(gòu)要求[2]。將組織工程與三維細(xì)胞培養(yǎng)、靜電紡絲等技術(shù)相結(jié)合，使得支架材料可以滿(mǎn)足：作為細(xì)胞的外基質(zhì)使細(xì)胞增殖、分化[3-4]；不會(huì)與宿主發(fā)生免疫排斥反應(yīng)[5]；人為控制降解速度，以滿(mǎn)足新組織的生長(zhǎng)要求[6]；為細(xì)胞提供機(jī)械支撐，確保在植入前期給支架中的細(xì)胞提供必要的結(jié)構(gòu)支持[7]；具有可控的處理體系[8]，面對(duì)不同的組織能夠提供可變的結(jié)構(gòu)支撐。研發(fā)組織工程支架的目的是使受損組織可修復(fù)或者新生[9-10]。

與人工合成材料相比，絲素蛋白具有優(yōu)異的力學(xué)性能和生物相容性，可適應(yīng)不同組織的生長(zhǎng)速度，在支架工程領(lǐng)域煥發(fā)新的光芒[11]。絲素蛋白有3種結(jié)構(gòu)蛋白，包括絲素重鏈(2 390 ku)、輕鏈(226 ku) 和小糖蛋白P25(30 ku)[12]。絲素蛋白的重鏈具有兩親性，包含疏水塊和親水塊，其中疏水塊對(duì)絲素蛋白β折疊起重要作用[13]。然而與疏水區(qū)域相比，親水區(qū)域是一個(gè)較短且不重復(fù)的片段[14]，因此，絲素蛋白不能溶于水，但可被潛在的反應(yīng)側(cè)基修飾，如醇、酚、胺、羧基等[15]。這種改性可引起絲素蛋白親水性和孔隙度的變化，實(shí)現(xiàn)可控的絲素蛋白支架制備[16]。為此，本文擬采用二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)來(lái)誘導(dǎo)脫膠絲素蛋白(SF)形成水凝膠，研究了不同濃度DMPG對(duì)支架材料的生物相容性、SF水凝膠支架凝結(jié)速度等的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料和儀器

材料：蠶絲，工業(yè)級(jí)，杭州林然生物科技公司；DMPG，分析純，梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；F12培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、二甲基亞砜(DMSO)、雙抗、IV型膠原酶、CCK-8試劑盒、細(xì)胞篩，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；磷酸緩沖溶液(PBS)、溴化鋰(LiBr)、碳酸氫鈉、75%乙醇，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；山羊血清、馬血清、4%多聚甲醛、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)，杭州昊鑫生物科技股份有限公司；透析袋MD34，上海索橋生物科技有限公司；HE染色試劑盒，杭州浩克生物科技有限公司；中性樹(shù)膠，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)劑有限公司。

儀器：TI-S熒光倒置顯微鏡，日本尼康公司；synergyH1多功能酶標(biāo)儀、SU8010掃描電子顯微鏡，日本松下集團(tuán)；RM2255全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)，德國(guó)菜卡公司；BJYSL-DHG-9023A恒溫烘箱，蘇州華潔烘箱制造有限公司；HF90二氧化碳培養(yǎng)箱，力新儀器(上海)有限公司；Sorvall LYNX 6000離心機(jī)，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.2 樣品制備及性能表征

蠶絲的結(jié)晶度較高，普通的手段無(wú)法使其降解，且因其中含有的絲膠蛋白會(huì)引起免疫反應(yīng)，因此，不能直接用于制備組織工程支架，需先溶解蠶絲纖維得到絲素水溶液[17-18]。

1.2.1 蠶絲脫膠

參照文獻(xiàn)[19]的方法將蠶絲剪成2 cm長(zhǎng)度，按照1∶200的浴比加入至0.5%的碳酸氫鈉溶液中煮沸30 min，期間每隔15 min用玻璃棒翻1次；然后依次用去離子水洗脫3次，清洗6次，最后將脫膠的蠶絲放入烘箱，溫度設(shè)置為37 ℃，干燥12 h后得到絲素蛋白。

1.2.2 脫膠前后蠶絲形貌觀察

將脫膠前后的蠶絲分別用導(dǎo)電膠貼在工作臺(tái)，噴金處理 60 s。采用背散射模式、標(biāo)準(zhǔn)束流，通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察樣品形貌，加速電壓為 10 kV。然后將樣品的掃描電鏡照片導(dǎo)入 Nano Measurer 1.2軟件中，進(jìn)行直徑測(cè)量。

1.2.3 絲素蛋白的溶解

首先，用600 mL超純水溶解807.7 g無(wú)水溴化鋰(LiBr),然后用磁力攪拌器攪拌24 h，完全冷卻后加入超純水至1 000 mL，最后使用真空抽濾機(jī)抽濾至澄清，得到濃度為 9.3 mol/L的LiBr溶液。將制得的 LiBr 溶液放入60 ℃的烘箱中預(yù)熱 30 min，然后將絲素蛋白按照1∶4的溶質(zhì)比溶解在9.3 mol/L LiBr溶液中，放入 60 ℃烘箱中溶解2 h，期間每隔15 min 取出攪拌1次，制得絲素蛋白LiBr溶液。將制得的絲素LiBr溶液在透析袋(分子量3 200)中透析3 d，除去絲素LiBr溶液中的LiBr，然后用紗布過(guò)濾后，在低溫高速離心機(jī)上以7 000 r/min離心 20 min，保留上清液，用0.22 μm針頭濾器過(guò)濾上清液后，放入4 ℃冰箱備用。

1.2.4 絲素蛋白水凝膠的制備

首先，分別用去離子水配制5、10、15 mmol/L的DMPG溶液；然后，將絲素蛋白溶液、DMPG溶液振蕩混合均勻，其中絲素蛋白溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%；最后將共混溶液在25 ℃下培養(yǎng)形成水凝膠。

1.2.5 凝膠時(shí)間的測(cè)定

使用離心管傾斜法測(cè)定凝膠時(shí)間。將溶液按照不同的配比裝入1.5 mL的離心管中混合均勻。將離心管在25 ℃下培養(yǎng)，每隔30 s 傾斜1次，每次傾斜大概45°，若10 s內(nèi)管內(nèi)液體沒(méi)有沿管壁流動(dòng)則凝膠成功，計(jì)算開(kāi)始至凝膠成功的時(shí)間，取3次實(shí)驗(yàn)的平均值記為凝膠時(shí)間。

1.2.6 種子細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)

采用膠原酶消化法分離湖羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，具體操作步驟為：1)在無(wú)菌條件下剝離湖羊胎兒后肢腿部肌肉組織，然后用75%乙醇輕微浸泡消毒后立即用PBS沖洗2次，放入盛有PBS的35 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中；2)利用眼科剪將肌肉組織剪碎，加入適量Ⅳ型膠原酶后放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中消化15 min，每隔5 min取出吹打1次，共3次；3)消化結(jié)束后，加入2倍體積的DMEM/F12A培養(yǎng)基(DMEM/F12培養(yǎng)基+10%FBS) 終止消化，用細(xì)胞篩過(guò)濾并收集細(xì)胞懸液至15 mL 離心管中，用低速離心機(jī)(1 200 r/min)離心15 min，棄上清液；4)加入DMEM/F12B培養(yǎng)基(DMEM/F12培養(yǎng)基+10%FBS+ 1%雙抗)重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種至100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，得到的細(xì)胞為絲素水凝膠支架種子細(xì)胞，后續(xù)用于與支架一同注射入湖羊體內(nèi)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)，可將其作為種子細(xì)胞植入到水凝膠中。

1.2.7 SF水凝膠支架生物相容性的測(cè)定

將種子細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，參考文獻(xiàn)[18]方法測(cè)定DMPG濃度對(duì)SF水凝膠生物相容性的影響如見(jiàn)表1所示。具體步驟為：1)在無(wú)菌超凈臺(tái)上用75%乙醇浸洗SF水凝膠支架6 min，其次用PBS 反復(fù)浸洗5次，每次3 min，浸洗完成后加入F12培養(yǎng)基(不含胎牛血清)浸過(guò)水凝膠，在培養(yǎng)箱 (37 ℃、5%CO2) 中靜置24 h 后即可制得SF水凝膠浸提液；2)把生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的種子細(xì)胞接種在96 孔板中，在培養(yǎng)箱中(37 ℃、5%CO2)預(yù)培養(yǎng)24 h ，更換細(xì)胞培養(yǎng)液，然后加入10 μL預(yù)先制備好的SF支架浸提液，不加浸提液的為空白組；3)將96孔板在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～48 h，取出種子細(xì)胞96孔板，向其中的每個(gè)孔中加入110 μL CCK-8 工作液，將96孔板在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min 后取出，最后使用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)條件下測(cè)定各孔吸光度平均值，并通過(guò)對(duì)照組評(píng)定水凝膠的生物相容性(R)。

表1 細(xì)胞活力與生物相容性關(guān)系Tab.1 Relationship between cell proliferation rate and biocompatibility

式中：A、B、C分別為實(shí)驗(yàn)組、空白組和對(duì)照組的吸光度。

1.2.8 體內(nèi)肌肉再生實(shí)驗(yàn)

首先，用去離子水配制10 mmol/L的DMPG水溶液，放入4 ℃冰箱備用。將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的種子細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，放入離心管中備用。將絲素蛋白溶液、DMPG溶液、種子細(xì)胞懸液混合均勻，使得絲素蛋白溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，DMPG的濃度為10 mmol/L，種子細(xì)胞的密度為1×105個(gè)/mL，振蕩混合均勻后將共混溶液在25 ℃下培養(yǎng)3 min。

將要注射水凝膠的湖羊分為4組，分別是含種子細(xì)胞水凝膠組、不含種子細(xì)胞水凝膠組、單純種子細(xì)胞組和單純絲素蛋白溶液組；每組6只2月齡湖羊，公母各半，每只湖羊注射0.5 mL，做好標(biāo)記后歸欄飼養(yǎng)，正常飲食。

1.2.9 樣品的HE染色

將湖羊注射部位的皮膚層連同耳部肌肉層一同剪下，此時(shí)的水凝膠層在皮膚層和肌肉層之間，將取得的湖羊耳部樣品固定于4%多聚甲醛24 h以上。然后按照HE染色試劑盒的步驟進(jìn)行染色，將染色結(jié)果置于顯微鏡下觀察，進(jìn)行圖像采集分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果使用SPSS22.0軟件，并采用方差進(jìn)行單向分析(單向 ANOVA 測(cè)試)。差異結(jié)果使用P<0.05(*)、P<0.01(**)表示。

2 結(jié)果和討論

2.1 蠶絲脫膠分析

弱堿法(碳酸氫鈉)[20]處理的蠶絲，原理是利用絲膠蛋白和絲素蛋白溶解度的不同，除去蠶絲中的絲膠蛋白。蠶絲脫膠前后掃描電鏡照片如圖1所示。可以看出：未脫膠蠶絲(見(jiàn)圖1(a))本身整體呈圓柱形，表面光滑，直徑為7.67～11.4 μm；脫膠處理(見(jiàn)圖1(b))后，蠶絲的直徑為6.36～11.7 μm。脫膠前的蠶絲粗細(xì)差別較小，表面規(guī)整光滑，脫膠后蠶絲由于失去了絲膠蛋白，蠶絲粗細(xì)差別增加，表面粗糙扁平。根據(jù)文獻(xiàn)[21]報(bào)道，絲膠蛋白的存在會(huì)導(dǎo)致免疫原性，通過(guò)脫去絲膠蛋白制成的支架沒(méi)有免疫原性，因此，除去絲膠蛋白是實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的重要前提。

圖1 脫膠前后蠶絲的SEM照片(×1 000)Fig.1 SEM images of silk before(a)and after(b)degumming(×1 000)

2.2 水凝膠支架凝結(jié)時(shí)間分析

DMPG濃度對(duì)SF水凝膠凝結(jié)時(shí)間的影響結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯?，隨著DMPG濃度的增加，SF的凝膠時(shí)間逐漸變短，凝膠速率逐漸加快。在3個(gè)濃度的實(shí)驗(yàn)中，DMPG濃度為15 mmoL/L時(shí)可使凝膠時(shí)間縮短至10 min，這是因?yàn)殡S著DMPG濃度的提高，DMPG中的磷脂和SF鏈之間發(fā)生靜電和疏水作用，導(dǎo)致SF鏈由無(wú)序的α螺旋向β折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，且該轉(zhuǎn)變是一個(gè)不可逆過(guò)程，因此，SF凝膠快速形成。綜上分析可知，可通過(guò)改變DMPG濃度來(lái)控制凝膠時(shí)間。

圖2 DMPG濃度對(duì)SF水凝膠凝膠時(shí)間的影響Fig.2 Effect of DMPG concentration on SF gel of gel time

2.3 水凝膠體外生物相容性分析

圖3示出不同DMPG濃度的水凝膠支架浸出液對(duì)種子細(xì)胞活力的影響?？梢钥闯觯篋MPG濃度為10 mmol/L時(shí)，制備的水凝膠生物相容性最好；當(dāng)DMPG濃度為15 mmol/L時(shí)雖然凝膠速度最快，但其生物相容性最差。所有加入浸提液的實(shí)驗(yàn)組與空白組相比，細(xì)胞活力沒(méi)有降低，說(shuō)明該水凝膠支架沒(méi)有細(xì)胞毒性，DMPG處理過(guò)的實(shí)驗(yàn)組具有優(yōu)異的生物相容性和生物安全性，同時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。

圖3 不同濃度DMPG水凝膠支架的細(xì)胞活力Fig.3 Cytotoxicity of hydrogel scaffolds with DMPG different molar concentrations

2.4 水凝膠體內(nèi)生物相容性分析

圖4示出不同天數(shù)樣品水凝膠層的HE染色結(jié)果。可以看出：在水凝膠植入24 h后，在SF水凝膠的保護(hù)下，其中的種子細(xì)胞(見(jiàn)圖4(a) 中黑色圓圈部分)開(kāi)始增殖分化，通過(guò)水凝膠介質(zhì)與湖羊進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換、氣體交換和新陳代謝廢物的排出；隨著植入天數(shù)的增加，水凝膠中的種子細(xì)胞(見(jiàn)圖4(b) 中黑色圓圈部分)退出增殖周期，水凝膠中的細(xì)胞分化為肌肉組織，直到水凝膠中的細(xì)胞(見(jiàn)圖4(c) 中黑色圓圈部分)完全分化為肌肉組織。圖4(c) 與圖4(b)相比，水凝膠中的肌原纖維進(jìn)一步生長(zhǎng)，具體表現(xiàn)為長(zhǎng)度的延伸，這是因?yàn)樗z可召集體內(nèi)的成肌細(xì)胞繼續(xù)增殖分化，直至水凝膠中的肌肉組織(見(jiàn)圖4(c)中黑色圓圈部分)與正常的肌肉組織HE染色(見(jiàn)圖4(c)中白色圓圈部分)差異逐漸消失。從以上結(jié)果可以得出：DMPG誘導(dǎo)的SF水凝膠成功地模擬了天然細(xì)胞外基質(zhì)，且沒(méi)有引起湖羊的免疫排斥。結(jié)合圖5展示的結(jié)果進(jìn)一步分析表明，水凝膠成功在湖羊皮膚層和肌肉層的空隙中凝結(jié)，形成了一層水凝膠，單一加入絲素蛋白或者細(xì)胞懸浮液均不會(huì)對(duì)湖羊產(chǎn)生任何影響。綜上得出，DMPG誘導(dǎo)的SF水凝膠必須加入種子細(xì)胞才可以進(jìn)行組織再生和修復(fù)，否則支架會(huì)在體內(nèi)進(jìn)行降解，而不會(huì)有新的組織生成。

圖4 不同天數(shù)樣品水凝膠層HE染色結(jié)果(×200)Fig.4 HE staining results of hydrogel layers for samples of different days(×200)

圖5 不同天數(shù)水凝膠層的寬度Fig.5 Width of hydrogel layers in different days

2.5 水凝膠支架降解分析

圖6示出植入湖羊耳部水凝膠降解的HE染色圖片。由圖6(a)可看出，水凝膠包裹的肌肉細(xì)胞進(jìn)行增殖分化，水凝膠表面逐漸開(kāi)始降解，形成大小不一的孔隙，肌肉細(xì)胞通過(guò)這些孔隙可和湖羊進(jìn)行物質(zhì)交換(見(jiàn)圖6(b))，保證充足的供給，當(dāng)肌肉生長(zhǎng)到一定程度后，已經(jīng)能夠自發(fā)地從湖羊耳部獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(見(jiàn)圖6(c))，便不再需要SF水凝膠支架的存在。由于種子細(xì)胞來(lái)自湖羊，而且SF水凝膠支架本身不會(huì)引起免疫反應(yīng)，因此，才可以成功地長(zhǎng)出新生肌肉。通過(guò)上面的結(jié)果不難看出：DMPG誘導(dǎo)的SF水凝膠支架是一種綠色可降解的組織工程支架。

圖6 不同天數(shù)水凝膠支架HE染色結(jié)果Fig.6 HE staining results of hydrogel scaffolds in different days

3 結(jié) 論

本文制備了一種可控的、無(wú)免疫原性的絲素(SF)蛋白水凝膠，通過(guò)改變SF溶液中二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)的濃度，探討并分析其對(duì)水凝膠凝膠時(shí)間、生物相容性和免疫原性的影響，得出如下主要結(jié)論：1)弱堿法可以去除絲膠蛋白，脫膠前后蠶絲直徑變化約為 0.3 μm；2)DMPG加速了SF水凝膠的快速形成，只需要10 min就可使SF成功凝膠；3)水凝膠注射后最終在湖羊耳部皮下和軟骨之間形成0.5 cm的水凝膠-肌肉復(fù)合體；4)DMPG誘導(dǎo)的SF水凝膠具有優(yōu)異的生物相容性，是一種綠色可降解，無(wú)免疫原性的組織工程支架。

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