蘇秀麗 梁惠凌 劉寶玉 黃夕洋 唐輝

摘要： 旨在揭示黃花倒水蓮資源的遺傳多樣性，分析其遺傳差異，為黃花倒水蓮的良種選育提供理論基礎(chǔ)。以荷包山桂花居群為外類群，利用簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增（Inter simple sequence repeat， ISSR）分子標(biāo)記對來源于10個(gè)地區(qū)的黃花倒水蓮自然居群進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析。結(jié)果顯示，用11條引物共擴(kuò)增得到132條條帶，其中91條為多態(tài)性條帶（PPB），多態(tài)性條帶比例為68.94%。在物種水平上，黃花倒水蓮10個(gè)居群的Nei’s基因多樣性指數(shù)（ H ）、Shannon多樣性指數(shù)（ I ）分別為0.163 7 、0.250 1 ，表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性，而在居群水平上， H 、 ?I 的均值分別為0.063 4 、0.098 8 ，表現(xiàn)出偏低的遺傳多樣性。Nei’s遺傳多樣性和分子方差分析（AMOVA）結(jié)果表明，黃花倒水蓮的遺傳變異主要發(fā)生在居群間，遺傳分化程度較高（基因分化系數(shù)= 0.610 9 ，基因流= 0.318 5 ）。遺傳一致度及聚類分析結(jié)果顯示，黃花倒水蓮各居群間的親緣關(guān)系較近（遺傳距離為0.032～ 0.182），與荷包山桂花居群的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（遺傳距離為0.428～ 0.536），在遺傳一致度為0.630處可以將黃花倒水蓮與荷包山桂花區(qū)分開，在遺傳一致度為0.867處可以將10個(gè)黃花倒水蓮居群分為3類。由于黃花倒水蓮居群水平上的遺傳多樣性水平較低，今后應(yīng)對黃花倒水蓮野生資源進(jìn)行合理利用與保護(hù)。

關(guān)鍵詞： 黃花倒水蓮; 簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增（ISSR）分子標(biāo)記; 遺傳多樣性分析; 遺傳分化

中圖分類號： S567.23+9?? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A?? 文章編號： 1000-4440（2022）03-0605-06

Genetic diversity analysis of ?Polygala fallax ?based on ISSR molecular markers

SU Xiu-li 1，2，3 ， LIANG Hui-ling 1，2 ， LIU Bao-yu 1，2 ， HUANG Xi-yang 1，2 ， TANG Hui 1，2

（1.Guangxi Institute of Botany， Guangxi Zhuang Autonomous Region and Chinese Academy of Sciences， Guilin 541006， China; 2.Guangxi Key Laboratory of Functional Phytochemicals Research and Utilization， Guilin 541006， China; 3.Key Laboratory of Ecology of Rare and Endangered Species and Environmental Protection， Ministry of Education， Guangxi Normal University， Guilin 541006， China）

Abstract： The aim of this study is to reveal the genetic diversity of ?Polygala fallax ?Hemsl germplasm resources， and analyze their genetic differences， so as to provide theoretical basis for the selection and breeding of ?Polygala fallax ?Hemsl germplasm resources. Taking ?Polygala arillata ?Buch as the outer group， the inter-simple sequence repeat （ISSR） molecular markers were used to explore the genetic diversity and genetic relationship of natural populations of ?Polygala fallax ?Hemsl from ten regions. The results showed that a total of 132 bands were amplified with 11 primers， including 91 polymorphic bands （PPB）， and the proportion of PPB was 68.94%. At the species level， Nei’s gene diversity index （ H ） and Shannon’s diversity index （ I ） were 0.163 7 ?and 0.250 1 ， respectively， showing high genetic diversity. At the population level， the mean values of ?H ?and ?I ?were 0.063 4 ?and 0.098 8 ， respectively， showing low genetic diversity. The results of Nei’s genetic diversity and molecular variance analysis （AMOVA） showed that the genetic variation was mainly distributed among populations， with a large level of genetic differentiation （gene differentiation coefficient was0.610 9 ， gene flow was 0.318 5 ）. The genetic identity and clustering results indicated that the genetic relationship between the populations of ?Polygala fallax ?Hemsl was relatively close （genetic distance was 0.032- 0.182）， and the genetic relationship with ?Polygala arillata ?Buch was relatively far （genetic distance was 0.428- 0.536）. At the level of genetic identity of 0.630， ?Polygala fallax ?Hemsl and ?Polygala arillata ?Buch （YN） could be separated. Ten populations of ?Polygala fallax ?Hemsl could be divided into three types at 0.867. In view of the relatively low level of genetic diversity in the population of ?Polygala fallax ?Hemsl， the wild resources should be rationally utilized and protected in the future.

Key words： ?Polygala fallax ?Hemsl; inter-simple sequence repeat （ISSR） molecular markers; genetic diversity; genetic differentiation

黃花倒水蓮（ Polygala fallax ?Hemsl）別稱黃花遠(yuǎn)志，是遠(yuǎn)志屬（ Polygala ）的多年生植物，同時(shí)還是中國的特有物種，主要分布于中國南部地區(qū)，常見于海拔360～1 650 m的山坡林木下或者溝谷叢林邊 [1] 。黃花倒水蓮還是一些少數(shù)民族的常用藥材，又稱為結(jié)端旁 [2-3] ，其性平、味甘，通?？梢杂脕硌a(bǔ)氣血、祛濕、強(qiáng)筋骨等 [4-5] ，還具有調(diào)脂、抗凝血、抗衰老、保肝等作用 [6-7] ，在民間有悠久的藥用歷史。荷包山桂花（ Polygala arillata ?Buch）與黃花倒水蓮?fù)瑸檫h(yuǎn)志屬荷包山桂花組植物，云南當(dāng)?shù)厝藢⑵浞Q為雞根，其花、葉片、果實(shí)形態(tài)及功用都與黃花倒水蓮極為相似，因此民間常有人將這2種植物混淆 [3] 。

近年來，由于黃花倒水蓮具有藥食兩用特性而逐漸為大眾熟知，導(dǎo)致其野生資源逐漸減少，而荒地開采等活動對黃花倒水蓮所在的原始生態(tài)環(huán)境造成一定影響，原始生態(tài)環(huán)境的改變可能會使物種的遺傳多樣性程度降低。分子標(biāo)記克服了隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）等分子標(biāo)記的缺點(diǎn)，已被成功應(yīng)用于遠(yuǎn)志 [8] 、西伯利亞遠(yuǎn)志 [9] 的遺傳多樣性分析中。目前尚未見有關(guān)黃花倒水蓮遺傳多樣性的研究報(bào)道，因此本研究利用簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增（ISSR）技術(shù)，以荷包山桂花作為外類群，對來自10個(gè)地區(qū)的黃花倒水蓮居群進(jìn)行遺傳背景差異分析，旨在從分子水平揭示不同地區(qū)野生黃花倒水蓮的親緣關(guān)系，為黃花倒水蓮的資源保護(hù)和之后的合理應(yīng)用提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物來源見表1，共有166份樣品，其中黃花倒水蓮來自10個(gè)野生居群，荷包山桂花來自云南栽培居群。選取生長健康的植株并采集其幼嫩葉片，置于硅膠袋中干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取及檢測 用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法 [10] 提取植物干燥葉片總DNA，用Thermo Nano Drop TM /ND-2000C檢測其濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度，并稀釋至50 ng/μl 后于-20 ℃ 保存。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Bio-Rad PCR儀上進(jìn)行，20 μl反應(yīng)體系包括50 ng DNA模板、10 μl 2× Master Mix、10 μmol/L ?ISSR引物，用ddH2 O補(bǔ)足體積。PCR擴(kuò)增程序具體如下：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，50 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，45個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，于140 V電泳50 min后經(jīng)溴化乙錠（EB）染色，再置于UVP EC 310紫外凝膠成像儀中拍照保存后進(jìn)行條帶統(tǒng)計(jì)與分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠電泳中移動速度的差異，對不同電泳條帶采用0/1賦值法構(gòu)建表型數(shù)據(jù)矩陣，統(tǒng)計(jì)各引物總條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)，計(jì)算多態(tài)性條帶（PPB）比例。用Popgen32 [11] 軟件計(jì)算如下遺傳參數(shù)：等位基因數(shù)（ N a ）、多態(tài)性位點(diǎn)（PPL）比例、有效等位基因數(shù)（ N e ）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（ H ）、居群總遺傳多樣性指數(shù)（ H t ）、Shannon 多樣性指數(shù)（ I ）、居群內(nèi)遺傳多樣性指數(shù)（ H s ）、基因流（ N m ）和基因分化系數(shù)（ G st ）。用GenAlEx 6.5軟件計(jì)算遺傳一致度、遺傳距離，進(jìn)行分子方差分析（AMOVA），用NTSYSpc軟件構(gòu)建非加權(quán)組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means， UPGMA）聚類圖 [12-13] 。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的多態(tài)性分析

根據(jù)電泳結(jié)果，從50條引物中挑選出11條條帶較清晰、可重復(fù)的引物，其擴(kuò)增結(jié)果見表2。用篩選出的引物對166個(gè)DNA樣本進(jìn)行PCR，共獲得132條清晰可見的條帶，其中91條條帶具有多態(tài)性，平均多態(tài)性條帶（PPB）比例為68.94%，每條引物平均擴(kuò)增出的條帶數(shù)為12條，多態(tài)性條帶數(shù)為4～ 15條。除了引物UBC899的多態(tài)性條帶比例為40.00%外，其他引物均具有較高的多態(tài)性條帶比例，為54.55%～ 100.00%，圖1為用引物UBC808擴(kuò)增到的電泳條帶。

2.2 遺傳多樣性分析

如表3所示，在物種水平上，黃花倒水蓮10個(gè)居群的等位基因數(shù)（ N a ）為1.590 9 ，有效等位基因數(shù)（ N e ）為1.278 9 ，多態(tài)性位點(diǎn)（PPL）比例為59.09%，Nei’s基因多樣性指數(shù)（ H ）為0.163 7 ，Shannon多樣性指數(shù)（ I ）為0.250 1 。

由表3還可以看出，在居群水平上，等位基因數(shù)（ N a ）為1.113 6～ 1.325 8 ，均值為1.225 8 ;有效等位基因數(shù)（ N e ）為1.055 3～ 1.140 6 ，均值為1.101 6 ; 多態(tài)性位點(diǎn)（PPL）比例為11.36%～ 32.58%，均值為22.58%;Nei’s基因多樣性指數(shù)（ H ）為0.033 9～ 0.084 4 ，均值為0.063 4 ;Shannon多樣性指數(shù)（ I ）為0.052 2～ 0.132 9 ，均值為0.098 8 。在10個(gè)黃花倒水蓮居群中，湖南居群（HN）的變異程度最大（等位基因數(shù)為1.325 8 ，有效等位基因數(shù)為1.125 3 ，Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.082 8 ，Shannon多樣性指數(shù)為0.132 9 ，多態(tài)性位點(diǎn)比例為32.58%），靖西居群（JX）的變異程度最小（等位基因數(shù)為1.113 6 ，有效等位基因數(shù)為1.055 3 ，Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.033 9 ，Shannon多樣性指數(shù)為0.052 2 ，多態(tài)性位點(diǎn)比例為11.36%）。

2.3 居群遺傳分化分析

根據(jù)Popgen32的計(jì)算結(jié)果，黃花倒水蓮居群總遺傳多樣性指數(shù)（ H t ）= 0.162 8 （標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.037 6 ），居群內(nèi)遺傳多樣性指數(shù)（ H s ）= 0.063 3 （標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.006 4 ），基因分化系數(shù)（ G st ）= 0.610 9 ，基因流（ N m ）=0.318 5 ，說明有61.09%的遺傳變異出現(xiàn)在居群間，有38.91%的遺傳變異出現(xiàn)在居群內(nèi)。分子方差分析（AMOVA）結(jié)果與上述Popgen計(jì)算結(jié)果一致?？傔z傳變異結(jié)果顯示，有56%的變異發(fā)生在居群之間，44%的變異發(fā)生在居群內(nèi)部，這與Nei’s基因多樣性結(jié)果一致，表明各居群間表現(xiàn)出較高的遺傳分化水平。

2.4 親緣關(guān)系及聚類結(jié)果分析

如表4所示，11個(gè)居群的遺傳一致度為0.585～ 0.968，均值為0.836;遺傳距離為0.032～ 0.536，均值為0.187。黃花倒水蓮居群的遺傳一致度為0.833～ 0.968，均值為0.882;遺傳距離為0.032～ 0.182，均值為0.126。黃花倒水蓮居群中灌陽居群（GY）與恭城居群（GC）間具有最高的遺傳一致度（0.968），且遺傳距離最?。?.032），而靈川居群（LC）與靖西居群（JX）具有最低的遺傳一致度（0.833），遺傳距離最大（0.182）。荷包山桂花與黃花倒水蓮居群間的遺傳一致度為0.585～ 0.652，均值為0.630，遺傳距離為0.428～ 0.536，均值為0.462，表明黃花倒水蓮、荷包山桂花2個(gè)物種之間在遺傳上有明顯差異。

用NTSYSpc軟件基于遺傳一致度構(gòu)建UPGMA聚類圖。由圖2可以看出，在遺傳一致度為0.630處可以將黃花倒水蓮居群與荷包山桂花居群（YN）區(qū)分開。在黃花倒水蓮居群中，恭城居群（GC）與灌陽居群（GY）最先聚在一起，具有最高的遺傳一致度;此外，具有較高遺傳一致度的還有蒙山居群（MS）與靖西居群（JX）。在遺傳一致度為0.867處可將10個(gè)地理來源不同的黃花倒水蓮居群分為3個(gè)類群，第Ⅰ類群是柳州融水居群（RS）和廣東羅定居群（GD）;第Ⅱ類群包括5個(gè)地方的居群，分別為桂林荔浦居群（LP）、崇左天等居群（TD）、百色靖西居群（JX）、梧州蒙山居群（MS）以及湖南永州居群（HN）;第Ⅲ類群包括靈川居群（LC）、桂林恭城居群（GC）及桂林灌陽居群（GY）。廣西桂林地區(qū)的居群大部分聚集在第Ⅲ類群，只有桂林荔浦居群（LP）聚集在第Ⅱ類群，與其他來自桂林的居群間的距離較遠(yuǎn)。

3 討 論

遺傳多樣性是物種對環(huán)境適應(yīng)度的反映，遺傳多樣性程度越高，代表物種在復(fù)雜環(huán)境中生存的概率就越大 [14] 。分布范圍廣的物種通常趨向于具有較高的遺傳多樣性，分布范圍窄的物種則具有較低的遺傳多樣性 [15] 。一般可用Nei’s基因多樣性指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)來評價(jià)物種的遺傳多樣性水平 [16-17] 。本研究利用11條引物對10個(gè)黃花倒水蓮自然居群、1個(gè)荷包山桂花居群的共166個(gè)個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共得到132條電泳條帶，其中多態(tài)性條帶有91條，多態(tài)性條帶占比為68.94%。通過對遺傳多樣性指數(shù)進(jìn)行計(jì)算發(fā)現(xiàn)，黃花倒水蓮10個(gè)居群的Nei’s基因多樣性指數(shù)的平均值為0.063 4 ，遠(yuǎn)低于同屬植物西伯利亞遠(yuǎn)志（ H = 0.265 6 ） [9] 和Nybom [18] ?統(tǒng)計(jì)的種群遺傳多樣性平均值（0.22），表明黃花倒水蓮居群間的遺傳多樣性水平較低。但在物種水平上，黃花倒水蓮還保持著較高的遺傳多樣性（ H=? 0.163 7 ， I=? 0.250 1 ），在居群水平上的遺傳多樣性低而在物種水平上的遺傳多樣性高的現(xiàn)象也出現(xiàn)在懸鉤子屬植物中 [13，19] 。由此可以推測，黃花倒水蓮的祖先具有較為豐富的遺傳多樣性，但是隨著人類活動愈加頻繁，如經(jīng)常采挖黃花倒水蓮、開荒修路等，其種群個(gè)體數(shù)量、分布范圍逐漸下降，使得物種保留著較高的遺傳多樣性，而居群間則保留著較低的遺傳多樣性。

Nei’s遺傳多樣性分析結(jié)果（ G st = 0.610 9 ）表明，黃花倒水蓮有61.09%的遺傳變異存在于居群間，有38.91%的遺傳變異則在居群內(nèi)部發(fā)生，該結(jié)果要高于Nybom [18] 統(tǒng)計(jì)得出的基于簡單重復(fù)序列標(biāo)記（ISSR分子標(biāo)記）的遺傳分化水平（ G st = 0.34），同時(shí)也高于基于山西西伯利亞遠(yuǎn)志研究得出的遺傳分化水平（ G st = 0.526 0 ） [9] ，說明黃花倒水蓮的遺傳變異主要來自居群間，且遺傳分化水平高。研究發(fā)現(xiàn)，基因流對種群遺傳變異及居群分化的發(fā)生具有重要意義，當(dāng) N m ?> 1時(shí)，可以抑制各物種遺傳漂變和居群間分化的作用，當(dāng) N m ?< 1時(shí)，則容易引起各物種遺傳漂變和居群間的遺傳分化 [20-21] 。而在本研究中，黃花倒水蓮居群的 N m = 0.318 5< 1.000 0 ，表明在黃花倒水蓮居群間出現(xiàn)了明顯的遺傳分化，這可能與黃花倒水蓮的繁殖方式、生活環(huán)境有關(guān)。野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，黃花倒水蓮有種子繁殖、根蘗繁殖2種方式，種子成熟后掉落在親本植株周圍，但周圍環(huán)境較為潮濕，種子極易發(fā)霉，大大影響了種子質(zhì)量，因此其種子繁殖能力較低 [22-23] 。黃花倒水蓮生長的區(qū)域較為狹窄，主要生長在溝谷叢林邊且分布較為零散，因此其后代向外擴(kuò)散的能力有限。此外，當(dāng)?shù)鼐用襁^度采挖黃花倒水蓮野生資源，造成其生境破碎，居群的規(guī)模逐漸縮小 [24] ，在上述綜合影響下形成了居群間基因流減弱的現(xiàn)象。

綜上所述，黃花倒水蓮野生居群在居群水平上表現(xiàn)出偏低的遺傳多樣性，因此在對其合理利用的同時(shí)也要進(jìn)行保護(hù)，首先要重點(diǎn)保護(hù)的是黃花倒水蓮種質(zhì)的遺傳多樣性。本研究結(jié)果表明，湖南永州居群（HN）、桂林靈川居群（LC）、桂林恭城居群（GC）、梧州蒙山居群（MS）4個(gè)居群具有相對較高的Nei’s遺傳多樣性，因此應(yīng)將這4個(gè)居群優(yōu)先保護(hù)，同時(shí)也要保護(hù)其他居群的遺傳多樣性。

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（責(zé)任編輯：徐 艷）

收稿日期：2021-10-13

基金項(xiàng)目：廣西科技重大專項(xiàng)（桂科AA18118015）;桂林市重大專項(xiàng)（20190101）;桂林市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（20190208-3）;廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（ZRJJ2018-7、ZRJJ2020-5）

作者簡介：蘇秀麗（1996-），女，廣西貴港人，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。（E-mail）1808891670@qq.com

通訊作者：黃夕洋，（E-mail）57643787@qq.com;唐 輝，（E-mail）913529761@qq.com